CN105861363B - 爱格氏菌、s-雌马酚产生工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种爱格氏菌、S‑雌马酚产生工程菌及其构建方法和应用，涉及微生物技术领域。爱格氏菌HAU‑JLC44，保藏号为CGMCC No.12354。S‑雌马酚产生工程菌的构建方法为：从爱格氏菌HAU‑JLC44中克隆参与雌马酚合成的三个转化酶基因：E‑dgr、E‑dhdr和E‑thdr；将E‑dhdr、E‑thdr和这两个基因中间的145 bp非编码区序列按一个基因克隆下来，称为E‑tdhdr；将E‑dgr和E‑tdhdr克隆至pETDuet‑1上，在BL21(DE3)中表达，获得工程菌。本发明使用共表达三个基因的大肠杆菌工程菌将底物黄豆苷原或黄豆素转化为S‑雌马酚，转化性能稳定，方法简单。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域。
背景技术
大豆异黄酮（Soy isoflavones）是大豆等豆科植物在其生长过程中生成的一类次生代谢产物，其中染料木素（Genistein）、黄豆苷原（Daidzein）为大豆异黄酮主要游离型苷元。大豆异黄酮具有抗氧化、抗癌、减少骨质疏松、减轻心脑血管发病率等多种生理功能。体内及体外试验结果表明，被人体或其他动物摄入体内的大豆异黄酮将被寄居在胃肠道的微生物菌群代谢为各种不同代谢产物。大量研究结果证实，雌马酚的类雌激素、抗氧化、预防骨质疏松、抗癌（如乳腺癌和前列腺癌）等生物活性均显著高于大豆异黄酮本身或大豆异黄酮的其他微生物转化产物。
雌马酚化学名称为7-羟基-3-(4-羟苯基)-苯并二氢吡喃，属异黄酮类非类固醇雌激素。然而，雌马酚在自然界中并不存在，只能通过化学氢转移或微生物生物转化法进行合成。值得一提的是，雌马酚为手性化合物，通过化学方法合成的雌马酚为R-和S-两种对映异构体等量共存的外消旋体，而通过微生物转化法合成的雌马酚则全部为S-雌马酚（Wang etal, 2005），之后美国营养学家Setchell研究小组也证实人体内的雌马酚全部为S-雌马酚（Setchell et al, 2005）。有关R-雌马酚是否会对人体产生副作用目前尚不清楚，但可以肯定的是，S-雌马酚对人体和其他动物起重要的有益调节作用。此外，人工合成外消旋体雌马酚时需要价格昂贵的化学催化剂钯，因而利用微生物转化法合成S-型雌马酚显得尤为重要。迄今国内外报道了一系列能将底物黄豆苷原或二氢黄豆苷原转化为雌马酚的细菌菌株，但绝大部分菌株为严格厌氧细菌菌株。本实验室曾从鸡新鲜粪样中分离得到一株能将底物染料木素转化为左旋-5-OH-雌马酚的严格厌氧菌株Slackia sp. AUH-JLC159（ZL201310043107.X），但该菌株的转接和培养均必须在严格厌氧条件下完成。2007年日本学者Uchiyama等报道了一株兼性厌氧乳酸菌20-92，菌株20-92既能在无氧条件下生长也能在有氧条件下生长，但只能在厌氧条件下才能将底物黄豆苷原转化为S-雌马酚。2010至2012年，日本学者从乳酸菌20-92中克隆了参与雌马酚合成的功能基因l-dznr, l-dhdr，l- thdr和l-ddrc，并证明工程菌的粗酶液能够将底物黄豆苷原转化为雌马酚。专利CN104031875A公布了一种S-雌马酚产生工程菌，该工程菌含有两个质粒（双质粒系统），每个质粒上分别携带2个参与雌马酚合成的基因（即质粒1为l-ddrc和l-dznr；质粒2为l-dhdr和l-thdr），功能基因是完全根据已报道的20-92中的功能基因进行人工合成的。
基因共表达包括多质粒共表达系统和单质粒共表达系统。多质粒共表达系统既要考虑表达质粒的相容性，又要考虑因质粒丢失而影响工程菌应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种爱格氏菌、S-雌马酚产生工程菌及其构建方法和应用，用于制备S-雌马酚，工艺简便； S-雌马酚产生工程菌发酵简单、使用方便、体系稳定，具有潜在的产业化价值； S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成过程使用重组大肠杆菌S-雌马酚产生工程菌全细胞进行转化，并且可以在有氧条件下完成转化过程，生产过程无高温高压反应，无有毒化学品，适合工业化生产。
本发明的目的在于提供一种爱格氏菌（Eggerthella sp.）HAU-JLC44，保藏号为CGMCC No.12354。
本发明的另一目的在于提供一种爱格氏菌HAU-JLC44在S-雌马酚合成中的应用：爱格氏菌HAU-JLC44在厌氧条件下将底物黄豆苷原转化为S-雌马酚。
本发明第三个目的在于提供一种爱格氏菌HAU-JLC44在S-雌马酚合成中的另一种应用：用爱格氏菌HAU-JLC44基因组DNA作模板，克隆雌马酚生物合成基因，构建S-雌马酚产生工程菌，并用S-雌马酚产生工程菌合成S-雌马酚。
本发明第四个目的在于提供一种S-雌马酚产生工程菌：S-雌马酚产生工程菌为大肠杆菌（Escherichia coli），是用爱格氏菌HAU-JLC44的基因组DNA作模板，克隆雌马酚生物合成基因，构建而成，命名为S-雌马酚产生工程菌HAU-JLC44，保藏号为CGMCC No.12353。
本发明中的爱格氏菌（Eggerthella sp.）HAU-JLC44、S-雌马酚产生工程菌HAU-JLC44已于2016年04月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）保藏，保藏号分别为CGMCC No.12354、CGMCC No.12353。中国科学院微生物研究所菌种保藏中心地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明第五个目的在于提供一种S-雌马酚产生工程菌的构建方法，包括如下步骤：
（1）从如权利要求1所述的爱格氏菌HAU-JLC44中克隆参与雌马酚合成的三个转化酶基因：黄豆苷原还原酶E-dgr、二氢黄豆苷原还原酶E-dhdr和四氢黄豆苷原还原酶E-thdr（即将黄豆苷原还原为二氢黄豆苷原的E-dgr；将二氢黄豆苷原还原为四氢黄豆苷原的E- dhdr；将四氢黄豆苷原转化为雌马酚的E-thdr）；所述E-dgr、E-dhdr和E-thdr的核苷酸序列如SEQ. ID. NO:1、SEQ. ID. NO:2和SEQ. ID. NO:3所示；基因E-dhdr和E-thdr之间有145bp非编码区核苷酸序列，将基因E-dhdr、基因E-thdr和这两个基因中间的145 bp非编码区序列按一个基因克隆下来，将其命名为整合基因E-tdhdr，整合基因E-tdhdr含有两个开放读码框，所述整合基因E-tdhdr的核苷酸序列如SEQ. ID. NO:4所示；整合基因E-tdhdr与基因E-tdhdr为相同序列，本发明中将整合基因E-tdhdr简称为基因E-tdhdr或E-tdhdr；
（2）提取爱格氏菌HAU-JLC44的基因组DNA，设计引物将E-dgr和E-tdhdr两个基因用PCR法扩增下来，在基因E-dgr的N端和C端分别加上Bgl II和Kpn I酶切位点，在整合基因E-tdhdr的N端和C端分别加上BamH I和Hind III酶切位点；
（3）将带有Bgl II和Kpn I酶切位点的基因E-dgr，克隆至用Bgl II和Kpn I酶切过的T7双启动子共表达质粒pETDuet-1上，得到重组质粒pETDuet-1-dgr；
（4）将带有BamH I和Hind III酶切位点的整合基因E-tdhdr，克隆至用BamH I和Hind III酶切过的重组质粒pETDuet-1-dgr上，得到重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr；
（5）将重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr转入大肠杆菌Trans 109，得克隆菌，送测序公司进行测序；
（6）将重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr从测序正确的克隆菌中提取出来，转化大肠杆菌BL21（DE3），获得S-雌马酚产生工程菌。
优选的，S-雌马酚产生工程菌的构建方法：步骤（2）中扩增E-tdhdr和E-dgr两个基因设计的引物的序列如下：引物1的上、下游序列如SEQ. ID. NO:5和SEQ. ID. NO:6所示；引物2的上、下游序列如SEQ. ID. NO:7和SEQ. ID. NO:8所示。
本发明第六个目的在于提供一种S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成中的应用，包括以下步骤：
a、S-雌马酚产生工程菌的种子液制备；
b、催化底物黄豆苷原转化生成S-雌马酚；
c、催化豆粉浸液中的黄豆素转化生成S-雌马酚。
优选的，S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成中的应用，步骤a包括以下步骤：使用LB液体培养基，加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，摇床转数为120 rpm，37℃培养12h后，获得种子液，用于接种。
优选的，S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成中的应用，步骤b包括以下步骤：取LB固体培养基粉末2.5 g，用100 mL pH值为6.5的PBS缓冲液溶解，分装成2 mL/管，121℃高温高压灭菌15 min，得到培养基1，待用；将步骤a中的种子液以体积浓度10%的接种量接种到培养基1中，同时加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，摇床转数为120 rpm，37℃培养10 h后，加入山梨醇至终浓度为1.0% w/v、加入柠檬酸至终浓度为2 g/L和加入100 mg/L的底物黄豆苷原，继续培养2 h后，加入氯霉素至终浓度为85 μg/mL，37℃继续培养48 h后，通过高效液相色谱HPLC检测S-雌马酚的生成量。
优选的，S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成中的应用，步骤c包括以下步骤：向100 mL蒸馏水中加入黄豆粉1.5 g，80 ℃水浴1 h，冰箱中静置过夜，取出上清液即为豆粉浸液，加入pH值为7.0的磷酸缓冲盐，即22.21 g/LNa2HPO4和5.93 g/L NaH2PO4，完全溶解后分装成2 mL/管；115 ℃下灭菌15 min后加入过滤除菌的乳糖或山梨醇至终浓度为1.0% w/v，得培养基2；将步骤a中的种子液以体积浓度10%的接种量接种到培养基2中，同时加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，摇床转数为120 rpm，37℃培养72 h后，通过高效液相色谱HPLC检测S-雌马酚的生成量。
高效液相色谱法（HPLC）检测工程菌对底物的转化情况，包括以下步骤：（1）取转化液100 μl，加入500 μl乙酸乙酯充分震荡混匀。
（2）常温8000 rpm离心10 min，取400 μl上清液。
（3）将400 μl上清液在真空旋转蒸发仪中蒸干，加入80 μl无水甲醇溶解，并过孔径为0.45 μm的有机膜后备用。
（4）质谱及手性高效液相色谱检测。
全波长扫描仪、质谱仪和手性高效液相检测工程菌转化后生成产物的紫外吸收图谱、分子量和绝对立体构型。
采用美国SCIEX公司生产的ESI源4000 QTRAP LC/MS/MS SYSTEM阳离子阱质谱仪测定产物的分子量。
手性高效液相条件-----美国Waters公司，1525型双泵，2487UV检测器；色谱柱：Sumi Chiral OA-7000手性分析柱（5μm，250 mm x 4.6 mm）；流动相：40%乙腈-60% KH2PO4溶液（20 mM）；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μl。
本实验室从鸡新鲜粪样中分离得到一株能将底物黄豆苷原转化为左旋-S-雌马酚的严格厌氧爱格氏菌属菌株Eggerthella sp. HAU-JLC44。以爱格氏菌HAU-JLC44基因组DNA为模板，克隆参与雌马酚生物合成的黄豆苷原还原酶（E-dgr）、二氢黄豆苷原还原酶（E- dhdr）和四氢黄豆苷原还原酶（E-thdr）基因，并将基因E-dgr、E-dhdr和E-thdr整合，将三个不同功能的基因在同一个质粒上进行共表达，实现了S-雌马酚的有氧生物合成。基因共表达包括多质粒共表达系统和单质粒共表达系统。多质粒共表达系统既要考虑表达质粒的相容性，又要考虑因质粒丢失而影响工程菌应用。因此，单质粒共表达体系更具有研究和应用价值。
本发明S-雌马酚产生工程菌的构建方法，使用的质粒为T7双启动子共表达质粒pETDuet-1，该质粒能够保证克隆到该质粒上面的两个基因拥有各自独立的T7启动子，在工程菌中通过T7RNA聚合酶启动转录。本发明将来源于爱格氏菌属的菌株HAU-JLC44（Eggerthella sp.）的三个转化酶基因（E-dgr、E-dhdr和E-thdr）从菌株HAU-JLC44的基因组DNA上扩增出来，需指出的是，本发明是将E-dhdr和E-thdr一起扩增出来，作为一个整合基因（E-tdhdr），然后再将第一个酶基因E-dgr和整合基因E-tdhdr克隆到质粒pETDuet-1中，导入大肠杆菌BL21（DE3），得到产S-雌马酚的大肠杆菌工程菌。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
（1）本发明提供一种发酵简单、使用方便、体系稳定的S-雌马酚产生工程菌，具有潜在的产业化价值。利用T7启动子使S-雌马酚三个合成酶基因同时在大肠杆菌中串联异源表达，将底物黄豆苷原和黄豆素转化成S-雌马酚。
（2）S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成过程使用重组大肠杆菌S-雌马酚产生工程菌全细胞进行转化，并且可以在有氧条件下完成转化过程。生产过程无高温高压反应，无有毒化学品。
（3）S-雌马酚产生工程菌能够转化100 mg/L的黄豆苷原生成34.30 mg/L的二氢黄豆苷原和34.27 mg/L的S-雌马酚，S-雌马酚转化率高达49.48%，有工业化潜力。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明；
图1为重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr的图谱；
图2 A为S-雌马酚产生工程菌酶切鉴定结果图；
图2 B为S-雌马酚产生工程菌蛋白电泳结果图；
其中图2A是将工程菌质粒和空载体分别使用BamH I和Hind III双酶切（泳道1和4）、Bgl II和Kpn I双酶切（泳道2和5）、Bgl II、Kpn I、BamH I和Hind III四酶切（泳道3和6）；图2B是对照菌E.coli BL21/pETDuet-1全蛋白（泳道1）和S-雌马酚产生工程菌E.coliBL21/pETDuet-1-dgr-tdhdr的全蛋白（泳道1）电泳图；
图3A为高效液相色谱法（HPLC）检测野生型菌株HAU-JLC44转化合成雌马酚的图谱；
图3B为高效液相色谱法（HPLC）检测大肠杆菌工程菌转化合成雌马酚的图谱；
图3C为高效液相色谱法（HPLC）检测以黄豆苷原、二氢黄豆苷原和外消旋体雌马酚标准品的图谱；
图3D为大肠杆菌工程菌转化黄豆苷原所生成产物的紫外吸收图谱；
图4是工程菌转化底物黄豆苷原后所生成产物的质谱图；
图5A为化学合成的外消旋体雌马酚的手性液相色谱图；
图5B为工程菌转化底物黄豆苷原后生成雌马酚的手性液相色谱图；
图6为工程菌对不同底物黄豆苷原的转化能力图；
图7为工程菌对豆粉浸液培养基中黄豆素和黄豆苷原的转化能力图；
其中图7中左侧柱状图是在豆粉浸液培养基中添加了乳糖；右侧柱状图是在豆粉浸液培养基中添加山梨醇。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：爱格氏菌（Eggerthella sp.）HAU-JLC44的分离筛选、种属鉴定和菌株HAU-JLC44转化底物黄豆苷原所生成产物的结构鉴定
1、菌株HAU-JLC44是从公鸡新鲜粪便中分离得到的一株革兰氏阳性严格厌氧细菌菌株，该厌氧细菌对底物黄豆苷原有转化作用，菌株HAU-JLC44 的分离筛选过程为：
1）用已灭菌的棉签挑取公鸡新鲜粪便，放入1 mL新鲜BHI液体培养基中，并放置在37℃厌氧工作站内，以此作为筛选特定功能微生物菌株的微生物菌群；
2）对BHI液体培养基内的微生物菌群进行梯度稀释，分别稀释到浓度为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，再分别将100 μl浓度分别为10-5、10-6、10-7、10-8的微生物菌群稀释液均匀涂在预先备好的BHI固体培养基上，将涂有微生物菌群稀释液的BHI固体培养基置于厌氧工作站内培养24-48 h后，分别从BHI固体培养基上挑取数十至数百个单菌落置BHI固体培养皿上，并对所挑取的单菌落进行随机编号；
3）将已编号的单菌落随机取10个一组，将每组的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落接种到盛有1 mL BHI液体培养基的同一试管内，再分别加入10 mM黄豆苷原母液10 μl，在厌氧工作站内培养3天，取100 μl培养液并用1000 μl乙酸乙酯进行萃取，萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC检测有无产物生成；
4）一旦某试管中的培养物被检测出有产物生成，立即将接种到该试管的事先已编号的10个已培养在BHI固体培养基上的单菌落，重新分别接种到10个盛有1 mL BHI液体培养基的不同小试管中，再分别加入10 mM黄豆苷原母液10 μl，共同培养3天后，取100 μl培养液加入1000 μl乙酸乙酯进行萃取。萃取液蒸干后加入100%甲醇，用HPLC进行检测，最终确定出具有转化活性的10个菌落的混合培养物中能转化底物黄豆苷原的单菌落。将筛选出的具有转化功能的单菌落在BHI固体培养基上划线培养，长出单菌落后，再对长出的单菌落进行划线，重复至少三次以上，确保长出的单菌落形态一致；
5）经高效液相检测，发现一株细菌对底物黄豆苷原具有转化作用，在保留时间8.50 min左右出现的底物黄豆苷原的峰明显减少，而在保留时间15.28 min出现一新物质峰，且随底物浓度加倍，该新物质峰的峰面积也成比例增加，因此，我们将出现在15.28 min的新物质峰确定为菌株HAU-JLC44转化底物黄豆苷原后生成的产物。
2、有关菌株HAU-JLC44的种属鉴定：
以单一功能微生物菌株菌体总DNA为模版，以通用引物27F/1492R为引物对16SrDNA序列进行PCR扩增，PCR扩增产物送交上海生工生物工程有限公司进行DNA测序。通过BLAST比对，菌株JLC44与爱格氏菌属菌株Eggerthella lenta strain AUH-Julong365、Eggerthella lenta strain ZL3和Eggerthella sp. MVA1的16S rDNA序列相似性均高达99%，表明菌株HAU-JLC44可能为爱格氏菌属的一个分类单元。通过16S rDNA序列，结合菌株HAU-JLC44的生理生化特征，我们初步将菌株HAU-JLC44鉴定为爱格氏菌属的不定种菌株，即Eggerthella sp. HAU-JLC44。该菌株对氧气非常敏感，只能在严格厌氧环境（如厌氧工作站）中生长和发挥转化功能。
3、菌株HAU-JLC44转化底物黄豆苷原所生成产物的结构鉴定
在厌氧工作站内，将菌株HAU-JLC44与0.6 mM的底物黄豆苷原共培养3天，然后用等体积的乙酸乙酯将培养物萃取2次，萃取液蒸干后，加入100%甲醇溶解，过孔径为0.45 μm有机膜，用半制备高效液相色谱将产物峰用干净三角瓶收集，并将三角瓶收集的液体用旋转蒸发仪蒸干。用分析型高效液相色谱柱测定产物峰纯度，并与标准品雌马酚比对高效液相保留时间。此外，还对产物的紫外吸收图谱、质谱和核磁共振氢谱（1H-NMR）进行了测定。
经高效液相色谱检测，产物的出峰时间与标准品雌马酚基本一致（仅比标准品出峰慢0.1 min）；经全波长扫描，所纯化的黄豆苷原代谢产物仅在280 nm处有一最大紫外吸收峰，这恰与已报道的雌马酚的紫外吸收图谱一致；经ESI阳离子质谱测定，发现在243 nm处有一分子离子峰，表明该产物的分子量应为242，这恰与雌马酚（C15H14O3）的分子量相一致；为进一步准确鉴定产物的化学结构，还对该产物进行了核磁共振氢谱分析，该代谢产物的核磁共振氢谱解析结果为：1H–NMR ((CD3)2CO, 400 MHz): 2.93(m, 2H, H-4), 3.07(m, 1H, H-3), 3.93 (m, 1H, H-2), 4.19 (m, 1H, H-2), 6.29 (d, 1H, J=2.4 Hz, H-8), 6.38 (dd, H-3′), 7.17 (d, 2H, J=8.5 Hz, H-6′), 8.19 (s, 1H, OH), 8.29 (s,1H, OH)。
根据高效液相保留时间、紫外吸收图谱，质谱以及核磁共振氢谱的解析结果，最终将爱格氏菌Eggerthella sp. HAU-JLC44转化底物黄豆苷原后所生成的产物准确鉴定为雌马酚。
经手性高效液相色谱检测，爱格氏菌Eggerthella sp. HAU-JLC44转化底物黄豆苷原所生成的产物仅在保留时间15.26 min出现一个物质峰，该产物峰的高效液相保留时间与S-雌马酚的保留时间完全一致，因此，爱格氏菌Eggerthella sp. HAU-JLC44转化底物黄豆苷原所生成的雌马酚为S-雌马酚。
实施例2：S-雌马酚产生工程菌的构建及验证
本发明利用本实验室分离得到的野生型菌株爱格氏菌（Eggerthella sp.）HAU-JLC44的基因组DNA克隆S-雌马酚生物合成基因，将不同功能基因连接在同一质粒上，构建了一种S-雌马酚产生工程菌，该工程菌的构建主要包括以下步骤：
1、雌马酚生物合成基因的获得
采用基因组DNA克隆法来获得目的基因，爱格氏菌株HAU-JLC44为严格厌氧细菌菌株，使用BHI培养基（美国Bacto公司）37℃培养于Concept 400厌氧工作站（英国Ruskinn公司），取1mL菌液，使用基因组提取试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）提取HAU-JLC44的基因组DNA，设计带有酶切位点同时携带一段载体重复序列的引物，PCR法扩增E-dgr基因和E-tdhdr整合基因，使得E-dgr基因的N端和C端分别加上Bgl II和Kpn I酶切位点，E-tdhdr整合基因的N端和C端分别加上BamH I和Hind III酶切位点。电泳检测目的条带的大小，基因E-dgr大小为1935 bp，整合基因E-tdhdr大小为2467 bp。
PCR体系和条件：TaKaRa PrimeSTAR Premix（2×）25 μl；引物上游序列（10 μM）2μl；引物下游序列（10 μM）2 μl；基因组DNA 1 μl；灭菌蒸馏水补足 50 μl。
PCR引物（下划线部分为酶切位点，斜体部分为与载体重复的序列）
引物1上游序列：
5’-CATCACCACAGCCA GGATCCATGGCAAAATTCGATGTTGAGTATGATCTTG-3’
引物1下游序列：
5’-CATTATGCGGCCGC AAGCTTCTAGACCTCGATCTCGCCC-3’
引物2上游序列：
5’-GGAGATATACATATGGC AGATCTATGAAGAACAAGTTCTATCCGAAGACC-3’
引物2下游序列：
5’-CAGACTCGAG GGTACCCTACAGGTTGCAGCCAGC-3’
引物1为E-tdhdr的引物，引物2为E-dgr的引物。
PCR条件1（扩增E-tdhdr）：98℃，5min，1个循环；98℃，10s，56.1℃，5s，72℃，15s，30个循环；72℃，10min，一个循环。
PCR条件2（扩增 E-dgr）：98℃，5min，1个循环；98℃，10s，55.2℃，5s，72℃，10s，30个循环；72℃，10min，一个循环。
2、质粒与工程菌的构建
将E-dgr基因克隆到大肠杆菌表达载体pETDuet-1（购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心）的MCS2中，获得重组质粒pETDuet-1-dgr；将E-tdhdr整合基因克隆到pETDuet-1-dgr的MCS1中，获得重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr。然后将重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr转入到大肠杆菌表达宿主菌BL21（DE3）（购自全式金生物技术有限公司），然后在含有氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB（生工生物工程 (上海 )有限公司）平板上筛选具有抗性的阳性表达菌，获得S-雌马酚产生工程菌。
具体操作步骤如下：首先将载体pETDuet-1线性化，即使用内切酶Bgl II（宝生物工程(大连)有限公司）和Kpn I（宝生物工程(大连)有限公司）双酶切质粒，利用胶回收试剂盒（生工生物工程 (上海 )有限公司）将酶切产物回收。使用闪电克隆试剂盒（购自北京博奥龙免疫技术有限公司）将带有Bgl II和Kpn I酶切位点的E-dgr基因克隆至线性化的载体pETDuet-1上，连成环状重组质粒pETDuet-1-dgr；其次，将重组质粒pETDuet-1-dgr作为载体进行线性化，即使用内切酶BamH I（宝生物工程(大连)有限公司）和Hind III（宝生物工程(大连)有限公司）对质粒进行双酶切，利用胶回收试剂盒回收酶切产物，使用闪电克隆试剂盒将带有BamH I和Hind III酶切位点的E-tdhdr整合基因克隆至线性化的载体pETDuet-1-dgr上，连成环状重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr；然后，采用热激法（42℃水浴90s）将质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr转化到大肠杆菌克隆宿主菌Trans 109（购自全式金生物技术有限公司）中，在含有氨苄青霉素 (100 μg/mL) 、IPTG(24 μg/mL)和X-gal(40 μg/mL)的LB固体平板上筛选阳性克隆，获得克隆菌，送该克隆菌株到北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序，对测序正确的菌株接种至LB培养基，37℃培养过夜后，8000 rpm离心3 min后收集菌体，使用质粒提取试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr，取5 μl重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr溶液热激转化大肠杆菌表达宿主菌BL21（DE3）（购自全式金生物技术有限公司），然后在含有氨苄青霉素(100 μg/mL)的LB平板上筛选具有抗性的阳性表达菌，获得S-雌马酚产生工程菌，所构建三基因共表达重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr的图谱如图1所示。
载体线性化酶切体系：10× QuickCut Buffer 5 μl; Bgl II(或BamH I)和KpnI（或Hind III）各1 μl；载体质粒6 μl；灭菌蒸馏水补足50 μl。
酶切条件：37℃水浴15 min。
3、S-雌马酚产生工程菌的验证
（1）酶切法验证
为验证扩增出来的两个基因（E-dgr基因和E-tdhdr）是否成功克隆到质粒上，将该工程菌接种至LB培养基，37℃培养过夜后，8000 rpm离心3 min后收集菌体，提取质粒，提取方法按照试剂盒说明书操作，采用酶切后电泳的方法进行检测，每个试验组均以空质粒pETDuet-1酶切结果做对照，结果如图2A所示。
酶切体系：
1）10× QuickCut Buffer 5 μl; Bgl II和Kpn I各1 μl；pETDuet-1-dgr-tdhdr重组质粒6 μl；灭菌蒸馏水补足50 μl。
2）10× QuickCut Buffer 5μl; BamH I和Hind III各1 μl；pETDuet-1-dgr-tdhdr重组质粒6 μl；灭菌蒸馏水补足50 μl。
3）10× QuickCut Buffer 5 μl; Bgl II、BamH I、Kpn I和Hind III各1 μl；pETDuet-1-dgr-tdhdr重组质粒6 μl；灭菌蒸馏水补足50 μl。
酶切条件：37℃水浴15 min。
从图2A可以看出该工程菌中含有2条与dgr和tdhdr整合基因大小相一致的电泳条带，说明已经成功的将这2个基因克隆至大肠杆菌表达宿主菌 BL21(DE3)中。
（2）SDS-PAGE电泳验证
工程菌蛋白提取：取1 mL工程菌的菌液，使用细菌细胞蛋白裂解液 (生工生物工程 (上海 )有限公司)提取细菌全蛋白，结果如图2B所示。
蛋白质电泳 ：使用5％的浓缩胶，12%分离胶，150V电泳80 min。
（3）功能验证
为验证获得的S-雌马酚产生工程菌是否具有转化黄豆苷原生成S-雌马酚的能力，将S-雌马酚产生工程菌从LB固体平板上挑到2 mL含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB液体培养基中，摇床转数为120 rpm，37℃培养12 h后，获得种子液，用于接种。
将底物黄豆苷原和氨苄青霉素加入到盛有2 mL LB培养基的试管中，使得黄豆苷原的终浓度为25.4 mg/L，氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL。然后将种子液以体积浓度10%的接种量进行接种，摇床转数为120 rpm，37℃培养24 h后，获得发酵液。
1）高效液相色谱法（HPLC）检测产物生成情况
取发酵液100 μl至1.5 mL EP管中，加入500 μl乙酸乙酯充分震荡混匀，常温8000rpm离心10 min，取400 μl上清液至另一1.5 mL EP管中，使用旋转蒸发仪将上清液蒸干，加入80 μl无水甲醇溶解，并过孔径为0.45 μm的有机膜后备用，该溶液用于HPLC检测，以黄豆苷原、二氢黄豆苷原、外消旋体雌马酚标准品（购自美国Indofine公司）为对照。结果如图3A、图3B、图3C所示。
高效液相色谱条件：
液相色谱系统：美国Waters公司，1525型双泵，2487 UV检测器；色谱柱：KromasilC18分析柱（5 μm，250 mm×4.6 mm）；流动相：A液为10%乙腈-0.1%冰乙酸水溶液，B液为90%乙腈-0.1%冰乙酸水溶液，梯度洗脱：0-8 min ：A：B=70:30，15 min：A：B=50:50，20 min：A：B=70:30；检测波长：270 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μl。
如图3A、图3B、图3C的HPLC检测结果可以看出，雌马酚标准品的高效液相保留时间为15.18 min；本发明构建的工程菌发酵液中在保留时间15.11 min也检测到一物质峰，该物质峰在280 nm有最大紫外吸收，这恰与雌马酚的紫外吸收图谱完全一致。通过高效液相保留时间和图3D紫外吸收图谱将工程菌代谢底物黄豆苷原后生成的产物初步鉴定为雌马酚。
2）质谱法对发酵液中的产物进行准确结构鉴定
收集工程菌发酵液中保留时间在15.11 min的产物峰，蒸干后用于质谱分析，结果如图4所示。发现其 [M+H]+为243，因而，发酵液中产物的分子量应为242，这恰与雌马酚（C15H14O3）的分子量一致。
因此，根据高效液相保留时间、紫外吸收光谱和质谱，将工程菌代谢底物黄豆苷原后产生的产物准确鉴定为雌马酚。
3）手性高效液相检测对发酵液中的产物进行构型鉴定
为确定工程菌所产生的产物雌马酚的绝对立体构型，将工程菌转化底物黄豆苷原的发酵液中的雌马酚峰接出，蒸干后加100%甲醇，以化学合成的外消旋体雌马酚标准品为对照，用手性高效液相色谱检测工程菌合成的雌马酚出峰情况，结果如图5A和图5B所示。
从图5A和图5B可以看出，发酵液中的雌马酚在手性高效液相中的保留时间与S-雌马酚一致，化学合成的雌马酚所出现的两个峰的绝对立体构型判断是根据本实验室以前发表的文献（Wang et al, AEM2005）。
手性鉴定高效液相色谱条件：
手性液相色谱系统：美国Waters公司，1525型双泵，2487 UV检测器；色谱柱：SumiChiral OA-7000手性分析柱（5 μm，250 mm x 4.6 mm）；流动相：40%乙腈-60% KH2PO4溶液（20 mM）；检测波长：280 nm；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μl。
实施例3：S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成中的应用
1、S-雌马酚产生工程菌的种子液制备；
将S-雌马酚产生工程菌从LB固体平板上挑到2 mL含有氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB液体培养基中，摇床转数为120 rpm，37℃培养12 h后，获得种子液，用于接种。
2、转化用培养基和转化条件
（1）转化用培养基1：取LB固体培养基粉末2.5 g，用100 mL pH值为6.5的PBS缓冲液溶解，分装成2 mL/管，121℃高温高压灭菌15 min待用。
转化用培养基2：向100mL蒸馏水中加入研碎的黄豆粉1.5 g，80 ℃水浴1 h，冰箱中静置过夜，取出上清即为豆粉浸液，加入pH值为7.0的磷酸缓冲盐，即22.21 g/L Na2HPO4和5.93 g/L NaH2PO4，完全溶解后分装成2 mL/管。115 ℃下灭菌15 min后加入过滤除菌的乳糖或山梨醇（终浓度1.0% w/v），得豆粉浸液培养基，即培养基2。
（2）转化条件1：将种子液以体积浓度10%的接种量接种到转化用培养基1中，同时加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，摇床转数为120 rpm，37℃培养10 h后，向培养液中加入山梨醇（终浓度1.0% w/v）、柠檬酸（终浓度2 g/L）和不同浓度的底物黄豆苷原（25 mg/L，50 mg/L，75 mg/L，100 mg/L，125 mg/L，150 mg/L），继续培养2 h，向培养液中加入氯霉素（终浓度85 μg/mL），37℃继续培养48 h后，采用上述HPLC条件检测S-雌马酚的生成量。
转化条件2：将种子液以体积浓度10%的接种量接种到转化用培养基2中，同时加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，摇床转数为120 rpm，37℃培养72 h后，采用上述HPLC条件检测S-雌马酚的生成量。
雌马酚产生工程菌对底物的转化情况用底物的转化率表示，转化率（%）=产物浓度（mg/L）/ [产物浓度（mg/L）+ 剩余底物浓度（mg/L）]×100%。转化率越高代表底物转化的越彻底，转化效率越高。
如图6结果表明，本发明所构建的工程菌能够转化底物黄豆苷原的最大浓度为100mg/L，S-雌马酚转化率为49.48%，产生二氢黄豆苷原的浓度为34.30 mg/L，S-雌马酚的浓度为34.27 mg/L。如图7结果显示，本发明所构建的工程菌能够转化豆粉浸液中的黄豆素，生成S-雌马酚和部分二氢黄豆苷原。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北农业大学
<120> 爱格氏菌、S-雌马酚产生工程菌及其构建方法和应用
<130> 2016
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1935
<212> DNA
<213> 爱格氏菌（Eggerthella sp.）
<400> 1
atgaagaaca agttctatcc gaagaccttc gagcgcggct acatcggtaa cctagaggtc 60
gagaaccgag cgatccgcat gccgatgggc accgagctgg gcaacccgga cggctctccc 120
agctgggcct ccctcaaggc gtacgctgag gctgccgacg gtggaaccgg catcgtgttc 180
atggacaacg ctggcgtgac ccagttccac catgtcggac tgtccctggc cagcgacaac 240
tacatcggcc ccatgtccgt cctcgcaaag accatcaagc agcacggggc catccccggc 300
ctgcagatcg tccacccggg ccgcgacgcg gcgttcgtgc gcggtgacga cctgatctcc 360
tcttcccgca tccagtggga gccctggtac gagaacggcg gcgctgttcc ccgcgagctc 420
accatcgagg agatccacga cttcgtcggt tacttcggcg actgcgcact ccgcgcgcag 480
accgcgggct tcgaaatcgt cgacgtccac gcggcatgcg gcgtcctgct gagcaacttc 540
ctctcgccgc gcaacaacac ccgcaacgac atgtacggcg gaagcctgca caaccgcgcc 600
cgcttcctgc tcgaggtcat ccgcgacatc aagaagaagt gccccaacct cccgctggct 660
atccgactct ccggcatcga cttcgaaccg ggcggcatca ccatcgagga gacctgcgag 720
gtcgccaaga tgtgcgaggc agccggtgcg gacgccatca acatcacctg gggttcccat 780
gcagaggtca taaacgcggc cggcctgctc tccaagcacg gcgccaacca cgtcgaggca 840
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cccgagatcg gcgagaagct gctcgaggac ggcgtctgcg acttcatcgg catcggcaag 960
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aggccctgca tcggttgcgg cgtcggctgc catgaccgcg gcatgctctc cggcggcgtc 1080
gtccagtgcg ccgtcaacgc ggctctgtac aagttcgacg aactcgtcta cccgcaggct 1140
gaggttccca agaaggtcat catcatcggc gcaggccccg ctggctgcga ggctgccatc 1200
accgcgaaga agtgcggcca tgacgtcacc atctacgaga agcgcaagat cggtggcgtt 1260
ctgaaggagg ctaccgtctc cgacagcaag gaggacctcg gccgcctcat cacctactac 1320
gagacccagc tcaagaagaa gggcatcgag gtcatctacg aggaggccac tgcagacacc 1380
gttgtagccg gcggcttcga cgtcgccatc gtcgcctgcg gcgccaccgt gcgcaacctc 1440
aacatcgacg gccaggacga cccctccgtc gtgtacgcga tggacttcct ggacaacgac 1500
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ttcttcgtcc ccggcgtcat gggcatcgcc tacatggttc gcctgggtat ggcgggagtc 1680
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ggctgcaacc tgtag 1935
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<400> 4
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tctgcagcgc tgatcgccgc ccgtgagggc aagcgcgtcg tggtgctcga gaagatgccc 120
gagaccggag gtctctccat gtacgccgaa ggcaccgctg ccttcgagtc ctctattcag 180
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gagaagttca tgggctacag ccatcagcgc gcgaactacg acgtcgtccg cgctttcgtt 300
gagaactccg cagagaccat cgacatctac cgcgacctcg gcgtcgtcta caaggcctgc 360
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acctccaccc ccgccaagga gctcatcatc gaggaaggcg ctgtcgtcgg tgtcgtcgca 540
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Claims (10)
1.一种爱格氏菌（Eggerthella sp.）HAU-JLC44，保藏号为CGMCC No.12354。
2.如权利要求1所述的爱格氏菌HAU-JLC44在S-雌马酚合成中的应用，其特征在于：爱格氏菌HAU-JLC44在厌氧条件下将底物黄豆苷原转化为S-雌马酚。
3.如权利要求1所述的爱格氏菌HAU-JLC44在S-雌马酚合成中的应用，其特征在于：用爱格氏菌HAU-JLC44基因组DNA作模板，克隆雌马酚生物合成基因，构建S-雌马酚产生工程菌，并用S-雌马酚产生工程菌合成S-雌马酚。
4.一种S-雌马酚产生工程菌，其特征在于，所述S-雌马酚产生工程菌为大肠杆菌（Escherichia coli），是用爱格氏菌HAU-JLC44的基因组DNA作模板，克隆雌马酚生物合成基因，构建而成，命名为S-雌马酚产生工程菌HAU-JLC44，保藏号为CGMCC No.12353。
5.如权利要求4所述的S-雌马酚产生工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）从如权利要求1所述的爱格氏菌HAU-JLC44中克隆参与雌马酚合成的三个转化酶基因：黄豆苷原还原酶E-dgr、二氢黄豆苷原还原酶E-dhdr和四氢黄豆苷原还原酶E-thdr；所述E-dgr、E-dhdr和E-thdr的核苷酸序列如SEQ. ID. NO:1、SEQ. ID. NO:2和SEQ. ID. NO:3所示；基因E-dhdr和E-thdr之间有145 bp非编码区核苷酸序列，将基因E-dhdr、基因E- thdr和这两个基因中间的145 bp非编码区序列按一个基因克隆下来，将其命名为整合基因E-tdhdr，整合基因E-tdhdr含有两个开放读码框，所述整合基因E-tdhdr的核苷酸序列如SEQ. ID. NO:4所示；
（2）提取爱格氏菌HAU-JLC44的基因组DNA，设计引物将E-dgr和E-tdhdr两个基因用PCR法扩增下来，在基因E-dgr的N端和C端分别加上Bgl II和Kpn I酶切位点，在整合基因E-tdhdr的N端和C端分别加上BamH I和Hind III酶切位点；
（3）将带有Bgl II和Kpn I酶切位点的基因E-dgr，克隆至用Bgl II和Kpn I酶切过的T7双启动子共表达质粒pETDuet-1上，得到重组质粒pETDuet-1-dgr；
（4）将带有BamH I和Hind III酶切位点的整合基因E-tdhdr，克隆至用BamH I和HindIII酶切过的重组质粒pETDuet-1-dgr上，得到重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr；
（5）将重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr转入大肠杆菌Trans 109，得克隆菌，送测序公司进行测序；
（6）将重组质粒pETDuet-1-dgr-tdhdr从测序正确的克隆菌中提取出来，转化大肠杆菌BL21（DE3），获得S-雌马酚产生工程菌。
6.根据权利要求5所述的S-雌马酚产生工程菌的构建方法，其特征在于， 步骤（2）中扩增E-tdhdr和E-dgr两个基因设计的引物的序列如下：引物1的上、下游序列如SEQ. ID. NO:5和SEQ. ID. NO:6所示；引物2的上、下游序列如SEQ. ID. NO:7和SEQ. ID. NO:8所示。
7.如权利要求4所述S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成中的应用，其特征在于包括以下步骤：
a、S-雌马酚产生工程菌的种子液制备；
b、催化底物黄豆苷原转化生成S-雌马酚；
c、催化豆粉浸液中的黄豆素转化生成S-雌马酚。
8.根据权利要求7所述的S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成中的应用，其特征在于，步骤a包括以下步骤：使用LB液体培养基，加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，摇床转数为120 rpm，37℃培养12 h后，获得种子液，用于接种。
9.根据权利要求7所述的S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成中的应用，其特征在于，步骤b包括以下步骤：取LB固体培养基粉末2.5 g，用100 mL pH值为6.5的PBS缓冲液溶解，分装成2 mL/管，121℃高温高压灭菌15 min，得到培养基1，待用；将步骤a中的种子液以体积浓度10%的接种量接种到培养基1中，同时加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，摇床转数为120 rpm，37℃培养10 h后，加入山梨醇至终浓度为1.0% w/v、加入柠檬酸至终浓度为2g/L和加入100 mg/L的底物黄豆苷原，继续培养2 h后，加入氯霉素至终浓度为85 μg/mL，37℃继续培养48 h后，通过高效液相色谱HPLC检测S-雌马酚的生成量。
10.根据权利要求7所述的S-雌马酚产生工程菌在S-雌马酚合成中的应用，其特征在于，步骤c包括以下步骤：向100 mL蒸馏水中加入黄豆粉1.5 g，80 ℃水浴1 h，冰箱中静置过夜，取出上清液即为豆粉浸液，加入pH值为7.0的磷酸缓冲盐，即22.21 g/LNa2HPO4和5.93g/L NaH2PO4，完全溶解后分装成2 mL/管；115℃下灭菌15 min后加入过滤除菌的乳糖或山梨醇至终浓度为1.0% w/v，得培养基2；将步骤a中的种子液以体积浓度10%的接种量接种到培养基2中，同时加入终浓度为100 μg/mL的氨苄青霉素，摇床转数为120 rpm，37℃培养72h后，通过高效液相色谱HPLC检测S-雌马酚的生成量。
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