CN111218435A

CN111218435A - 一种黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶和苦茶生物碱theacrine的制备方法

Info

Publication number: CN111218435A
Application number: CN202010071826.2A
Authority: CN
Inventors: 何蓉蓉; 胡丹; 张志民; 张月虹; 段文君; 龚海标; 李怡芳; 栗原博
Original assignee: Jinan University
Current assignee: Jinan University
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2020-06-02
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111218435B

Abstract

本发明属于药物合成技术领域，尤其涉及一种黄嘌呤生物碱9‑N‑甲基转移酶和苦茶生物碱theacrine的制备方法。本发明提供了一种重组蛋白，实验结果表明，本发明重组蛋白具有黄嘌呤生物碱9‑N‑甲基转移酶活性，能够以1,3,7‑三甲基尿酸为底物，作为黄嘌呤生物碱9‑N‑甲基转移酶对1,3,7‑三甲基尿酸进行9‑N‑甲基化酶促反应，生物合成得到theacrine，并且，氨基酸序列如SEQ ID No：3所示的重组蛋白作为黄嘌呤生物碱9‑N‑甲基转移酶的活性非常高。

Description

一种黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶和苦茶生物碱theacrine 的制备方法

技术领域

本发明属于药物合成技术领域，尤其涉及一种黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶和苦茶生物碱theacrine的制备方法。

背景技术

甲基黄嘌呤类化合物在临床上被广泛应用。可可碱、茶碱和咖啡因在化学结构上的区别仅在于嘌呤母核上甲基取代基的个数和位置的不同，但这种微小的差别却导致了它们在中枢兴奋、心脏兴奋和松弛平滑肌等方面的生理活性不同，进而导致这三种药物的临床应用的截然不同。theacrine是咖啡因的8位氧化和9位甲基化产物，它们具有类似的结构，然而，theacrine却显示出与咖啡因中枢兴奋相反的作用。另外，研究报道了theacrine具有多种显著生物活性，如，可能通过影响脑内去甲肾上腺素等单胺类神经递质发挥抗抑郁作用；通过抗炎和抗氧化能力或通过线粒体去乙酰化酶SirT3促进肝脏脂肪酸氧化来减轻肝损伤或保护脂肪肝；通过腺苷受体拮抗增加运动活性以及通过调节脑中葡萄糖代谢和抑制磷酸二酯酶活性来改善学习和记忆能力等。所以，theacrine有望发展为临床药物,。

但是因为资源问题限制了theacrine开发利用的进度。在咖啡因基础上进一步合成 theacrine的技术难度较大，因此如何从生物合成途径获得theacrine成为本领域技术人员亟待解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶和苦茶生物碱theacrine的制备方法，该黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶可对1,3,7-三甲基尿酸进行9-N-甲基化生物合成theacrine。

本发明的具体技术方案如下：

本发明提供了一种重组蛋白，具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No：1、SEQ ID No：2或SEQ ID No：3所示的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(Ⅲ)、如(Ⅰ)所述的氨基酸序列的修饰变体，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；或

(Ⅴ)与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(III)所述氨基酸序列至少有80％、85％、90％、92％、95％、97％、 98％或99％同源性的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。

本发明还提供了编码上述技术方案所述重组蛋白的核苷酸，具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ) 的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(Ⅳ)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸序列获得的核苷酸序列，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(V)、如(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)或(Ⅳ)所述的核苷酸序列的修饰变体，且与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所述的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(VI)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(V)所述的核苷酸序列至少有80％、85％、90％、92％、 95％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列。

优选的，所述核苷酸序列选自SEQ ID No：5、SEQ ID No：6或SEQ ID No：7。

本发明还提供了一种表达载体，包括上述技术方案所述的核苷酸以及待转化载体。

本发明还提供了一种重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

构建上述技术方案所述的表达载体，将所述表达载体导入宿主细胞中，诱导表达，再通过分离纯化获得所述重组蛋白。

本发明中，表达载体可为pET28b_NhisMBP-V质粒或pRSF-Duet2质粒，宿主细胞可为E.coli BL21(DE3)，可通过Ni-NTA亲和层析进行重组蛋白分离，通过阴离子交换柱和分子筛Superdex G200柱进行重组蛋白纯化。

本发明还提供了所述重组蛋白作为黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶的应用。

本发明还提供了一种theacrine的制备方法，包括以下步骤：

将1,3,7-三甲基尿酸和甲基供体在上述技术方案所述重组蛋白的催化下进行酶促反应，得到theacrine。

优选的，所述甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸；

所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

优选的，所述酶促反应的pH值为6.5～7。

优选的，所述酶促反应的温度为30℃～37℃。

综上所述，本发明提供了一种重组蛋白，实验结果表明，本发明重组蛋白具有黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶活性，能够以1,3,7-三甲基尿酸为底物，作为黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶对1,3,7-三甲基尿酸进行9-N-甲基化酶促反应，生物合成得到theacrine，并且，氨基酸序列如SEQ ID No：3所示的重组蛋白作为黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶的活性非常高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中KCS1～KCS3重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中异源表达的结果图，(A)KCS1重组蛋白，(B)KCS2重组蛋白，(C)KCS3重组蛋白；

图2为本发明实施例2中KCS1、KCS2和KCS3重组蛋白与1,3,7-三甲基尿酸进行酶促反应的结果，其中，图2(a)KCS1重组蛋白，图2(b)KCS2重组蛋白，图2(c)KCS3 重组蛋白，(i)混合标准品，compound 1：黄嘌呤核苷，compound 2：7-甲基黄嘌呤，compound 3：可可碱，compound 4：咖啡因，compound 5：1,3,7-三甲基尿酸，compound 6：theacrine； (ii)被灭活的KCS1、KCS2和KCS3重组蛋白分别与1,3,7-三甲基尿酸反应的结果；(iii) KCS1、KCS2和KCS3重组蛋白分别与1,3,7-三甲基尿酸反应的结果；

图3为本发明实施例3在不同辅因子、pH和温度下KCS3重组蛋白的9-N-甲基转移活性图，其中，(A)辅因子，(B)pH，(C)温度；

图4为本发明实施例3中1,3,7-三甲基尿酸作为底物的KCS1重组蛋白、KCS2重组蛋白和KCS3重组蛋白的酶动力学曲线图，其中，(A)KCS1重组蛋白，(B)KCS2重组蛋白，(C)KCS3重组蛋白；

图5为本发明实施例4中KCS1～KCS3重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中异源表达的结果图；

图6为本发明实施例5中KCS3重组蛋白的整体结构，其中，(A)KCS3的结构域示意图，(B)KCS2重组蛋白结构，(C)KCS3单体结构(浅蓝色)与Coffee canephora的咖啡因合成酶结构(灰色)对比，(D)KCS3二聚体结构，N端结构域和催化结构域的颜色与(A)一致，SAH和theacrine用棍棒模型表示；

图7为本发明实施例5中KCS3结构中小分子结合示意图；(A)KCS3的单体结构； (B)SAH和theacrine的2Fo-Fc密度图；(C)theacrine与KCS3的氢键相互作用，氢键用黑色虚线表示；(D)图9theacrine与KCS3上残基的π-π-π堆积作用；

图8为本发明实施例5中KCS3重组蛋白、KCS3-W161F突变体和KCS3-F322A突变体的活性图；

图9为本发明实施例5中KCS1、KCS2和KCS3的氨基酸序列比对图，

表示SAH 结合口袋位置的氨基酸；

表示1,3,7-三甲基尿酸结合口袋位置的氨基酸；

表示与底物产生氢键相互作用的氨基酸；

表示与底物产生π-π-π堆积作用的氨基酸；

和

表示结合口袋处序列比对存在差异的氨基酸；

图10为本发明实施例5中KCS2突变体重组蛋白的9-N-甲基转移活性转化率测试结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种蛋白及其制备方法和蛋白作为N-甲基转移酶的应用，该蛋白可作为 9-N-甲基转移酶对1,3,7-三甲基尿酸进行9-N-甲基化生物合成theacrine。

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

需要说明的是，序列表中n代表a、t、c、g或空位。

具体实施例中，所用实验材料如下：

1.实验仪器

2.实验试剂

实验用核苷酸引物由广州擎科生物技术有限公司合成，重组质粒测序分别由广州擎科和生工生物工程有限公司完成。

3.实验培养基

LB培养基

上述原料加dH₂O定容至1L，用2.5M NaOH调pH至7.0，121℃灭菌30min，即得 LB培养基。

SOC培养基

上述原料加dH₂O定容至100mL，用2.5M NaOH调pH至7.0，121℃灭菌30min，即得SOC培养基，配好后分装，放于-20℃冰箱中保存。

4.实验溶液

1)50×TAE Buffer(1L)：37.2g Na₂EDTA·2H₂O、242g Tris Base和57.1mL冰醋酸，调节pH8.5，加dH₂O定容至1L。

2)1×PBS(1L)：8g NaCl、0.2g KCl、1.42g Na₂HPO₄和0.27g KH₂PO₄，调节 pH至7.4，加dH₂O定容至1L。

3)5×蛋白电泳缓冲液(1L)：94g甘氨酸、15.1g Tris base和5g SDS，加dH₂O 定容至1L。

4)考马斯亮蓝染色液(1L)：、400mL甲醇、100mL冰醋酸和1.0g考马斯亮蓝 R-250加水定容至1L。

5)考马斯亮蓝脱色液(1L)：100mL甲醇，100mL冰醋酸和加水定容至1L。

抗生素及蛋白诱导剂

Buffer A缓冲液

Buffer B缓冲液

Buffer C缓冲液

实施例1

本实施例进行重组N-甲基转移酶的质粒构建与异源表达，表达的重组N-甲基转移酶用于酶活性的测试，包括如下步骤：

1、重组蛋白表达质粒的构建

1)对KCS1～KCS3 DNA进行PCR扩增反应，其中，KCS1～KCS3 DNA的核苷酸序列依次如SEQ ID No：5、SEQ ID No：6或SEQ ID No：7所示。

PCR扩增反应体系

反应程序：

2)对KCS1～KCS3进行DNA电泳及其片段的回收纯化

采用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，EB浓度为1μg/mL，电泳液为TAE缓冲液，DNAmaker 作为对照，上样量为10μL，120V电泳25min。电泳结束后，用Tocan凝胶成像仪在紫外灯下显影，拍照并保存数据，切割目的条带，于1.5mL离心管中，用生工SanPrep柱式 DNA胶回收试剂盒回收纯化目的片段。

3)pET28b_NhisMBP-V质粒的提取与酶切

pET28b_NhisMBP-V质粒的提取

从-80℃冰箱中取出保存的pET28b_NhisMBP-V质粒菌种，吸取10μL接种到10mL 含有100μg/mL Kana的LB液体培养基中，220rpm，37℃过夜培养约16h后，用生工SanPrep 柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取pET28b_NhisMBP-V质粒。

对pET28b_NhisMBP-V质粒进行酶切，条件如下：

酶切反应体系

反应程序：37℃，1h，70℃，10min。

4)对pET28b_NhisMBP-V质粒进行DNA电泳及其片段的回收纯化

方法同本实施例步骤2)，区别在于将KCS1～KCS3 DNA替换为pET28b_NhisMBP-V质粒。

5)对KCS1～KCS3目的基因片段酶切反应，条件如下：

酶切反应体系

反应程序：37℃，1h，70℃，10min。

PCR产物纯化

将经酶切反应后的基因片段，用SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒提取回收纯化DNA 片段。

6)DNA片段与质粒的连接转化

连接反应体系

反应程序：22℃，1h。

转化方法：首先从-80℃冰箱取出保存的E.coli感受态细胞，在冰上解冻约10min。将连接好的反应液加入到60μL感受态细胞中。用移液枪缓缓吹打混匀后，于冰上20min， 42℃热激60s，于冰上冷却约3min。然后，加入500μL的SOC液体培养基，缓缓吹打混匀，37℃、220rpm振荡培养约1h。之后，将菌液均匀涂布于含有抗生素的LB固体培养基上，倒置于37℃恒温培养箱中约16h。

7)菌落PCR验证

反应体系

将配置好的菌落PCR反应液分装到6个PCR小管中，取出含相应抗生素的固体LB 培养皿，均匀分成6格，标记好序号。用牙签挑取单克隆菌落，先在标记的平板上划板，然后在对应编号的PCR小管中蘸一下，再进行下述反应程序。

反应程序：

8)重组质粒的提取及测序分析

将经菌落PCR验证DNA片段长度正确的单克隆，接种到5mL含有100μg/mL Amp 的液体LB培养基中，220rpm，37℃过夜培养约16h后，用生工SanPrep柱式质粒DNA 小量抽提试剂盒提取重组质粒。然后将重组质粒送到生工生物工程有限公司或广州擎科生物技术有限公司进行测序，并分析测序结果。

2、KCS1～KCS3重组蛋白表达

1)将通过测序确认已将目的基因准确连接到表达载体pET28b_NhisMBP-V的表达质粒转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中。

2)挑取一个单菌落接种于10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm过夜培养。

3)取250μL菌液，加入200μL 50％的灭菌甘油，将甘油菌种保存于-80℃冰箱。

4)取100μL种子液(按1％接种量)接入到10mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养3小时左右至OD值0.4～0.6。

5)将10mL的培养液均分成两份，每份5mL，其中1份加入IPTG至终浓度为0.3～0.5mM，两份培养液分别于18℃，180rpm培养，诱导表达12～16小时。

6)4℃，5000g，离心10min，弃掉上清，收集菌体。

7)每5mL的菌液收集的菌体中加入250μL Buffer A，充分混匀。

8)将超声破碎仪功率设置在20％，温度上限为30℃，变幅杆为Φ20，工作5s，休息5s，持续时间为5min，然后将含有Buffer A、β-巯基乙醇和PRSF的菌体放置在冰水中超声破碎一次，至菌体充分破碎。

8)将破碎后的菌液经4℃，5800g离心20min，将上清液用于SDS-PAGE检测及重组蛋白粗提液活性测试。

3、重组蛋白的SDS-PAGE分析

1)取少量表达纯化后的重组蛋白样品20μL，加入5×protein Loading Buffer缓冲液5 μL，混匀后，在95℃金属恒温器中加热5min，使重组蛋白变性。

2)分别取10μL重组蛋白样品上样于上层浓缩胶中，将电压调至60V，电泳时间调至25min进行压胶，后将电压调至120V，电泳时间调至40min进行重组蛋白电泳。

3)电泳结束后，将重组蛋白电泳胶从电泳仪中取出，去掉浓缩胶，分离胶转移至盛有少量考马斯亮蓝染液的玻璃皿中，在振荡器上缓慢振荡30min，进行染胶处理。

4)回收考马斯亮蓝染色液，将凝胶转移至盛有脱色液的玻璃皿中，放于振荡器上缓慢振荡脱色2h后，结果请参阅图1，图1为本发明实施例1中KCS1～KCS3重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中异源表达的结果图，(A)KCS1重组蛋白，(B)KCS2重组蛋白，(C) KCS3重组蛋白。图1中，清晰的蛋白条带显现出来，表明本实施例将KCS1～KCS3核苷酸序列构建到表达质粒(pET28b_NhisMBP-V)中，并将构建好的重组表达质粒转化到表达菌株E.coliBL21(DE3)中，利用IPTG诱导重组蛋白表达，得到了KCS1～KCS3重组蛋白。

实施例2

本实施例进行KCS1～KCS3重组蛋白的体外酶促反应活性检测。

1、体外酶促反应试剂组成

反应体系

2、体外酶促反应条件

每个酶与底物1,3,7-三甲基尿酸反应分成实验组(100μL(除底物外反应混合液)+底物)和对照组(100μL(除底物外反应混合液100℃10min)+底物)。各反应液在1.5mL EP 管中，于27℃反应16h。反应结束后，分别在各反应管中加入100μL甲醇，迅速混匀，淬灭反应，13000rpm，离心10min，吸取上清，进行液质分析。

3、液质分析条件

色谱条件：色谱柱为COSMOSIL 5C18-AR-II，4.6mm×250mm，流速为1mL/min，检测波长为254nm，进样量为20μL。流动相A：CH₃CN；流动相B：H₂O(含0.1％甲酸)。梯度洗脱程序如下表所示。

质谱条件：扫描方式：正、负离子切换全扫描；正离子模式喷雾电压：3.5KV，负离子模式喷雾电压：-2.5KV；毛细管柱温：320℃；扫描质量范围为：100-1500；一级扫描分辨率：70000；二级扫描分辨率：17500。

结果请参阅图2，图2为本发明实施例2中KCS1、KCS2和KCS3重组蛋白与1,3,7- 三甲基尿酸进行酶促反应的结果，其中，图2(a)KCS1重组蛋白，图2(b)KCS2重组蛋白，图2(c)KCS3重组蛋白，(i)混合标准品，compound 1：黄嘌呤核苷，compound 2： 7-甲基黄嘌呤，compound 3：可可碱，compound 4：咖啡因，compound 5：1,3,7-三甲基尿酸，compound 6：theacrine；(ii)被灭活的KCS1、KCS2和KCS3重组蛋白分别与1,3,7- 三甲基尿酸反应的结果；(iii)KCS1、KCS2和KCS3重组蛋白分别与1,3,7-三甲基尿酸反应的结果。结果表明，KCS1、KCS2和KCS3重组蛋白均能进行反应式(I)，催化1,3,7- 三甲基尿酸产生theacrine，表明KCS1、KCS2和KCS3重组蛋白均具有9-N-甲基转移酶活性且KCS3重组蛋白的9-N-甲基转移酶活性最高。

实施例3

本实施例检测了辅因子、pH、温度这三个方面对KCS3重组蛋白的9-N-甲基转移活性的影响，结果请参阅图3，图3为本发明实施例3在不同辅因子、pH和温度下KCS3重组蛋白的9-N-甲基转移活性图，其中，(A)辅因子，(B)pH，(C)温度。结果表明，辅因子对KCS3重组蛋白的9-N-甲基转移活性没有影响，pH为6.5～7时KCS3重组蛋白的9-N- 甲基转移活性达到最优，温度为30～37℃时KCS3重组蛋白的9-N-甲基转移活性达到最优。

本实施例对KCS1～KCS3重组蛋白以1,3,7-三甲基尿酸作为底物的酶促反应进行了K_m的测定，酶促反应的条件及相关化学物质检测方法(液质分析条件)同实施例2，利用得到的底物浓度与其对应的初速度数据，得到图4，图4为本发明实施例3中1,3,7-三甲基尿酸作为底物的KCS1重组蛋白、KCS2重组蛋白和KCS3重组蛋白的酶动力学曲线图，其中，(A)KCS1重组蛋白，(B)KCS2重组蛋白，(C)KCS3重组蛋白，最后求出K_m值。 K_m值反映了酶与底物的亲和力，K_m值越小，酶与底物结合越强。结果请参阅图4和表1，结果表明，KCS1重组蛋白的K_m值约为71.49μM；KCS2重组蛋白的K_m值约为162.20μM； KCS3重组蛋白与底物结合最强，K_m值约为4.68μM，约是KCS1的1/15，约是KCS2重组蛋白的1/35。K_cat值反映了酶的催化效率，K_cat值越大，酶的催化效率越强。结果表明， KCS1重组蛋白和KCS2重组蛋白的催化效率类似，K_cat值分别约为6.94 10^-3min^-1和10.85 10^-3min^-1；KCS3重组蛋白的催化效率最强，K_cat值约为685.00^-3min^-1，约是KCS1重组蛋白和KCS2重组蛋白的几十倍。K_cat/K_m反映酶催化的综合强度，结果表明，KCS1重组蛋白和KCS2重组蛋白的活性类似，K_cat/K_m值分别约为0.10mM^- ¹min^-1和0.07mM^-1min^-1； KCS3重组蛋白则具有非常显著的活性，其K_cat/K_m值为146.37mM^- ¹min^-1，约为KCS1的 1500倍，约为KCS2的2000倍。

表1 1,3,7-三甲基尿酸作为底物的KCS1、KCS2和KCS3重组蛋白的酶动力学结果

实施例4

本实施例进行重组N-甲基转移酶的质粒构建、异源表达及纯化，得到的重组N-甲基转移酶用于体外反应测试及蛋白晶体研究，包括如下步骤：

1、重组蛋白表达质粒的构建

PCR扩增反应体系

反应程序：

2)对KCS1～KCS3进行DNA电泳及其片段的回收纯化

同实施例1中重组蛋白表达质粒的构建的步骤2)。

3)pRSF-Duet2质粒的提取与酶切

pRSF-Duet2质粒的提取

从-80℃冰箱中取出保存的pRSF-Duet2质粒菌种，吸取10μL接种到10mL含有100 μg/mL Kana的LB液体培养基中，220rpm，37℃过夜培养约16h后，用生工SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒提取pRSF-Duet2质粒。

对pRSF-Duet2质粒进行酶切，条件如下：

酶切反应体系

反应程序：37℃，2h。

4)对pRSF-Duet2质粒进行DNA电泳及其片段的回收纯化

5)对KCS1～KCS3目的基因片段酶切反应，条件如下：

酶切反应体系

反应程序：37℃，1h

PCR产物纯化

6)DNA片段与质粒的连接转化

连接反应体系

反应程序：22℃，1h。

转化方法同实施例1中重组蛋白表达质粒的构建的步骤6)转化方法。

7)菌落PCR验证

反应体系

反应程序：

8)重组质粒的提取及测序分析

方法同同实施例1中重组蛋白表达质粒的构建的步骤8)。

2、KCS1～KCS3重组蛋白表达及分离纯化

1)将通过测序确认已将目的基因准确连接到表达载体pRSF-Duet2的表达质粒转化到感受态细胞E.coli BL21(DE3)中。

4)取1mL种子液(按1％接种量)接入到100mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养3小时左右至OD值0.4～0.6。

5)加入IPTG至终浓度为0.3～0.5mM，18℃，180rpm培养，诱导表达12～16小时。

6)4℃，5000g，离心10min，弃掉上清，收集菌体。

7)每100mL的菌液收集的菌体中加入4mL Buffer A，充分混匀，向混匀的菌液中加入1/3000的β-巯基乙醇和1/1000的PRSF。

8)将超声破碎仪功率设置在20％，温度上限为30℃，变幅杆为Φ20，工作5s，休息5s，持续时间为5min，然后将含有Buffer A、β-巯基乙醇和PRSF的菌体放置在冰水中超声破碎。

8)每次超声后，取出离心管上下颠倒数次后，再超声破碎5min，如此反复操作2-4次，至菌体充分破碎。

9)将破碎后的菌液经4℃，5800g离心20min，将上清液用于后续蛋白纯化。

10)Ni-NTA亲和层析：取2mL Ni Sepharose^TM 6Fast Flow装填于Poly-PrepChromatography柱中。

11)平衡：待上清液流至凝胶表面时，缓缓加入6mL超纯水冲洗，重复操作3次。然后用Buffer A平衡凝胶柱。

12)上样：将含有目的蛋白的上清液缓缓加至凝胶柱中，并收集流出液再次上柱，使目标蛋白能充分被吸附。

13)洗柱：待液体流至凝胶表面时，用Buffer A冲洗去除杂蛋白，一般用10倍柱体积的Buffer A冲洗，并收集流出液(收集后期Buffer A洗脱液，用于电泳检测是否有目标蛋白被洗脱出)。

14)Buffer交换：待液体流至凝胶表面时，用低盐的Buffer C交换上一步的高盐BufferA，并收集流出液。

15)洗脱：用Buffer B缓冲液进行洗脱，并收集洗脱的蛋白液。

16)阴离子交换柱纯化，平衡柱子：用Buffer C缓冲液以2.0ml/min流速平衡柱子。

17)上样：平衡好后，通过注射器将蛋白样品上样。

18)洗脱：进行梯度洗脱并收集各个阶段的蛋白样品。

19)分子筛Superdex G200柱纯化，平衡柱子：用用Buffer C缓冲液以1.0mL/min流速平衡柱子。

20)上样：平衡完成后，将蛋白样品通过上样环上柱。

21)收集：上样后，根据280nm紫外检测的出峰结果收集蛋白样品。

22)将目的蛋白经BCA法测定蛋白浓度后，用于体外酶催化反应。

3、重组蛋白的SDS-PAGE分析

方法同实施例1重组蛋白的SDS-PAGE分析，结果如图5所示，为本发明实施例4中KCS1～KCS3重组蛋白在E.coli BL21(DE3)中异源表达的结果图。图5表明本实施例将 KCS1～KCS3核苷酸序列构建到表达质粒(pRSF-Duet2)中，并将构建好的重组表达质粒转化到表达菌株E.coli BL21(DE3)中，纯化获得的重组蛋白KCS1、KCS2和KCS3纯度较好，重组蛋白KCS1、KCS2和KCS3的蛋白分子量依次分别为41.6kDa、41.3kDa和41.6 kDa，后续用于实施例5重组蛋白的功能表征和蛋白晶体结构研究。

实施例5

本实施例进行重组蛋白的功能表征和蛋白晶体结构研究，包括以下步骤：

1、晶体的高通量筛选

1)结晶条件的筛选

结晶条件初筛：采用坐滴气相扩散法，利用点晶机器人(Mosquito)进行蛋白结晶条件的初筛。

结晶条件优化：根据初筛的长晶条件，改变蛋白的结晶浓度、结晶试剂中的盐浓度以及沉淀剂浓度等来优化结晶条件。

2)衍射数据的收集、处理与解析

防冻剂的筛选：根据结晶条件配制不同浓度的防冻剂(乙醇、2-丙醇、1,4-丁二醇、甘油、乙二醇等)。选取合适的防冻剂，将晶体依次浸泡于浓度逐渐提高的所选定的防冻剂中数秒，快速捞出并浸入液氮中进行冷冻。

数据的收集：收集的晶体在上海同步辐射光源(SSRF)的B17U线站上进行X-射线衍射。晶体共旋转360°，共收集360张数据。

2、突变体重组蛋白质粒构建、异源表达与纯化

突变体质粒是通过PCR在野生型基因上直接引入的突变位点，并通过DNA测序确定突变位点的正确构建。突变体蛋白的表达和纯化同实施例4pRSF-Duet2重组蛋白表达及纯化。

3、突变体重组蛋白的体外酶促反应活性检测

体外酶反应试剂组成、体外酶促反应条件和液相分析条件同实施例2，但液相分析条件中的进样量改为20μL。

4、实验结果

1)KCSs蛋白复合物的结晶

结构预测显示KCS3重组蛋白N端的8个氨基酸没有二级结构，所以在实施例4构建表达载体的过程中，将这8个氨基酸进行了截除。截短体KCS3蛋白纯化后保存在25mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl，5mM DTT的缓冲液中，浓度约为40mg/mL。

在筛选结晶条件前，将KCS3蛋白从-80℃冰箱中取出，置于冰上缓慢融化，用含有25mM Tris，pH 8.0，100mM NaCl，5mM DTT的缓冲液稀释至20mg/mL。为了防止结晶过程中N-甲基化反应的发生，选择了SAM去掉甲基后的产物SAH制备复合物。将KSC3 蛋白与SAH(2mM)、1,3,7-三甲基尿酸(2mM)混合均匀，在冰上孵育30min，然后利用纳升级机器人对结晶条件进行大规模筛选。初始结晶条件的筛选采用座滴气相扩散法，其中槽液20μL，取0.2μL槽液与等体积KCS3复合物混合后密封并静置于4℃。72小时后，可以在多个结晶条件下看到晶体长出。但获得的初始结晶条件中晶体数量较多，体积较小，且呈现出多晶的状态。通过对缓冲液、沉淀剂和添加剂等的大量优化，最终得到了重现性非常好的单晶生长条件，并获得了无色透明的片状晶体。

KCS2蛋白没有对其N端进行截短，表达、纯化过程及结晶过程与上述KCS3相同，最终获得无色透明的针状晶体。

2)KCSs蛋白复合物结构解析

KCS3晶体生长一周可达到最大尺寸。首先在结晶缓冲液中添加终浓度为25％的甘油作为冷冻保护剂，将晶体捞到冷冻保护液中浸泡5～10s后，快速捞出并浸入液氮中进行冷冻。数据收集是在上海同步辐射光源(SSRF)的B17U线站上完成的。经HKL2000软件处理后截取的分辨率为2.90A，空间群为P21。

在PHENIX软件包中，以来自Coffee canephora的咖啡因合成酶的结构为搜索模型获得了晶体结构的初步相角，然后在COOT中对模型进行修正：根据电子云密度图调整蛋白的主链和侧链的位置，使两者尽可能的吻合；根据电子密度的走向，将模型中缺失的氨基酸一一添加上去，对不合理的二面角进行优化，然后在PHENIX.REFINE中精修。精修后得到的模型在COOT中进行新一轮的修正，直至各项数据达到要求，最终获得 KCS3-SAH-1,3,7-三甲基尿酸的复合物晶体结构。

KCS3-SAH-1,3,7-三甲基尿酸的复合物晶体结构如图6D所示，在KCS3的复合物晶体结构中，每一个不对称单元含有4条链，每条链含有一个KCS3蛋白，一个SAH和一个1,3,7-三甲基尿酸分子。但四条链的质量不完全相同，其中A/B两条链电子云密度完整度很好，大部分残基的主链和侧链都可以得到归属，小分子的电子云密度也比较完整；而剩下的C/D两条链只有局部结构较为完整，部分区域主链缺失或者侧链完整性较差。

KCS2蛋白结构如图6B所示，KCS2蛋白结构的分辨率为2.5A，空间群为P65，每个不对称单元里面有两个分子。但在结晶过程中由于分子堆积的作用，其N端的一部分结构域被挤了出去，没有在底物结合口袋中找到完整的底物和SAH的电子云密。

KCS3蛋白结构与Coffee canephora的咖啡因合成酶的整体结构请参阅图6C，KCS3蛋白结构与Coffee canephora的咖啡因合成酶的整体结构较为相似，主链上参与叠合的248 个Cα的r.m.s.d.值为1.218A，并且在晶体结构中保留了通过二次轴对称形成的二聚体的构象。二聚体界面的稳定通过大量的疏水性相互作用和氢键来维持。KSC3蛋白也含有一个 N端的灵活结构域和一个甲基转移酶催化结构域，辅基类似物SAH和底物1,3,7-三甲基尿酸在结合口袋中清晰可见，而N端的结构域像盖子一样将SAH和1,3,7-三甲基尿酸固定在其结构口袋中。N端结构域对底物和SAH的稳定结合至关重要。KCS2的结构可能就是因为缺少了N端结构域而使底物和SAH无法稳定的与蛋白结合，因此虽然分辨率更高，但无法找到完整的电子云密度。

请参阅图7，为本发明实施例5中KCS3结构中小分子结合示意图；(A)KCS3的单体结构；(B)SAH和theacrine的2Fo-Fc密度图；(C)theacrine与KCS3的氢键相互作用，氢键用黑色虚线表示；(D)图9theacrine与KCS3上残基的π-π-π堆积作用。图7表明， 1,3,7-三甲基尿酸的结合口袋的组成包含来自与N端和催化结构域的大量残基：N端的 M15、Y24，催化结构域的F30、T31、Y157、H160、W161、R226、I241、W242、C270、 F272、F315、I318和F322。这些残基中绝大部分在KCS3、KCS2和KCS1中是完全保守的。其中，Y24与N9形成直接氢键相互作用，T31上的OG与1,3,7-三甲基尿酸上的O8 形成氢键，R226上的NE和NH1都与1,3,7-三甲基尿酸上的O6形成氢键，而1,3,7-三甲基尿酸O2则与最为保守的W161和H160直接氢键作用(图7C)。除了氢键相互作用， Y157和F322位于1,3,7-三甲基尿酸平面的两侧：F322与平面平行，而Y157与平面基本垂直，这样就形成了Y157-1,3,7-三甲基尿酸-F322的π-π-πstacking的相互作用方式(图7D)。本实施例构建了W161F和F322A的突变体并以1,3,7-三甲基尿酸为底物进行了体外酶活的测定，结果请参阅图8，为本发明实施例5中KCS3重组蛋白、KCS3-W161F突变体和 KCS3-F322A突变体的活性图，结果表明KCS3-W161F突变体和KCS3-F322A突变体的活性明显降低，而KCS3-W161F突变体则几乎完全丧失了催化活性。

3)影响KCS3底物特异性的机制研究

本实施例研究了KCS3蛋白对1,3,7-三甲基尿酸底物的特异性，将KCS3和KCS2的晶体结构进行了叠合，发现除了KCS2上消失的N端结构域，组成底物结合口袋的其他保守残基基本处于相同的构象，而N端参与底物结合的残基则是完全保守，这说明KCSs家族蛋白可能是依赖于结合口袋中少量的非保守氨基酸的改变来实现底物的特异性的。请参阅图9，为本发明实施例5中KCS1、KCS2和KCS3的氨基酸序列比对图，

表示SAH结合口袋位置的氨基酸；

表示1,3,7-三甲基尿酸结合口袋位置的氨基酸；

表示与底物产生氢键相互作用的氨基酸；

表示与底物产生π-π-π堆积作用的氨基酸；

和

表示结合口袋处序列比对存在差异的氨基酸。对比KCSs蛋白的序列，共找出了4个这样的残基，包括R226(KCS2_H226，KCS1_R225)、I241(KCS2_T241，KCS1_T240)、C270 (KCS2_S270，KCS1_S269)和I318(KCS2_M318，KCS1_V317)，其中R226、I241和 C270有较大不同，说明这三个位点可能对于底物的选择性起关键作用。

对KCS2的底物结合口袋进行了改造，将R266、I241和C270单独或者组合式的突变成对应的KCS3的残基，以考察这些残基如何介导1,3,7-三甲基尿酸的识别。结果请参阅图10，为本发明实施例5中KCS2突变体重组蛋白的9-N-甲基转移活性转化率测试结果图。结果表明，KCS2 H226R、T241I、S270C单突变均不同程度的提高了KCS2的1,3,7-三甲基尿酸催化活性。其中KCS2 H226R突变体与KCS1野生型含有完全相同的这三个残基组合，而实施例3中KCS1对1,3,7-三甲基尿酸的甲基化催化活性比KCS2略强。双突变和三突变的KCS2对1,3,7-三甲基尿酸的催化活性进一步增强，说明KCS3对1,3,7-三甲基尿酸的识别依赖于这几个氨基酸的共同协调作用。因此，R226、I241和S270是影响KCS3的 9-N-甲基转移活性的关键氨基酸残基。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 暨南大学

<120> 一种黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶和苦茶生物碱theacrine的制备方法

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 369

<212> PRT

<213> Camellia sinensis

<400> 1

Met Glu Leu Ala Thr Arg Glu Lys Val Asn Glu Val Leu Phe Met Asn

1 5 10 15

Arg Gly Glu Gly Glu Ser Ser Tyr Ala Gln Asn Ser Ser Phe Thr Gln

20 25 30

Gln Val Ala Ser Met Ala Gln Pro Ala Leu Glu Asn Ala Val Glu Thr

35 40 45

Leu Phe Ser Lys Asp Phe His Leu Gln Ala Leu Asn Ala Ala Asp Leu

50 55 60

Gly Cys Ala Ala Gly Pro Asn Thr Phe Ala Val Ile Ser Thr Ile Lys

65 70 75 80

Arg Met Met Glu Lys Lys Cys Arg Glu Leu Asn Cys Gln Thr Leu Glu

85 90 95

Leu Gln Val Tyr Leu Asn Asp Leu Phe Gly Asn Asp Phe Asn Thr Leu

100 105 110

Phe Lys Gly Leu Ser Ser Glu Val Ile Gly Asn Lys Cys Glu Glu Val

115 120 125

Pro Cys Tyr Val Met Gly Val Pro Gly Ser Phe His Gly Arg Leu Phe

130 135 140

Pro Arg Asn Ser Leu His Leu Val Tyr Ser Ser Tyr Ser Val His Trp

145 150 155 160

Leu Thr Gln Ala Pro Lys Gly Leu Thr Ser Arg Glu Gly Leu Ala Leu

165 170 175

Asn Lys Gly Lys Ile Tyr Ile Ser Lys Thr Ser Pro Pro Val Val Arg

180 185 190

Glu Ala Tyr Leu Ser Gln Phe His Glu Asp Phe Thr Met Phe Leu Asn

195 200 205

Tyr Arg Ser Gln Glu Met Val Pro Asn Gly Cys Met Val Leu Ile Leu

210 215 220

Arg Gly Arg Gln Cys Phe Asp Pro Ser Asp Met Gln Ser Cys Phe Thr

225 230 235 240

Trp Glu Leu Leu Ala Leu Ala Ile Ala Glu Leu Val Ser Gln Gly Leu

245 250 255

Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Phe Asn Ile Pro Ser Tyr Phe Ala

260 265 270

Ser Leu Glu Glu Val Lys Asp Ile Val Glu Arg Asp Gly Ser Phe Thr

275 280 285

Ile Asp His Ile Glu Gly Phe Asp Leu Asp Ser Val Glu Met Gln Glu

290 295 300

Asn Asp Lys Trp Val Arg Gly Glu Lys Phe Thr Lys Val Val Arg Ala

305 310 315 320

Phe Ser Glu Pro Ile Ile Ser Ser Gln Phe Gly His Glu Ile Met Asp

325 330 335

Lys Leu Tyr Asp Lys Phe Thr His Ile Val Val Ser Asp Leu Glu Ala

340 345 350

Lys Leu Pro Lys Thr Thr Ser Ile Ile Leu Val Leu Ser Lys Ile Val

355 360 365

Gly

<210> 2

<211> 370

<212> PRT

<213> Camellia sinensis

<400> 2

Met Glu Leu Ala Thr Met Gly Lys Val Asn Glu Val Leu Phe Met Asn

1 5 10 15

Gly Gly Glu Gly Glu Ile Ser Tyr Ala Gln Asn Ser Ser Phe Thr Glu

20 25 30

Lys Val Ala Ser Met Ala Met Pro Ala Leu Glu Asn Ala Val Glu Thr

35 40 45

Leu Phe Ser Lys Asp Phe His Leu Leu Pro Ala Leu Asn Ala Ala Asp

50 55 60

Leu Gly Cys Ala Ala Gly Pro Asn Thr Phe Ala Val Ile Ser Met Ile

65 70 75 80

Lys Arg Met Met Glu Lys Lys Cys Arg Glu Leu Tyr Cys Gln Thr Pro

85 90 95

Glu Leu Gln Val Tyr Leu Asn Asp Leu Phe Gly Asn Asp Phe Asn Thr

100 105 110

Leu Phe Lys Gly Leu Ser Ser Glu Val Val Gly Asn Lys Cys Glu Glu

115 120 125

Val Ser Cys Tyr Val Met Gly Val Pro Gly Ser Phe His Gly Arg Leu

130 135 140

Phe Pro Arg Asn Ser Leu His Leu Val His Ser Ser Tyr Ser Val His

145 150 155 160

Trp Leu Thr Gln Ala Pro Lys Gly Leu Thr Ser Arg Glu Gly Leu Ala

165 170 175

Leu Asn Lys Gly Lys Ile Tyr Ile Ser Lys Thr Ser Pro Pro Ala Val

180 185 190

Lys Glu Ala Tyr Leu Ser Gln Phe His Glu Asp Phe Thr Met Phe Leu

195 200 205

Asn Ala Arg Ser Gln Glu Val Val Pro Asn Gly Cys Met Val Leu Ile

210 215 220

Leu His Gly Arg Gln Ser Ser Asp Pro Ser Glu Met Glu Ser Cys Phe

225 230 235 240

Thr Trp Glu Leu Leu Ala Ile Ala Ile Ala Glu Leu Val Ser Gln Gly

245 250 255

Leu Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Phe Asn Val Pro Ser Tyr Phe

260 265 270

Pro Ser Leu Glu Glu Val Lys Asp Ile Val Glu Arg Asp Gly Ser Phe

275 280 285

Thr Ile Asp His Leu Glu Gly Phe Glu Leu Asp Ser Leu Glu Met Gln

290 295 300

Glu Asn Asp Lys Trp Val Arg Gly Asp Lys Phe Ala Lys Met Val Arg

305 310 315 320

Ala Phe Thr Glu Pro Ile Ile Ser Asn Gln Phe Gly His Glu Ile Met

325 330 335

Asp Lys Leu Tyr Asp Lys Phe Thr His Ile Val Val Ser Asp Leu Glu

340 345 350

Ala Glu Leu Pro Lys Thr Thr Ser Ile Ile Leu Val Leu Ser Lys Ile

355 360 365

Val Gly

370

<210> 3

<211> 370

<212> PRT

<213> Camellia sinensis

<400> 3

Met Glu Leu Ala Thr Arg Gly Lys Val Lys Glu Val Leu Phe Met Asn

1 5 10 15

Thr Gly Glu Gly Glu Ser Ser Tyr Val Gln Asn Ser Ser Phe Thr Glu

20 25 30

Lys Val Ala Ser Met Ala Met Pro Ala Leu Glu Asn Ala Val Glu Thr

35 40 45

Leu Phe Ser Lys Asp Phe His Leu Phe Gln Ala Ile Asn Ala Ala Asp

50 55 60

Leu Gly Cys Ala Thr Gly Pro Asn Thr Phe Ala Val Ile Ser Thr Ile

65 70 75 80

Lys Arg Met Met Glu Lys Lys Cys Arg Glu Leu Asn Cys Gln Thr Leu

85 90 95

Glu Leu Gln Val Tyr Met Asn Asp Leu Phe Gly Asn Asp Phe Asn Thr

100 105 110

Leu Phe Lys Gly Leu Ser Ser Lys Val Ile Gly Asn Lys Cys Glu Glu

115 120 125

Val Ser Cys Tyr Val Met Gly Val Pro Gly Ser Phe His Gly Arg Leu

130 135 140

Phe Pro Arg Asn Ser Leu His Leu Val His Ser Ser Tyr Ser Val His

145 150 155 160

Trp Leu Thr Gln Ala Pro Lys Gly Leu Thr Ser Arg Glu Gly Leu Ala

165 170 175

Leu Asn Lys Gly Arg Ile Tyr Ile Ser Lys Thr Ser Pro Pro Val Val

180 185 190

Arg Glu Ala Tyr Leu Ser Gln Phe His Glu Asp Phe Thr Met Phe Leu

195 200 205

Asn Ala Arg Ser Gln Glu Val Val Pro Asn Gly Cys Met Val Leu Ile

210 215 220

Leu Arg Gly Arg Gln Ser Ser Asp Pro Ser Asp Met Gln Ser Cys Phe

225 230 235 240

Ile Trp Glu Leu Leu Ala Ile Ala Ile Ala Glu Leu Val Ser Gln Gly

245 250 255

Leu Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Phe Asn Ile Pro Cys Tyr Phe

260 265 270

Pro Ser Leu Glu Glu Val Lys Asp Ile Val Glu Arg Asp Gly Ser Phe

275 280 285

Thr Ile Asp His Met Glu Gly Phe Glu Leu Asp Ser Leu Gln Met Gln

290 295 300

Glu Asn Asp Lys Trp Val Arg Gly Glu Lys Phe Ala Lys Ile Val Arg

305 310 315 320

Ala Phe Thr Glu Pro Ile Ile Ser Asn Gln Phe Gly His Glu Ile Met

325 330 335

Asp Lys Leu Tyr Asp Lys Phe Thr His Ile Val Val Ser Asp Leu Glu

340 345 350

Ala Lys Leu Pro Lys Thr Thr Ser Ile Ile Leu Val Leu Ser Lys Ile

355 360 365

Val Gly

370

<210> 4

<211> 1113

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 4

atggagctag ctactanggn gaaggtgaan gaagtgttgt tcatgaacnn aggagaagga 60

gaaantagtt atgnacaaaa ctcttctttc acnnaanaag tggcctcaat ggcanngcca 120

gcgctagaaa atgcagttga aactctcttc tccaaagatt tccaccttnn ncnagctntt 180

aangcagcgg acttgggttg tgcagcgggt ccaaacacat tcgcagtgat ttctacgatc 240

aagagaatga tggaaaagaa atgcagggaa ttgaattgcc aaacactgga acttcaggtt 300

tacttgaatg atctttttgg aaatgatttc aataccctct tcaaaggcct gtcgtctgag 360

gttattggta acaaatgtga ggaagttccg tgttatgtga tgggagtacc ggggtctttc 420

catggccggc tttttcctcg taacagctta catttagttt attcctctta cagtgttcat 480

tggcttactc aggcaccaaa aggactcaca agcagagaag gcttggcatt aaacaagggg 540

aagatttaca tatcaaagac aagccctcct gttgtaagag aagcctactt atctcaattt 600

catgaagatt tcacaatgtt tctcaattat agatcccaag agatggttcc aaatggttgt 660

atggtgttga tacttcgtgg taggcaatgt tttgatcctt cagacatgca gagctgcttt 720

acttgggaac tattagcttt agccattgct gaattggttt cacagggatt gatagatgaa 780

gataaattag acaccttcaa tatacccagc tattttgcat cacttgagga agtgaaagat 840

atagtggaga gggacggatc attcacaatt gatcatatag aggggtttga tcttgatagc 900

gtagaaatgc aggagaatga taaatgggtt agaggggaaa agtttaccaa ggttgtcagg 960

gccttctcag agcctataat ttcaagccag tttggacatg aaatcatgga caaactatat 1020

gacaaattca ctcacattgt agtttcagat ttggaagcaa agctaccgaa gaccacaagt 1080

atcatcctag tgctttccaa gattgttgga tag 1113

<210> 5

<211> 1110

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 5

atggagctag ctactaggga gaaggtgaac gaagtgttgt tcatgaacag aggagaagga 60

gaaagtagtt atgcacaaaa ctcttctttc acgcaacaag tggcctcaat ggcacagcca 120

gcgctagaaa atgcagttga aactctcttc tccaaagatt tccaccttca agctcttaac 180

gcagcggact tgggttgtgc agcgggtcca aacacattcg cagtgatttc tacgatcaag 240

agaatgatgg aaaagaaatg cagggaattg aattgccaaa cactggaact tcaggtttac 300

ttgaatgatc tttttggaaa tgatttcaat accctcttca aaggcctgtc gtctgaggtt 360

attggtaaca aatgtgagga agttccgtgt tatgtgatgg gagtaccggg gtctttccat 420

ggccggcttt ttcctcgtaa cagcttacat ttagtttatt cctcttacag tgttcattgg 480

cttactcagg caccaaaagg actcacaagc agagaaggct tggcattaaa caaggggaag 540

atttacatat caaagacaag ccctcctgtt gtaagagaag cctacttatc tcaatttcat 600

gaagatttca caatgtttct caattataga tcccaagaga tggttccaaa tggttgtatg 660

gtgttgatac ttcgtggtag gcaatgtttt gatccttcag acatgcagag ctgctttact 720

tgggaactat tagctttagc cattgctgaa ttggtttcac agggattgat agatgaagat 780

aaattagaca ccttcaatat acccagctat tttgcatcac ttgaggaagt gaaagatata 840

gtggagaggg acggatcatt cacaattgat catatagagg ggtttgatct tgatagcgta 900

gaaatgcagg agaatgataa atgggttaga ggggaaaagt ttaccaaggt tgtcagggcc 960

ttctcagagc ctataatttc aagccagttt ggacatgaaa tcatggacaa actatatgac 1020

aaattcactc acattgtagt ttcagatttg gaagcaaagc taccgaagac cacaagtatc 1080

atcctagtgc tttccaagat tgttggatag 1110

<210> 6

<211> 1113

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 6

atggagctag ctactatggg gaaggtgaac gaagtgttgt tcatgaacgg aggagaagga 60

gaaattagtt atgcacaaaa ctcttctttc acagaaaaag tggcctcaat ggcaatgcca 120

gcgctagaaa atgcagttga aactctcttc tccaaagatt tccaccttct tccagctctt 180

aatgcagcgg acttgggttg tgcagcgggt ccaaacacgt tcgcagtgat ttctatgatc 240

aagagaatga tggaaaagaa atgcagggaa ttgtattgcc aaacaccgga acttcaggtt 300

tacttgaatg atctttttgg aaacgatttc aataccctct tcaaaggcct gtcgtctgag 360

gttgttggta acaaatgtga ggaagtttct tgttatgtga tgggagtacc ggggtctttc 420

catggccggc tttttcctcg taacagcttg catttagttc attcctctta tagtgttcat 480

tggcttactc aggcaccaaa aggactcaca agcagagaag gcttggcatt aaacaagggg 540

aagatttaca tatcaaagac aagccctcct gctgtaaaag aagcctactt atctcaattt 600

catgaagatt tcacaatgtt tctcaacgct agatcccaag aggtggttcc aaatggttgt 660

atggtgttga tacttcatgg taggcaatct tctgatccgt cagagatgga gagttgcttt 720

acttgggaac tattagctat agccattgct gaattggttt cacagggatt gatagatgaa 780

gataaattag acaccttcaa tgtacctagc tattttccat cacttgagga agtgaaagac 840

atagtggaga gggacggatc attcacaatt gatcatttgg aggggtttga acttgatagc 900

ctagagatgc aagagaatga taaatgggtt agaggggaca agtttgccaa gatggtcagg 960

gccttcacag agcctataat ttcaaaccag tttggacatg aaatcatgga caaactatat 1020

gacaaattca ctcacattgt agtttcagat ttggaagcag agctaccgaa gaccacaagt 1080

atcatcctag tgctttccaa gattgttgga tag 1113

<210> 7

<211> 1113

<212> DNA

<213> Camellia sinensis

<400> 7

atggagctag ctactagggg gaaggtgaaa gaagtgttgt tcatgaacac aggagaagga 60

gaaagtagtt atgtacaaaa ctcttctttc acagaaaaag tggcctcaat ggcaatgcca 120

gcgctagaaa atgcagttga aactctcttc tccaaagatt tccacctttt tcaagctatt 180

aacgcagcag acttgggttg tgcaacgggt ccaaacacgt tcgcagtgat ttctacgatc 240

aagagaatga tggaaaagaa atgcagggaa ttgaattgcc aaacactgga acttcaggtt 300

tacatgaatg atctttttgg aaacgatttc aataccctct tcaaaggcct gtcgtctaag 360

gttattggta acaaatgcga ggaagtttct tgttatgtga tgggagtacc agggtctttc 420

catggccggc tttttcctcg taacagcttg catttagttc attcgtctta cagtgttcat 480

tggcttactc aggcaccaaa aggactcaca agtagagaag gcttggcatt aaacaagggg 540

aggatttaca tatcaaagac aagccctcct gttgtaagag aagcctactt atctcaattt 600

catgaagatt tcacaatgtt tcttaatgct agatcccaag aggtggttcc aaatggttgt 660

atggtgttga tacttcgtgg taggcaatct tctgatcctt cagacatgca gagctgcttt 720

atttgggaac tattagctat agccattgct gaattggttt cgcagggatt gatagatgaa 780

gataaattag acaccttcaa tataccttgc tattttccat cacttgagga agtgaaagat 840

atagtggaga gggacggatc attcacaatt gatcatatgg aggggtttga acttgatagc 900

ctacagatgc aagagaatga taaatgggtt agaggggaaa agtttgccaa gattgtcagg 960

gccttcacag agcctataat ttcaaaccag tttggacatg aaatcatgga caaactatat 1020

gacaaattca ctcacattgt agtttcagat ttggaagcaa agctgccgaa gaccacaagt 1080

atcatcctag tgctttccaa gattgttgga tag 1113

Claims

1.一种重组蛋白，其特征在于，具有：

(Ⅴ)与(Ⅰ)、(Ⅱ)或(III)所述氨基酸序列至少有80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同源性的氨基酸序列，且与(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列。

2.编码权利要求1所述重组蛋白的核苷酸，其特征在于，具有：

(Ⅰ)、如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列；或

(Ⅱ)、如SEQ ID No：4所示的核苷酸序列的互补核苷酸序列；或

(Ⅲ)、与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列编码相同蛋白质，但因遗传密码的简并性而与(Ⅰ)或(Ⅱ)的核苷酸序列不同的核苷酸序列；或

(VI)、与(Ⅰ)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅳ)或(V)所述的核苷酸序列至少有80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％同源性的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸序列选自SEQ ID No：5、SEQID No：6或SEQ ID No：7。

4.一种表达载体，其特征在于，包括权利要求2所述的核苷酸以及待转化载体。

5.一种重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

构建权利要求4所述的表达载体，将所述表达载体导入宿主细胞中，诱导表达，再通过分离纯化获得所述重组蛋白。

6.权利要求1所述重组蛋白作为黄嘌呤生物碱9-N-甲基转移酶的应用。

7.一种theacrine的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将1,3,7-三甲基尿酸和甲基供体在权利要求1所述重组蛋白的催化下进行酶促反应，得到theacrine。

8.权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述甲基供体为S-腺苷甲硫氨酸；

所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：3所示。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述酶促反应的pH值为6.5～7。

10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述酶促反应的温度为30℃～37℃。