MX2007011631A - Desmetilacion enzimatica de favonoides. - Google Patents

Abstract

La invencion describe la desmetilacion de 5-metoxiflavonoides por enzimas bacterianas, el uso de estas enzimas en la produccion de fitoestrogenos in vitro y en composiciones farmaceuticas en combinacion con una fuente de 5-metoxiprenilflavonoides metilados (ver formula).

Description

DESMETILACION ENZIMATICA DE FLAVONOIDES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con fitoestrógenos y su preparación así con compuestos farmacéuticos y suplementos alimenticios los cuales incluyen dichos fitoestrógenos.

ANTECEDENTES El lúpulo (Humulus lupulus, L.) se ha utilizado durante siglos como una materia prima esencial en la fermentación de cerveza proporcionándole la amargura y el sabor a la cerveza. En los últimos años, la planta ha adquirido atención cada vez mayor como una fuente de prenilflavonoides, una subclase de flavonoides que contienen una cadena lateral prenilo apolar unida a uno de los anillos fenólicos. Estos están presentes en las glándulas de lupulina que se encuentran en la base de los bracteolos en los conos de lúpulo de la planta hembra. De estos prenilflavonoides dos calconas (xantohumol (X) y desmetilxantohumol (DMX)) y tres flavononas (isoxantohumol (IX) , 8-prenilnaringenina (8-PN) y 6-prenilnaringenina (6- PN) ) (figura 2) ahora reciben mucha atención debido a sus potenciales propiedades promotoras de salud. Se ha identificado a X como un agente quimiopreventivo de cáncer poderoso, mientras que se ha demostrado que 8-PN es uno de los fitoestrógenos más potentes identificados hasta ahora, con una actividad considerablemente mayor que los bien conocidos fitoestrógenos de soya. Se ha demostrado que 8-PN muestra actividad estrogénica in vivo, evita la pérdida ósea en ratas, inhibe la angiogénesis y metástasis y se ha demostrado que presenta actividad antiandrogénica. El santohumol (X) está presente como la prenilalcona predominante en conos de lúpulo hembra en concentraciones de hasta 1% (p/p) mientras que DMX está presente en concentraciones menores (De Keukeleire et al . (2003) J. of Agrie , and Food Chem. 51 , 4436-4441) . La relación X/DMX difiere entre las variedades de lúpulo.

Mediante isomerización, X se transforma en IX y DMX se convierte en 8-PN y 6-PN. Los efectos estrogénicos de los lúpulos se han reconocido durante décadas. Se han utilizado baños de lúpulo para el tratamiento de trastornos ginecológicos y alteraciones menstruales entre las recogedoras de lúpulo del género femenino que se han reportad comúnmente. En 1999, Milligan et al. [J". Clin . Endocrinol . Metab. 84, 2249-2252] , identificaron un fitoestrógeno novedoso en el lúpulo, 8-prenilnaringenina. Aunque es mucho débil que 17ß-estradiol (< 1%) , es uno de los fitoestrógenos más potentes identificados hasta ahora, con una actividad - considerablemente mayor que otros fitoestrógenos tales como los compuestos derivados de soya genisteina y daidzeína. Se ha cuestionado si la exposición en la dieta o el ambiente a fitoestrógenos puede generar riesgos a la salud tal como interrupción endocrina. En el caso de los prenilflavonoides de lúpulo la cerveza es la fuente alimenticia principal. El consumo promedio de cerveza en los Estados Unidos se calcula que es de aproximadamente 225 ml de cerveza per capita al día en 2001 (USDA, 2003) . Cuando se supone que esta cantidad ha sido consumido como una de las marcas de cerveza lager/pilsner principales en Estados Unidos (500-1000 µg de prenilflavonoide/1 de cerveza) , la ingestión diaria de prenilflavonoides sería de aproximadamente 0.14 mg . No obstante, las concentraciones detectadas en la cerveza (y por lo tanto lá ingestión promedio) dependen en gran medida del proceso de fermentación y las cervezas fuertes tipo ales contienen hasta 4 mg de prenilflavonoides/1. Aunque X es el prenilflavonoide predominante presente en lúpulo (0.1-1% de peso seco) , la mayor parte del mismo se transforma en IX por isomerización térmica durante la ebullición del mosto. Por lo tanto, IX es el prenilflavonoide principal encontrado en cerveza y está presente en concentraciones de 500 µg/l (tipos lager/pilsner) hasta 4 mg/l (cerveza fuerte tipo ale) . De manera similar, DMX se convierte en 8-PN lo - que resulta en concentraciones finales de cerveza de hasta 100 µg de 8-PN/l. Pero pese a la alta actividad de 8-PN, la actividad estrogénica total en la cerveza aún es 500-1000 veces menor que la concentración necesaria para actividad in vivo peligrosa (~100 mg/l) (Milligan et al., (2002) Reproduction 123, 235-242). Además muchas cervezas ahora hacen uso de extractos de lúpulo en vez de lúpulos completos, lo que genera concentraciones menores de 8-PN o una carencia total de 8-PN. Por lo tanto, se ha acordado generalmente que, en base en el conocimiento actual, no se pueden atribuir efectos perjudiciales a la salud a los fitoestrógenos ante un consumo moderado de cerveza. Por otra parte, muchos datos ahora se relacionan con la ingestión intencional de fitoestrógeno con posibles beneficios en la salud (Magee & Rowlan (2004) Br. J. Nutr. 91, 513-531) . Además de la cerveza se comercializan suplementos alimenticios basados en lúpulo que afirman tener efectos como mejoramiento de mama y reducción de bochornos. En general, los efectos en la salud de los fitoestrógenos resultan potencialmente de la acción de una combinación de muchas sustancias fitoquímicas individuales con actividades múltiples y posiblemente aditivas o de interferencia. Hasta ahora únicamente las isoflavonas y los lignanos se consideran fitoestrógenos relevantes en la dieta de los humanos, especialmente debido a que las concentraciones de 8-PN en cerveza se consideran demasiado bajas para efectos positivos o negativos en la salud. Varias publicaciones de patente describen los efectos benéficos en la salud de los flavonoides en la dieta, por ejemplo el uso de IX para evitar disminución de la densidad ósea ( O04089359) , el uso de extractos de lúpulo en medicamentos que tienen propiedades estrogénicas ( O02085393) y el uso de IX o X en productos alimenticios que afirman tener propiedades antiinflamatorias o contra el envejecimiento (patente O03090555) . Además también se ha sugerido el uso de 8-PN en cosméticos para el tratamiento de la piel (CA2426467) . Con el fin de ejercer los efectos in vivo reclamados in vitro, los flavonoides en la dieta necesitan absorberse desde el intestino y llegar a sus objetivos sin cambio. En general, los flavonoides monoméricos pasan sin modificación a través del estómago al intestino delgado en donde se lleva a cabo la absorción desde el intestino a la circulación mesentérica. Los estudios in vitro indican una biotransformación extensa en hígado de X (Yilmazer et al . (2001a) FEBS Lett . 491, 252-256) y 8-PN (Nikolic et al . (2004) Drug Metabolism and Disposi tion 32, 272-279) cuando se absorbe. No obstante, el grado de absorción de polifenol en la dieta en el intestino delgado es más bien limitado (10-20%) lo que implica que una gran proporción de los flavonoides llegan al colon. La naringenina, un análogo no prenilado de 8-PN muestra biotransformación microbiana intensa en el intestino, que incluye ruptura del anillo y deshidroxilación (Rechner et al. (2004) Free Radie . Biol . Med. 36, 212-225), seguido por absorción y excreción urinaria. Se sabe poco acerca de las transformaciones intestinales de los prenilflavonoides . Nookandeh et al . (2004) Phytochemistry 65, 561-570, dosificaron 1000 mg/kg de peso corporal de X a ratas y aislaron 22 metabolitos de las heces. La mayor parte (89%) de los flavonoides recuperados, no obstante, era X sin cambio. La fracción remanente consistía de cantidades pequeñas de metabolitos diferentes que incluyen parte de IX. Avula et al . , (2004) [ ". Chromatogr. Sci . 42:378-382] realizaron un experimento similar con ratas y detectaron X principalmente sin cambio además de muchos metabolitos no identificados. La posibilidad de IX pueda actuar como un proestrógeno se consideró por Coldham et al. (2002) Food Addi t . Contam. 19:1138-1147. La suposición se basa en la extensa capacidad de biotransformación del hígado, el cual incluye desmetilación. No obstante, la exposición de IX a microsomas hepáticos no generó ningún incremento en la actividad estrogénica, a partir de lo cual se concluyó que no se produce 8-PN. En contraposición, Nicolic et al., describieron que los microsomas hepáticos pueden desmetilar IX, pero no X (Nikolic et al . (2005) J". of Mass Spectrom. 40, 289-299) . No obstante, se ha demostrado que, además de la desmetilación, los microsomas también modifican la cadena lateral prenilo, lo que finalmente resulta en una variedad grande de productos de degradación menores. Schaefer et al. (2003) (J*. Steroid Biochem . Mol . Biol . 84 , 359-360) identificaron bajas concentraciones de 8-PN en orina después de ingestión oral de IX por dos pruebas en personas y atribuyeron esta desmetilación al hígado. Además del hígado, el colon también es un sitio importante de transformación en el cuerpo humano. El colon humano contiene ~1012 microorganismos/cm3 (aproximadamente 400 especies diferentes) con un enorme potencial catalítico e hidrolítico. La importancia de esta comunidad microbiana en el metabolismo de fitoestrógenos en general ha sido establecida con claridad. Wang et al. (2000) Chem. Pharm . Bull . 48, 1606-1610, identificaron dos bacterias responsables de la transformación de lignanos y Decroos et al . (2005) Arch . Microbiol . 183 , 45-55, recientemente aislaron un consorcio microbiano capaz de transformar el fitoestrógeno de soya daidzeina en equol . Además se ha demostrado que varias bacterias intestinales incrementan la biodisponibilidad de fitoestrógenos dado que poseen ß-glucosidasas las cuales son necesarias para la hidrólisis de los glucósidos de fitoestrógeno (Rowland et al. (2003) Br. J. Nutr 89, S45-S58) . Por lo tanto, la microbiota intestinal se considera como un factor de importancia para la biodisponibilidad de fitoestrógeno (Turner et al. (2003) Nutr. .Rev. 61, 204-213) . Dado que únicamente el aceite esencial y los a-ácidos presentes en los conos de lúpulo hembra son de interés económico como ingredientes importantes en cervecería, los diferentes métodos de extracción de lúpulo los cuales se han desarrollado tienen como objetivo extraer específicamente solo estos compuestos. Por una parte, actualmente C02 es el solvente más aceptado para la elaboración de extractos de lúpulo (Palmer & Ting (1995) Food Chem 52, 345-352). En comparación con los procedimientos que utilizan solventes orgánicos convencionales (etanol, hexano, metanol o cloruro de metileno) , la extracción con C02 proporciona extractos más selectivos que los que se pueden utilizar para la producción de cervezas como una buena alternativa para lúpulos completos o pellas de lúpulo. Los extractos de C02 forman la base de una gran cantidad de productos adicionales derivados y purificados tales como iso- -ácidos y derivados reducidos. Otro procedimiento para purificación adicional de extracto de C02, por separación de prenilflavonoides no deseados se describe en la patente de E.U.A. US3794744- Por otra parte se han desarrollado procedimientos diferentes para recuperar y purificar específicamente prenilflavonoides (principalmente X) . Los ejemplos de estos métodos de extracción se describen en la patente de E.U.A. 4121040 y la patente Alemana DE19939350. Dado que el xanthohumol se puede recuperar fácilmente utilizando estos procedimientos se ha mostrado poco interés en desarrollar un procedimiento para sintetizar químicamente X. No obstante, 8-PN es más difícil de recuperar a partir de extractos naturales debido a las bajas concentraciones presentes en el cono de lúpulo. Por lo tanto se han desarrollado estrategias de síntesis para producir 8-PN por prenilación de la naringenina disponible comercialmente. En primer lugar, se produce 8-PN por C-prenilación directa no selectiva de bajo rendimiento de naringenina o a partir de floroacetofenona. La síntesis química eficaz a pequeña escala se obtiene por rearreglo de Claisen catalizado por europio(III) (Gester et al., (2001) Tetrahedron 57, 1015-1018) . Recientemente se ha descrito en la patente Europea EP1524269 la producción a escala industrial basada en este método. Pese al uso industrial ampliamente diseminado de lúpulo y extractos de lúpulo no existe un método eficaz para la producción de fitoestrógenos prenilados bioactivos tales como 8-PN a partir de una fuente natural.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la presente invención es proporcionar un método eficaz para la producción de fitoestrógenos prenilados bioactivos tales como 8-PN a partir de 5-alcoxiflavonoides los cuales se pueden obtener a partir de una fuente natural así como compuestos farmacéuticos y suplementos alimenticios que utilicen dichos fitoestrógenos prenilados bioactivos. En un primer aspecto, la presente invención proporciona composiciones que tienen actividad de 5-alcoxi-flavonoides-transferasa (5-AO-FT) o 6 ' -alcoxi-calcona-transferasa (6'-AO-CT). De manera más particular la invención proporciona composiciones que tienen actividad de 5-metoxi-flavonoide-metiltransferasa (5-MO-FMT) o 6'-metoxi-calcona-metiltransferasa (6'-MO-CMT). Una modalidad adicional de la presente invención se relaciona con composiciones capaces de desalquilar 5-alcoxi-flavonoides prenilados o 6 ' -alcoxi-calconas preniladas. Una modalidad específica de la invención proporciona composiciones capaces de desalquilar la 6' -alcoxi-calcona xanthohumol (X) o 5-alcoxi-flavonoide isoxanthohumol (IX) . Las composiciones de la presente invención por lo tanto son capaces de producir fitoestrógenos bioactivos, de manera más particular fitoestrógenos prenilados, de manera más particular 8-PN.

De acuerdo con una modalidad particular, la composición que tiene actividad desalquilante de 5-alcoxi-flavonoide o 6 ' -alcoxi-calcona son composiciones que comprenden o que se derivan de material de origen no animal, más particularmente de origen procariótico. Más particularmente, las composiciones de la invención comprenden células bacterianas o extractos, sobrenadante u otro material purificado o semipurificado de dichas células bacterianas. Una modalidad específica de la presente invención se relaciona con una composición que comprende una bacteria homoacetogénica tal como el género fíujacterium o el género Peptostreptococcus , de manera más particular Eubacterium limosum o Peptostreptococcus produc tus , o extractos, sobrenadantes u otro material purificado o semipurificado de los mismos. Otra modalidad particular de la invención comprende cepas o composiciones bacterianas que comprendan células, extractos, sobrenadante u otro material purificado o semipurificado del mismo del cual se haya enriquecido la producción de la actividad de 5 -alcoxi- flavonoide-transferasa (5-AO-FT) o 6 ' -alcoxi-calcona-transferasa (6'-AO-CT) , de manera más particular por incubaciones repetidas con un 5 -alcoxiflavonoide tal como 5-metoxi prenilflavonoide . Otra modalidad particular de la invención - - comprende composiciones que comprenden 5-metoxi- (prenil) flavonoide metiltransferasa o 6' -metoxi- (prenil) calcona metiltransferasa a partir de una cepa bacteriana homoacetogénica, más particularmente del género Eubacterium, más particularmente de Fujbac erium limosum. Una modalidad particular de las composiciones de la presente invención se relaciona con composiciones que comprenden una actividad enriquecida de 5-alcoxi-flavonoide-transferasa (5-AO-FT) o 6' -alcoxi-calcona-transferasa (6'-AO-CT) derivada de la cepa bacteriana Eujbacteri.um limosum depositada en la recolección de micoorganismos coordenada Belga (BCCM) en la colección BCCM/LMG con el número de depósito LMG P-23546. En un aspecto adicional, la presente invención proporciona métodos para la producción de fitoestrógenos que comprende desalquilar 5 -alcoxi-flavonoides en la posición 5 o para desalquilar 6 ' -alcoxicalconas en la posición 6' correspondiente, caracterizado porque se realiza in vitro utilizando material eucariótico o procariótico no animal. En una modalidad específica, los métodos se utilizan para la producción de 8-PN. De acuerdo con una modalidad particular, la desalquilación en los métodos de la invención es una desmetilación y se realiza utilizando material eucariótico o procariótico no animal. Más particularmente, el material no animal es una cepa bacteriana o un material de una cepa bacteriana, más particularmente de una bacteria homoacetogénica o fracciones purificadas o parcialmente purificadas o componentes de los mismos, tales como enzimas parcialmente purificadas o aisladas. Una modalidad específica se relaciona con la desalquilación utilizando material del género Eu-acterium o del género Peptostreptococcus, tal como Eubacterium limosum. Las modalidades específicas adicionales del método de la invención incluyen métodos para desalquilar 5-alcoxi-flavonoides prenilados o 6 ' -alcoxi-calconas preniladas. De acuerdo con una modalidad específica adicional se proporciona métodos para la desalquilación de 5-alcoxi-flavonoides o 6-alcoxi-calconas las cuales son de origen vegetal, más específicamente las cuales se originan de lúpulo. De acuerdo con modalidades particulares se proporcionan métodos para la desalquilación de 6' -alcoxi-calcona, xanthohumol o 5-alcoxi-flavonoide, isoxanthohumol . Un aspecto adicional de la invención es el uso de una línea de células bacterianas para la desalquilación in vitro de 5-alcoxi- flavonoides o 6 ' -alcoxi-calconas, de manera más particular para la desmetilación de 5-metoxi-flavonoides o 6' -metoxi-calconas . De manera más específica, las células bacterianas son células de una cepa bacteriana homoacetogénica, tal como Eubacterium limosum. Una - - modalidad específica adicional es el uso de células bacterianas en las cuales se ha incrementado la producción de 5 -alcoxi- flavonoide-transferasa (5-AO-FT) o 6' -alcoxi-calcona-transferasa (6'-A0-CT), por ejemplo por incubaciones repetidas con 5-alcoxiflavonoide tal como 5-metoxi prenilflavonoide . Un aspecto adicional de la invención proporciona métodos para producir fitoestrógenos in vitro el cual comprende las etapas de: a) proporcionar una cepa bacteriana de una bacteria, más particularmente una bacteria homoacetogénica o extractos de la misma, y b) poner en contacto una composición que comprende 5-alcoxi-flavonoides, de manera más particuar 5-metoxi-flavonoides o 6' -alcoxi-calconas, más particularmente 6 ' -metoxi-calconas con la cepa bacteriana y un extracto del mismo de manera que permita la desalquilación de los 5-alcoxi-flavonoides o 6' -alcoxi-calconas por la cepa bacteriana o extracto de la misma. Opcionalmente, los métodos comprenden además identificar o purificar el flavonoide desalquilado producido. Las modalidades específicas de estos métodos son métodos los cuales incluyen el suministro de un extracto de una cepa bacteriana el cual incluye además la etapa de aumentar la concentración y opcionalmente purificar el extracto bacteriano de manera que contenga actividad 5'alcoxi-flavonoide-transferasa (5-AO-FT) enriquecida o purificada o actividad de 6' -alcoxi-calcona-transferasa (6-AO-CT) enriquecida o purificada. De manera adicional o alternativa, los métodos de la presente invención incluyen la etapa de enriquecer la producción de la cepa bacteriana de la actividad 5-AO-FT o 6'-A0-CT por incubaciones repetidas con 5-alcoxiflavonoide tal como 5-metoxi prenilflavonoide Otro aspecto adicional de la invención proporciona 5-metoxi-prenilflavonoide metiltransferasa o 6' -metoxi-prenilcalcona metiltransferasa de Eubacterium limosum. Otro aspecto adicional de la invención proporciona composiciones farmacéuticas y suplementos alimenticios que comprenden los fitoestrógenos bioactivos obtenidos por los métodos de la presente invención. Otro aspecto adicional de la presente invención proporciona composiciones farmacéuticos y suplementos alimenticios que comprenden dos componentes para administración simultánea o consecutiva, en donde el primer componente comprende bacterias homoacetogénicas o un extracto o componente de las mismas que tienen actividad de 5-alcoxi-flavonoide-transferasa (5-AO-FT) o 6' -alcoxi-calcona-transferasa (6'-AO-CT) y el segundo componente comprende 5-alcoxiflavonoides o 6' -alcoxicalconas o una - fuente de las mismas tal como extracto de lúpulo . De acuerdo con modalidades particulares, el flavonoide es 6'-alcoxicalcona xanthohumol o 5-alcoxi-flavonoide isoxanthohumol . Las modalidades particulares adicionales se relacionan con composiciones farmacéuticas y suplementos alimenticios de acuerdo con la invención en donde la bacteria homoacetogénica es Eujbac eriuiT. limosum. Opcionalmente, la bacteria en la composición farmacéutica de la invención se proporciona en una formulación para suministro específico o en el colon. La presente invención describe que IX se puede desmetilar en 8-PN por organismos vivos no animales tales como bacterias de humanos o animales, especialmente vertebrados o mamíferos, en el intestino y que IX por lo tanto puede actuar como proestrógeno . La presente invención identifica adicionalmente microorganismos capaces de realizar la conversión de IX en 8-PN, por ejemplo la producción in vitro de 8-PN utilizando cultivos de dichos micoorganismos . Adicionalmente, la presente invención proporciona métodos para la selección de otras cepas capaces de producir cuantitativamente 8-PN a partir de IX. La presente invención demuestra adicionalmente que la conversión de precursores de fitoestrógeno de flavonoide metilados por flora microbiana in vivo es muy variable y depende de la composición de la flora microbiana en el individuo (entre individuos o dentro del mismo individuo en momentos diferentes) . Probablemente esto tenga consecuencias importantes sobre la exposición de los individuos a fitoestrógenos. En realidad, en extractos de lúpulo, en la cerveza y en productos alimenticios o suplementos, IX, el cual es menos estrogénico, está presente en concentraciones mucho más elevadas que 8-PN. Al presentar métodos para la producción de fitoestrógenos activados { in vi tro o in vivo) , la presente invención proporciona adicionalmente una alternativa interesante o complemento a los extractos del lúpulo actuales en la dieta. El rendimiento impredecible de conversión de precursores de fitoestrógenos de flavonoide metilados (por ejemplo IX) en sus compuestos desmetilados activos se puede controlar por preconversión in vitro o por desalquilación in vivo/in si tu . Esto posibilita controlar la exposición al componente activo en cada individuo pese a las diferencias individuales en la microflora intestinal o para que se tomen específicamente estas diferencias en consideración.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se pretende que las figuras ilustren la presente invención pero no deben considerarse que impliquen limitación alguna de la invención a las modalidades que se presentan en este documento. Las figuras ÍA a 1F son estructuras generales de flavonoides . La figura 2 son estructuras de prenilflavonoides de lúpulo y su conversión. La figura 3 es la respuesta de estrógenos (promedio + desviación estándar) de un cultivo fecal (C) incubado con IX (0 y 8 días de incubación) (n=3) . La figura 4 es la transformación de IX (25 mg/l) por cultivos fecales humanos (E-L) en 8-PN después de 3 días [primedio + desviación estándar. (n=3)]. La figura 5 es la conversión de isoxanthohumol (IX) en 8-prenilnaringenina (8-PN) por bacterias intestinales de 51 individuos humanos diferentes. Los individuos se distribuyen por incremento en la producción de 8-PN y los resultados se presentan como media % (+/- SD) de conversión de IX en 8-PN (n=3) . La figura 6 es la conversión de IX (25 mg/l) por P. productus en 8-PN (tres cultivos: Inc I, Inc 2 e Inc3) . Desaparición de IX (símbolos negros) y producción de 8-PN (símbolos blancos) monitoreado durante un período de 13 días . La figura 7 es la conversión de IX en 8-PN después de suplementación de un cutivo de E . l imosum en cultivo B fecal (porcentaje de cultivo de E. limosum desde - 0% (únicamente muestra fecal) hasta 100% (cultivo de E. limosum axénico) ) (n=3) . La figura 8 es la conversión de IX en 8-PN en un simulador del ecosistema microbiano de intestino humano bajo condiciones que permiten la activación de metilflavonoide metilados. El compartimiento PF+ de TWIN SHIME. La figura 9 es la conversión de IX en 8-PN en un simulador del ecosistema microbiano de intestino humano bajo condiciones que no permiten la activación de metilflavonoides metilados.

Definiciones En la presente solicitud se utilizan las siguientes abreviaturas: X : xanthohumol ; DMX: desmetilxanthohumol; IX: isoxanthohumol ; 8-PN: 8-prenilnaringenina; 6-PN: 6-prenilnaringenina; 5-AO-FT: 5-alcoxiflavonoide alquiltransferasa; 5-MO-FMT: 5-metoxi-flavonoide metiltransferasa; 6'-AO-CT: 6' -alcoxicalcona alquiltransferasa; 6'-MO-CMT: 6 ' -metoxi-calcona metiltransferasa; El término "flavonoides" se refiere a un grupo de moléculas orgánicas basadas en una estructura principal de 15 átomos de carbono con un anillo cromano que tiene un segundo anillo aromático B en posición 2, 3 ó 4 (figura ÍA) . La figura ÍA muestra la numeración convencional para sustituyentes en flavonoides, el cual también se utiliza en la presente invención. Los subgrupos de flavonoides son calconas, flavononas, flavonas, flavanoles e isoflavonoides . Las calconas (figura IB) son isómeros de las flavanonas (figura ÍC) . La figura IB y 2 muestran la numeración convencional de las calconas. Las flavanonas difieren de las flavonas (figura ÍE) que carecen de un enlace doble en la posición 2, 3. Las flavonas (figura ÍE) son flavonoides que carecen del grupo 3 -OH de los flavanoles (figura ÍE) . Los isoflavonoides son flavonoides en donde el anillo fenilo B se localiza en la posición 3 (figura 1F) . Todos estos subgrupos tienen una función ceto en la posición 4. El término "prenilflavonoide" , como se utiliza en la presente invención se relaciona con un flavonoide que contiene una cadena lateral prenilo apolar unida a uno de los anillos fenólicos. La cadena prenilo se presenta principalmente en la posición 8 pero también puede estar en la posición 6, o tanto en la posición 6 como en la posición 8 [en las calconas la cadena prenilo se localiza en la posición 3' y/o 5'] . En el lúpulo, los prenilflavonoides se encuentran principalmente en las glándulas de lupulina que se encuentran en la base de los bracteolos en los conos de lúpulo de la planta femenina. Otras fuentes naturales de prenilflavonoides son, por ejemplo Dendrolobium lanceolatum, Sophora flavescens, Sophora tomentosa, Artocarpus communus y Marsallia grandiflora . Los ejemplos de prenilflavonoides son calconas (tales como xanthohumol (X) y desmetilxanthohumol (DMX) , deshidrocicloxanthohumol) y flavanonas (tales como isoxanthohumol (IX) , 8-prenilnaringenina (8-PN) y 6-prenilnaringenina (6-PN) . El término "geranilflavonoides" se relaciona con un flavonoide que contiene una cadena geranilo apolar unida a uno de los anillos fenólicos. Los ejemplos son tetrahidroxi-geranilcalcona, 6-geranilnaringenina, 3'-geranilcalconaringenina y 8-geranilnaringenina. Todos estos compuestos geranilados se han aislado de conos de lúpulo y se ha alegado que 8-geranilnaringenina tiene actividad estrogénica (Milligan et al . (2000) J". Clin . Endocrinol . Metab . 85, 4912-4915) . El término "desalquilación o desmetilación enzimática", como se utiliza en la presente, se refiere a la separación de un grupo alquilo o metilo, respectivamente, de un compuesto mediante el uso de una enzima. El término "5-alcoxidesalquilación" o "5- metoxidesmetilación" , como se utiliza en la presente se refiere a la separación de un grupo alquilo de un grupo alcoxi o un metilo de un grupo metoxi (-OCH3)", respectivamente, que se utiliza en la posición 5 de un flavonoide (para la numeración del anillo véase la figura ÍA) . En este contexto, "5-metoxi" y "5-0-metil-" tienen el mismo significado. El término "5-alcoxi- (prenil) flavonoide transferasa (5-A0- (P) FT) " se refiere a la enzima capaz de asegurar la 5-alcoxi desalquilación de 5-alcoxi- (pernil) flavonoides . Un grupo particular de flavonoides son calconas en donde la numeración del anillo es diferente. Por lo tanto, con respecto a las calconas, la presente invención se relaciona con la separación de un grupo alquilo de un compuesto calcona, de manera más particular 6 '-alcoxi desmetilación, es decir, la separación de un grupo metilo de un grupo alcoxi tal como un metoxi (-OCH3) que se localiza en la posición 6' de una calcona (para la numeración del anillo véase la figura IB) . En la presente, "6'metoxi" y "6' -O-metil- " tienen el mismo significado. La enzima que asegura la 6' -alcoxi desalquilación y más particularmente la 6' -metoxi-desmetilación también se denomina como "6' -alcoxi- (prenil) calcona transferasa (6'-AO-(P)CT)" y "6-metoxi- (prenil) calcona metiltransferasa (6'M0(P)CMT) " , respectivamente. El término "microorganismo", como se utiliza en la presente, incluye tanto bacterias como hongos. Se relaciona con cepas de microorganismos individuales, consorcios microbianos o comunidades microbianas tales como la comunidad microbiana del intestino animal o de cualquier otra parte de los animales (incluyendo a los humanos) o de cualquier muestra ambiental. El término "método in vi tro" utilizado en el contexto de la presente invención se relaciona con métodos realizados fuera de organismos multicelulares e incluye métodos realizados en ausencia de células vivas (haciendo uso, por ejemplo, de células lisadas, extractos proteínicos o proteínas recombinantes) y procedimientos realizados utilizando células vivas, más particularmente cultivos de células aisladas. Cuando se hace referencia a métodos in vi tro por lo tanto debe entenderse que se excluyen procedimientos tales y como se producen en la naturaleza en conos de lúpulo intactos o en intestinos de animales vivos . Con referencia a la "desalquilación in si tu " , la actividad de desmetilación in vivo, en uno o más órganos específicos del cuerpo es lo que se pretende. Con referencia a "bacterias" en la presente, se entienden bacterias aeróbicas y anaeróbicas . El término "homoacetógenos" en el contexto de bacterias son bacterias anaeróbicas que reducen C02 a acetato o a acetato oxidado por la vía acetil-CoA. las bacterias homoacetogénicas representativas son, por ejemplo Ace oanaerojbium noterae, Acetobacter ium woodii , AcetoJbacterium wieringae, Acetogenum kivui , Aceti tomaculum ruminis, Clostridium aceticum, Clostridum thermoaceticum, Clostridium formicoaceticum, Desulf btomaculun orientis, Sporomusa paucivorans, género Peptostreptococcus y género EuJbac eriiim. Los términos primero, segundo y tercero y similares en la descripción y en las reivindicaciones se utilizan para distinguir entre elementos similares y no necesariamente para describir un orden secuencial o cronológico. Debe entenderse que los términos utilizados de esta manera son intercambiables bajo circunstancias apropiadas y que las modalidades de la invención que se describen en la presente son capaces de operación en otras secuencias a las descritas o ilustradas en la presente. De acuerdo con la presente invención, la desalquilación enzimática y más particularmente la 5 -alcoxi desalquilación de flavonoides se puede llevar a cabo por enzimas denominadas generalmente como 5 -alcoxi-transferasas, más particularmente por una 5-metoxi-flavonoide metiltransferasa (5-MO-FMT) o 6 ' -metoxicalcona metiltransferasa (6'-MO-CMT) así como por una célula intacta viva o inactivada (o material celular) que produzca la enzima 5 -alcoxi-flavonoide alquiltransferasa o 6'-alcoxicalcona alquiltransferasa por un lisado de dicha célula, por una fracción de un lisado de dicha célula (por ejemplo la membrana o el citoplasma) por una fracción proteínica enriquecida o purificada que comprende dicha 5-alcoxi- flavonoide alquiltransferasa o 6 ' -alcoxicalcona alquiltransferasa o por una 5-alcoxi-flavonoide alquiltransferasa o 6' -alcoxicalcona alquiltransferasa expresado de manera recombinante. Cuando la enzima desalquilante recombinante se secreta por las células se puede utilizar un medio acondicionado. Cuando la enzima recombinante es citoplásmica, se pueden agregar señales de secreción al ADN recombinante para obtener una proteína la cual se puede cosechar de su medio de crecimiento. La invención proporciona alcoxi-desalquilasas , más particularmente enzimas capaces de separar un grupo alquilo de un alcoxiflavonoide . El grupo alquilo puede ser alquilo lineal o ramificado. Más particularmente, el grupo alquilo es alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. En una modalidad específica, el alquilo es un metilo. De acuerdo con la presente invención, se proporcionan 5-alcoxi-alquiltransferasas, más particularmente 5-alcoxi-flavonoide-alquiltransferasas las cuales son de origen no animal, procariótico o eucariótico que -incluyen 5-alcoxi-alquiltransferasas que se originan de una célula vegetal o un microorganismo. Un primer aspecto de la invención se relaciona con células, extractos y proteínas enriquecidas, semipurificadas o purificadas (así como a composiciones que comprenden una o más de estas) capaces de desalquilar 5-alcoxi-flavonoides, más particularmente capaces de desmetilar 5-metoxi flavonoides o 6' -metoxicalconas . De acuerdo con una modalidad particular de la presente invención, las células, extractos y proteínas que comprenden actividad 5-AO-FMT (o 6'-A0-CMT) son de origen bacteriano. Más particularmente, las bacterias son bacterias homoacetogénicas . Una modalidad adicional de la invención se relaciona con bacterias homoacetogénicas que se seleccionan de la especie EuJbacterium y Peptostreptococcus . Las bacterias homoacetogénicas se pueden cultivar bajo condiciones anaeróbicas con azúcares, compuestos de un carbono tales como formiato, metanol, CO y C02 más H2 así como compuestos aromáticos alcoxilados como fuente de carbono. Las cepas bacterianas con actividad desalquilante o desmetilante prenilflavonoide aumentada o enriquecida se pueden obtener por selección basada en inoculación repetida sobre un sustrato relevante, como se describe en la sección de ejemplos en la presente. El enriquecimiento de actividad, como se denomina en la presente, se relaciona a la actividad que está entre aproximadamente 1.5 y aproximadamente 10 veces mayor que la cepa original, más particularmente que es aproximadamente 3 veces mayor que la cepa original. De manera adicional o alternativa, el método de enriquecimiento de la presente invención asegura una actividad enzimática la cual alcanza hasta entre 90-100% de conversión del sustrato (utilizando, por ejemplo, 25 mg/l de IX) . Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con métodos para enriquecer la actividad de 5-alcoxi-flavonoide-transferasa (5-AO-FT) o 6' -alcoxi-calcona-transferasa (6-AO-CT) de cepas bacterianas, que comprende la etapa de incubar la cepa en un medio con un 5 -alcoxiflavonoide tal como 5-metoxiprenilflavonoide (o una 6 ' -metoxicalcona) , más particularmente que comprende la etapa de dispersar la bacteria en un medio que comprende IX (o X) seguido por selección de la colonia productora más fuerte. Más particularmente, la cepa se dispersa repetidamente en un medio que comprende el sustrato, tal como 2-10 veces, de manera más particular 3 ó 4 veces, seguido por selección de la colonia con la actividad de 5-alcoxi-flavonoide-transferasa (5-AO-FT) o 6 ' -alcoxi-calcona-transferasa (6'-AO-CT) más alta. Esta actividad se puede medir, por ejemplo en base en la producción de producción del producto final de la reacción. De acuerdo con una modalidad particular, este método de enriquecimiento se realiza sobre una cepa bacteriana homoacetogénica, más particularmente una cepa de Eujbacteriu-77 o Peptostreptococcus, más particularmente E. limosum o P. produc tus . Un ejemplo específico de una cepa bacteriana la cual ha sido enriquecida Eujbacterimr. limosum se ha depositado en la recolección coordinada Belga de microorganismos (BCCM) en la colección BCCM/LMG, Laboratorium voor Microbiologie, Universiteit Gent (UGent) , K.L. Ledeganckstraat 35, B-9000 Gent, Bélgica con el número de depósito LMG P-23546 el 15 de marzo del 2006 por Willy Verstraete . Por lo tanto, la presente invención proporciona un método para producir 5 -alcoxiflavonoide transferasa enriquecida, semipurificada o purificada, más particularmente 5 -metoxi-prenilflavonoide metiltransferasa, método el cual comprende las etapas de obtener una cepa bacteriana, más particularmente una cepa de un homoacetógeno tal como Eubacterium limosum con actividad aumentada/enriquecida de 5-AO-FT, más particularmente actividad aumentada de 5-MO-FMT y enriquecimiento, semipurificación o purificación de la enzima utilizando métodos de purificación clásicos que incluyen precipitación por sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel. Las cepas bacterianas de la presente invención proporciona una fuente en donde la alquil-o metiltransferasa está presente en concentraciones altas o en donde un mutante que se presenta de manera natural con una alta actividad se encuentra presente. En ambos casos, se hace referencia a una cepa bacteriana "enriquecida" . De acuerdo con otra modalidad adicional de la invención, la célula comprende actividad 5-alcoxidesalquilante, de manera más particular actividad 5-metoxiflavonoide-desmetilante (o actividad 6'-metoxicalcona-desmetilante) es una célula transgénica que se obtiene al introducir una secuencia de ADN que codifica para 5-alcoxi-alquiltransferasa, más particularmente 5-MO-FMT (o 6'-MO-CMT) en un microorganismo o en una célula vegetal. Las células vegetales modificadas genéticamente con actividad aumentada de 5-MO-FMT (o 6'-MO-CMT) también se pueden hacer crecer en plantas con actividad aumentada de 5-MO-FMT (o 6'-MO-CMT) las cuales se pueden combinar con concentraciones de alcoxiflavonoide (por ejemplo metilflavonoides) alta inducida natural o artificialmente que resultan en producción n in planta" de fitoestrógenos. Por lo tanto, la presente invención proporciona plantas modificadas genéticamente tales como, pero sin limitarse a plantas de lúpulo con un contenido aumentado de fitoestrógeno . De acuerdo con otra modalidad, las células, extractos y proteínas que comprenden actividad 5-alcoxidesalquilante, más particularmente actividad 5-metoxidesmetilante son células vegetales de Humulus lupulus u otras plantas en donde se sintentiza 8-PN como en Marshallia grandiflora o Sophora tomentosa . Para conversión a una escala mayor, las plantas se pueden cribar, en donde se incrementa la conversión natural de X o IX en 8-PN, con el fin de encontrar mutantes naturales de 5-MO-FMT (o 6'-MO-CMT) o que sobreexpresen 5-MO-FMT (o 6'-MO-CMT). Las células o composiciones se pueden analizar para determinar actividad de 5-AO-FT (o 6'-AO-CT) o de manera más específica actividad de 5-MO-FMT (6'-MO-CMT) utilizando un análisis en donde se investiga la conversión de un flavonoide 5-O-metilado (calcona 6 ' -O-metilada) como sustrato de prueba en su forma desmetilada. El sustrato de prueba preferiblemente es 5 -metoxiflavonoide prenilado. De acuerdo con una modalidad particular, el compuesto IX se utiliza como un sustrato en la conversión en 8-PN y se somete a análisis por espectrometría de masas, CLAP u otro método analítico. La especificidad de enzima de una célula, extracto o composición que comprende actividad 5-metoxi-desmetilante se puede analizar mediante el uso de un sustrato flavonoide con grupos metoxi en otras posiciones. Por ejemplo, un sustrato apropiado para el análisis es tangeretina la cual tiene grupos metoxi en las posiciones - 4 Y 5, 6, 7 y 8. Este análisis permite diferencias entre la actividad desalquilante de 5-AO-FT (o 6'-A0-CT) o actividad desmetilante de 5-MO-FMT (o 6'-M0-CMT) de origen bacteriano y la actividad desmetilante de microsomas de mamífero o de células vegetales. Los extractos de las células bacterianas o vegetales que retienen actividad 5 -metoxi -desmetilante se obtienen por métodos de extracción de proteína estándar. Las proteínas purificadas que tienen actividad de 5-MO-FMT (o 6'-M0-CMT) se obtienen por métodos de purificación de proteínas acoplados con determinación de actividad de las fracciones purificadas. Un segundo aspecto de la invención se relaciona con el uso de bacterias productoras de 5 -alcoxi flavonoide transferasa (5-AO-FT) o 6' -alcoxi calcona transferasa (6'-AO-CT) , o más específicamente una 5-metoxi flavonoide metiltransferasa (5-MO-FMT) o 6' -metoxi calcona metiltransferasa (6'-MO-CMT) o extractos o proteínas purificadas de los mismos que comprenden esa actividad para la desalquilación o desmetilación de 5-metoxiflavonoides como se encuentran de manera natural y sintéticos, que incluyen 5 -metoxiflavonoides prenilados o geranilados. En una modalidad particular de la invención las células, más particularmente los microorganismos capaces de convertir flavonoides 5 -metilados tales como IX en 8-PN se utilizan para la producción in vitro rentable de 8-PN y compuestos relacionados. Se consideran diferentes modalidades tales como: la incubación, por ejemplo, de una cepa desmetilante bacteriana con extractos de lúpulo o compuestos derivados de lúpulo purificados (parcialmente) ; la aspersión, por ejemplo, de una cepa desmetilante bacteriana, extracto celular o un medio finalmente acondicionado sobre extractos de lúpulo o compuestos derivados de lúpulo purificados (parcialmente) ; o inmersión de este último en un medio que contiene una cepa, por ejemplo, de bacterias desmetilantes o extracto celular o medio acondicionado finalmente, seguido posiblemente por inactivación de la cepa después de cierto tiempo. Por lo tanto, la presente invención también proporciona métodos para la producción in vitro rentable a gran escala de fitoestrógenos. De acuerdo con la presente invención, las bacterias que contienen actividad 5-AO-FT (o 6'-MO-CT), extractos o proteínas se pueden utilizar para la producción de estrógenos activos, más particularmente fitoestrógenos a partir de 5-alcoxiflavonoides . Una modalidad particular de la presente invención se relaciona con el uso de la actividad de 5-MO-FMT o 6'-M0-CMT en la desmetilación de flavonoides vegetales, más particularmente flavonoides que se obtienen de lúpulo {Humulus lupulus) . Una modalidad específica adicional de la presente invención se relaciona - con la conversión de IX en 8-PN o la desmetilación de derivados de IX a derivados de 8-PN, que tienen esencialmente la misma actividad biológica. De acuerdo con una modalidad particular, ciertos derivados de fenilflavonoides desmetilados tales como 8-PN se pueden generar al modificar primero la estructura de un precursor metilado disponible fácilmente, seguido por la desmetilación de acuerdo con la presente invención, por lo que se obtienen derivados prenilflavonoides desmetilados . Las posibles modificaciones son tales como la adición de cadenas laterales o saturación o desaturación de enlaces. Además, la actividad de 5-AO-FT o 6'-AO-CT, de manera más específica de 5-MO-FMT o 6'-MO-CMT que contienen células y extractos de la presente invención se pueden utilizar para la desalquilación de otro 5-alcoxiflavonoides . De manera más particular los otros 5-metoxiflavonoides (o 6' -metoxicalconas) además de IX (o X) también se consideran como sustratos de acuerdo con la presente invención, tales como 5 -metoxiflavonoides o 6'-metoxicalconas que tienen sustituyentes en las posiciones 4, 6, 7, 8, 2', 3', 4', 5', y 6' (numeración de flavonoides) , cada uno seleccionada independientemente del grupo que consiste de H, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono y acilo de 1 a 6 átomos de carbono, halógenos, cadenas C más largas, sustancias aromáticas y uno o más residuos azúcar o alcoholes de azúcar, éteres, esteres, fosfatos, sulfatos, aminas, etc. De acuerdo con una modalidad particular de la invención, el 5 -alcoxiflavonoide, más particularmente el 5-metoxiflavonoide se caracteriza por un grupo hidroxilo en la posición 7 o un enlace doble entre las posiciones 2 y 3 o un grupo hidroxilo en la posición 4' . Más particularmente, la presente invención se relaciona con el uso de la actividad de 5-MO-FMT en la desmetilación de compuestos 5 -metoxiflavonoides que comprende un grupo prenilo o geranilo en la posición 6 u 8. Opcionalmente, este grupo prenilo o geranilo pueden modificarse por modificaciones tales como, pero sin limitarse a modificación del enlace doble, transformación en isoprenoide y sustituciones. En algunas modalidades estos 5-metoxiflavonoides son 6' -metoxicalconas o 5-metoxiflavanonas, que incluyen versiones preniladas o geraniladas de los mismos. En modalidades particulares se les selecciona del grupo de xantohumol (X) (2', 4,4'-trihidroxi-3 ' -prenil-6' -metoxicalcona) (la numeración de las calconas se indica en la figura IB y en la figura 2) e isoxanthohumol (IX) (5-0-metil-8-prenilnaringenina) o derivados de los mismo, con actividad biológica esencialmente similar (o cuando la dsmetilación de estos compuestos resulta en un compuesto con actividad biológica esencialmente similar) . Otra modalidad de la presente invención se relaciona con el uso de bacterias o extractos de los mismos que comprenden actividad 5 -alcoxi flavonoide transferasa (5A0-FT) o 6' -alcoxi calcona transferasa (6'AO-CT) en la desalquilación de compuestos que se seleccionan del grupo de las siguientes moléculas que tienen, además de un grupo 5-metoxi; 4 ' -acetil-7-preniloxinaringenina (±) - (E) -8- (4" -hidroxiisopentenil) , naringenina (8-PN-OH) , (±) - (E) -8- (4" -oxoisopentenil) naringenina (8-PN=0) y 6,8-diprenilnaringenina . La presente invención proporciona métodos mejorados para producir prenilflavonoides desmetilados in vitro utilizando material eucariótico o procariótico no animal. Esto es de interés particular para aquellos prenilflavonoides desmetilados los cuales son de valor comercial tales como 8-PN. Como se menciona en lo anterior, 8-PN muestra actividad estrogénica in vivo, evita la perdida ósea, inhibe la angiogenesis y met stasis y presenta actividad antiandrogénica. En consecuencia, los compuestos producidos por los métodos de la presente invención se pueden utilizar para tratar o evitar trastornos tales como osteoporosis y cáncer. Los prenilflavonoides y geranilflavonoides desmetilados con - - propiedades estrogénicas, como se obtienen con los métodos de la presente invención se pueden incluir en productos alimenticios o suplementos alimenticios para consumo humano o animal tales como bebidas que incluyen cerveza, pero también en cosméticos para ser utilizados en la piel de los humanos o los animales. Por lo tanto, la presente invención proporciona adicionalmente métodos mejorados para la producción de dichos productos alimenticios o suplementos alimenticios y sustancias farmacéuticas. Otro aspecto de la presente invención se relaciona con la activación in situ de flavonoides metilados en el intestino o en cualquier otra parte del cuerpo humano o animal al administrar células, extractos celulares o enzimas purificadas con actividad 5-MO-FMT o 6'-MO-CMT. De acuerdo con una modalidad particular, la administración de la actividad 5-MO-FMT o 6'-MO-CMT se combina con la administración de flavonoides metilados, o una fuente de los mismos, de manera separada o en una composición, en el mismo momento o de manera consecutiva. La composición que comprende la actividad enzimática y la composición que comprende al sustrato se pueden suministrar como una composición farmacéutica o un suplemento alimenticio. Las fuentes de flavonoides metilados incluyen pero no se limitan a partes vegetales (por ejemplo lúpulo) de extractos o compuestos flavonoides metilados purificados. La producción in situ de prenilflavonoides desmetilados, más particularmente de 8-PN proporciona un método alternativo de tratamiento o prevención para enfermedades y condiciones las cuales pueden ser tratadas con estrógenos tales como, pero sin limitarse a pérdida ósea, angiogenesis patológica, metástasis y como tratamiento antiandrogénico. Opcionalmente se pueden considerar estrategias de administración diferentes específicamente dirigidas a flavonoides alquilados hacia el intestino grueso. Esto se puede obtener, por ejemplo, por encapsulación de la composición lo cual lleva a liberación en el intestino grueso o por conjugación para obtener un conjugado que se selecciona del grupo que consiste de glucurónido, sulfato, acetato, propionato, glucósido, acetil-glucósido, malonil-glucósido y mezclas de los mismos. En otro aspecto, la presente invención se relaciona con una composición farmacéutica o un suplemento alimenticio que comprende o que consiste de una célula, extracto o proteína purificada del mismo que tiene actividad 5-MO-FMT o 6'-MO-CMT. De acuerdo con una modalidad particular de este aspecto de la invención, la célula es una célula de un microorganismo, más particularmente una célula bacteriana de un homoacetógeno, tal como los homoacetógenos Eu-bac erium y - Peptostreptococcus . Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas o los suplementos alimenticios comprenden además una fuente de prenilflavonoides metilados o geranilflavonoides, los cuales, como compuestos desmetilados, muestran una fuerte actividad estrogénica. Dicha fuente puede ser un extracto vegetal (especialmente lúpulo) o una fracción enriquecida del mismo. También puede ser un prenilflavonoide metilado sintético. Tanto los microorganismos como los flavonoides metilados se pueden suministrar en portadores farmacéuticos separados para administración simultánea o secuencial o se pueden combinar en el mismo portador farmacéutico, se pueden distribuir de manera homogénea o distribuir asimétricamente. En consecuencia, la invención proporciona combinaciones de composiciones farmacéuticas, combinaciones de composiciones farmacéuticas y suplementos alimenticios y combinaciones de suplementos alimenticios. Además, la presente invención proporciona métodos de tratamiento que comprenden las etapas de administración consecutiva o simultánea de las composiciones farmacéuticas de la presente invención a un paciente en necesidad del mismo. De la misma manera, la presente invención proporciona el uso de composiciones que comprenden actividad de 5-alcoxi-alquil transferasa o composiciones que comprenden 5 -alcoxiflavonoides escritos en la presente para la elaboración de un medicamento.

Típicamente, las composiciones de la presente invención se administran como terapia de suplementos de estrógeno o terapia de restitución a un paciente en necesidad de la misma . La cantidad de IX o X metilada (la cual será desmetilada a 8-PN) para ser administrada varía entre 10 y 20,000 µg/día/75 kg, entre 50 y 10,000 µg/día/75 kg o entre 50 y 7000 µg/día/75 kg, por ejemplo aproximadamente 5, 10 ó 20 mg/día/75 kg. Las formas metiladas de flavonoides menos potentes se pueden administrar en consecuencia con dosis más altas después de comparación de la actividad estrogénica de esta forma desmetilada con 8-PN. Un aspecto de la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende las bacterias o el extracto bacteriano que tiene la actividad de 5-alcoxialquiltransferasa de la presente invención y un portador farmacéutico. Con el fin de obtener eficacia óptima, el portador farmacéutico preferiblemente libera los microorganismos al colon. Es bien conocida la administración de medicamentos dirigidos al colon y se revisa, por ejemplo en Chourasia & Jain (2004) Drug. Deliv. 11(2), 129-148. Las diversas estrategias disponibles actualmente para dirigir la liberación de medicamentos al colon incluyen formación de precursor, recubrimiento de - polímeros sensibles al pH, uso de polímeros biodegradables específicos de colon, sistemas de liberación sincronizadas, sistemas osmóticos y sistemas de suministro de medicamento de presión controlada. Entre los diferentes enfoques para obtener la liberación del medicamento dirigido al colon resulta promisorio el uso de polímeros especialmente biodegradables por bacterias del colon. Las polisacaridasas son enzimas bacterianas que están disponibles en cantidad suficiente para ser aprovechadas en el direccionamiento de medicamentos al colon. En base en este enfoque se han investigado diversos polisacáridos para el suministro de medicamentos específico de colon. Estos polisacáridos incluyen pectina, goma guar, amilosa, inulina, dextrano, quitosana y sulfato de condroitina. Esta familia de polímeros naturales tiene el atractivo del suministro de medicamentos dado que está constituido de polímeros con una gran cantidad de grupos derivatizables, una amplia gama de pesos moleculares, composiciones químicas variables y, en su mayor parte baja toxicidad y biodegradabilidad a un con alta estabilidad. La propiedad más favorable de estos materiales es su aprobación como excipientes farmacéuticos. Para evitar la degradación del lado interior por bacterias desalquilantes de la presente invención, la bacteria primero debe colocarse en un portador farmacéutico no degradable bacterianamente y después de debe recubrir con un polímero el cual puede ser degradado por la flora microbiana en el colon. Posteriormente la bacteria puede ser liberada por ejemplo mediante mecanismos de liberación de medicamento controlados por pH y controlados en tiempo, o aprovechando el incremento de la presión luminal en el colon debido a las sondas peristálticas fuertes, como se ha revisado en Leopold (1999) Med Klin . 94 Suppl 1, 6-11. También se conocen sistemas de suministros específicos de colon los cuales no se basan en la actividad enzimática de microorganismos intestinales. Por ejemplo, la patente Europea EP0673645 describe un sistema de suministro para dirigir medicamentos al colon, el cual comprende tres partes: (1) un recubrimiento entérico para evitar la penetración de fluido gástrico en el sistema de suministro y de esta manera evitar cualquier liberación de medicamento en el estómago; (2) una capa de polímero erosionable la cual es expuesta y se erosiona gradualmente durante el tránsito a través del tracto intestinal superior, y (3) un núcleo el cual es un comprimido o una esférula convencional que contiene uno o varios ingredientes activos los cuales se desintegran fácilmente y posteriormente liberan el medicamento en el sitio objetivo, el colon, después de la erosión de la capa polimérica erosionable. La solicitud de patente Europea EP0453001 describe composiciones farmacéuticas con la propiedad de liberación controlada dirigida de principios activos los cuales actúan farmacológicamente dentro del intestino y en particular dentro del colon y la porción terminal del ileón. El principio activo se prepara en forma de dosis múltiples multiparticuladas y se cubre con por lo menos dos membranas, una de solubilidad dependiente de pH y la otra insoluble pero permeable a los fluidos intestinales. Mientras el principio activo cubierto permanece en el estómago y en la porción intestinal inicial, es decir, mientras el pH es menor de 5.5, no se libera. Únicamente cuando alcanza un ambiente de pH mayor (intestino delgado o colon) , la membrana dependiente de pH se disuelve para comenzar la liberación del principio activo. Desde este momento la segunda membrana, la cual es independiente de pH pero permeable a los fluidos intestinales actúa para frenar y controlar la disolución del medicamento dentro del tracto de intestino delgado-colon. El documento EP0778778 describe una composición cono uno o más microorganismos probióticos tales como Eu-bac erium y un portador para transportar los microorganismos al intestino grueso. El portador es un almidón resistente modificado o no modificado, particularmente un almidón con alta concentración de amilosa el cual actúa como un medio de crecimiento o mantenimiento para microorganismos en el intestino grueso.

La solicitud de patente de E.U.A. 2004175389 describe una formulación para conservar la vida de bacterias probióticas durante su paso a través del estómago y al mismo tiempo permitir su liberación en el intestino y particularmente dentro del colon y la cual tiene una actividad acuosa baja y una vida de anaquel correspondientemente prolongada. La formulación incluye una mezcla de bacterias probióticas sustancialmente libre de agua con sales de alginato monovalentes, en donde la mezcla se ha formado y se mantiene en un ambiente sustancialmente libre de agua. La sales de alginato incluyen alginato de sodio y alginato de potasio pero no sales divalentes tales como alginato de magnesio o alginato de calcio. Generalmente se proporciona un recubrimiento entérico (por ejemplo encapsulación en gelatina o celulosa) para la formulación. Debe entenderse que aunque se exponen en la siguiente sección de ejemplos modalidades particulares, construcciones, configuraciones y materiales específicos, estos únicamente son ilustrativos y pueden realizarse diversos cambios o modificaciones en la forma y detalle sin apartarse del alcance y espíritu de esta invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1: Desmetilación de isoxanthohumol (IX) por cultivo fecal humano Se obtienen muestras fecales de 12 sujetos humanos sanos con edades de entre 20 y 35 años y se les denomina A a L. Ninguno de los sujetos presentaba antecedentes de enfermedad gastrointestinal y los sujetos no habían ingerido antibióticos durante tres meses antes del suministro de la muestra. Se prepararon suspensiones fecales de muestras fecales frescas 20% (p/v) al homogeneizar las heces con solución salina amortiguada con fosfato (0.1 M, pH 7) que contiene 1 g/1 de tioglicolato de sodio como agente reductor. El material particulado se separa por centrifugación (1 min, 500 x g) . Al sobrenadante a continuación se le denominará "el cultivo" . La capacidad de los cultivos obtenidos de muestras fecales A, B, C y D (a continuación denominados como cultivos A-D) para degradar o transformar el prenilflavonoide IX de lúpulo se probó al incubar los cultivos fecales (10% (v/v) ) en caldo de infusión cerebro corazón (con 0.5 g/1 de clorhidrato de cisteína) con 25 mg/l de isoxanthohumol durante un período de 8 días bajo condiciones anaeróbicas. Los extractos de las incubaciones los días 0 y 8 se analizaron para determinar productos de transformación bioactiva de IX utilizando cribado estrogénico de levadura, de acuerdo con De Boever et al . (2001) Env. Heal th Perspectives 109, 691-697, basado en Routledge ti Sumpter (1996) Environ . Toxicol . Chem. 15, 241- 248. En breve se transforma Sacharomyces cerevisiae con el gen para receptor de estrógeno humano (ERa) junto con plásmidos de expresión que contienen elementos sensibles y el gen indicador lacZ (que codifica para la enzima ß-galactosidasa) . Se cuantifica la actividad de ß-galactosidasa a 540 nm por la conversión de la sustancia cromogénica rojo de clorofenol-ß-D-galactopiranósido a rojo de clorofenol . La respuesta del bioanálisis se expresa como la absorbancia a 540 nm dividida entre la densidad óptica 630 nm [ (A540/A630) net] . La actividad estrogénica de las muestras se expresa como porcentaje de equivalencia a estradiol 10 nM (E2) la cual induce una respuesta de 100% en el bioanálisis de receptor de estrógeno. Los bioanálisis se realizan en placas de 96 pozos en las cuales se prueban 10 µl de los compuestos de prueba y se incuban con 240 µl de levadura modificada genéticamente (densidad óptica de 0.26 a 610 nm) . Las diluciones seriadas de los compuestos de prueba se realizan en sulfóxido de dimetilo, lo cual permite generar curvas dosis-respuesta para las dosis (ordenadas) versus actividad (abscisa) . Los datos de ajustan por un modelo 4 paramétrico logístico utilizando el algoritmo de Marquardt-Levenberg (Sigmaplot 4.0, SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA) (De Boever et al . (2001) Env. Heal th Perspectives 109,691-697). Los resultados se proporcionan en la figura 3.

Ninguna de las incubaciones muestra una respuesta estrogénica en el día 0. Después de 8 días se observa un incremento fuerte en las propiedades estrogénicas en el cultivo C (figura 3) , pero no en los cultivos A, B o D (datos no mostrados) . Estos resultados indican la capacidad del cultivo fecal C para convertir IX en compuestos con propiedades estrogénicas aumentadas. Para probar adicionalmente esta transformación se incubaron los cultivos A-D (10% (v/v) ) durante 8 días en caldo de infusión cerebro corazón (con 0.5 g/1 de clorhidrato de cisteína) ya sea con X o IX a una concentración de 25 mg/l bajo condiciones anaeróbicas y se detectaron productos de conversión por CLAP (tabla 1) . El compuesto IX demostró que es recalcitrante a la transformación en los cultivos A, B y D, lo cual concuerda con los resultados del cribado estrogénico de levadura. No obstante, en el cultivo C se recupera más de 40% de 8-PN, lo cual explica el incremento en las propiedades estrogénicas del cultivo C. Se convierte X ligeramente a IX en todas las muestras pero dado que esto también se detectó cuando X se incuba en cultivos sometidos a autoclave, se considera que esta es una isomerización no enzimática. En el cultivo C, nuevamente se detecta una cantidad pequeña de 8-PN la cual se origina de la conversión de IX por bacterias fecales humanas.

Tabla 1: Transformación microbiana de X e IX después de incubación con muestras fecales A, B, C y D *los resultados se presentan como porcentaje molar promedio (desviación estándar) de recuperación de X, IX u 8-PN en relación a la cantidad dosificada de flavonoide, an.d. : por debajo del nivel de detección. Los resultados muestran la capacidad de las bacterias intestinales a transformar X e IX en 8-PN mediante el proceso de O-desmetilación enzimática del grupo metoxi en la posición 5 de los componentes. No todos los cultivos son capaces de realizar esta reacción. Por lo tanto los cultivos remanentes E-L (10% (v/v) ) se incubaron durante 3 días en caldos de infusión cerebro corazón (con - 0.5 g/1 de clorhidrato de cisteína) bajo condiciones anaeróbicas con 25 mg/l de IX (figura 4) . La 0-desmetilación microbiana de IX se detecta únicamente en las muestras E, J y K. El presente ejemplo muestra que los prenilflavonoides metilados no son metabólicamente inertes después de la ingestión pero se pueden activar en derivados biológicamente (más) activos desmetilados. No obstante, esta capacidad de transformación depende fuertemente de la composición y actividad de la comunidad microbiana intestinal dado que la activación de IX se produce solo en un tercio de las muestras probadas . Para investigar adicionalmente estas diferencias entre los individuos se incubaron durante 3 días 51 muestras fecales en caldo de infusión cerebro corazón (con 0.5 g/1 de clorhidrato de cisteína) bajo condiciones anaeróbicas que contienen 25 mg/l de IX (figura 5) . Los resultados se presentan como porcentaje de producción de 8-PN en relación a la concentración de IX incubada y las muestras se ordenan por capacidad cada vez mayor de producción de 8-PN. Los datos se analizan por análisis de grupos de dos etapas y se recuperan 3 grupos (designados a, b y c) , con medias significativamente diferentes (P<0.01, Kurskal-Wallis) . Estos datos muestran que la activación de - prenilflavonoides metilados es dependiente de la comunidad microbiana intestinal, separándolo los individuos en grupos productores de 8-PN en gran capacidad (grupo c, 16%) , moderada (grupo b, 22%) y baja (grupo a, 63%) . En general, la exposición final del componente activo dependerá de una combinación de concentración de precursor y el potencial de transformación de la comunidad microbiana intestinal.

Ejemplo 2. Uso de microorganismos para producir compuestos con propiedades estrogénicas del tipo de 8-prenilnaringenina El presente ejemplo describe la capacidad de dos bacterias anaeróbicas intestinales bien caracterizadas para convertir IX en 8-PN Se obtienen Eubacterium limosum ATCC 8486 y Peptostreptococcus productus ATCC 27340 de Germán Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ, Braunschweig, Alemania) . Se incuba E. Limosum durante 113 días en caldo de infusión cerebro corazón (con 0.5 g/1 de clorhidrato de cisteína) con 25 mg/l de IX y 8-PN bajo condiciones anaeróbicas (tabla 2) . Esta cepa es capaz de convertir IX en 8-PN. La cepa no degrada adicionalmente 8-PN, dado que la totalidad de 8-PN, cuando se suministra como sustrato, se puede recuperar después de 13 días de incubación. Esta característica es claramente diferente de - la vía metabólica observada en microsomas hepáticos en donde 8-PN es metabolizado extensamente de manera adicional [Nikolic et al . (2005) J*. of Mass Spectrom . 40, 289-299; Nikolic et al . (2004) Drug Metabolism and Disposition 32, 272-279] .

Tabla 2: Transformación de IX y 8-PN por E. limosum *los resultados se presentan como porcentaje molar promedio (desviación estándar) de recuperación de X, IX y 8-PN o 6-PN. n.d. no detectado. Debido a la capacidad de E. limosum para transformar IX en 8-PN se realiza un procedimiento de selección para obtener una cepa capaz de producir cuantitativamente 8-PN. El procedimiento de selección consiste de 6 incubaciones paralelas de E. limosum [cultivos de colonias solas] con 25 mg/l de IX e incubación durante 8 días. Después se selecciona el cultivo el cual produce la cantidad más alta de 8-PN y se utiliza como inoculo para la siguiente ronda de 6 incubaciones paralelas (tabla 3) . Mientras en la primera ronda de selección la producción más baja es de solo 2%, es evidente un incremento de hasta 82% después de tres etapas de selección y un cultivo más eficiente transforma la totalidad de IX dosificada en 8-PN. La producción media de la totalidad de las 6 incubaciones en cada ronda aumenta de 22.5% hasta 90.5% y la desviación estándar disminuye de 20% a 7% después del procedimiento de selección. Esto significa que, después de tres rondas, se selecciona una cepa la cual convierte casi la totalidad de IX (media alta) y que también es estable (baja desviación estándar) .

Tabla 3: Selección de E. limosum productora de 8-PN por 3 incubaciones repetidas Para probar la capacidad de P. productus para realizar la conversión enzimática de IX en 8-PN, se incuba la cepa por triplicado durante 13 días en caldo de infusión cerebro corazón (con 0.5 g/1 de clorhidrato de cisteína) con 25 mg/l de IX bajo condiciones anaeróbicas. Las muestras se analizan cada dos días y se determinan las concentraciones de IX y 8-PN (figura 6) . Dependiendo de la incubación, P. productus transforma 10% a 50% de IX incubado en 8-PN. Esto muestra que esta cepa también es adecuada para la producción de 8-PN. Las cepas de P. productus se pueden seleccionar adicionalmente para actividad mejorada de desmetilación, siguiendo el razonamiento, como se describe para E. limosum. Un ejemplo específico de una cepa bacteriana la cual se ha enriquecido con Eu-bacteriuiT. l±mosu.t. se ha depositado en las colecciones coordenadas Belgas de microorganismos (BCCM) la colección BCCM/LMG con el número de depósito LMG P-23546 el 15 de marzo por Willy Verstraete, Ejemplo 3. Uso de microorganismos para convertir prenilflavonoides metilados en un ambiente de fermentación Se diseña un experimento de fermentación por alimentación por lotes para utilizar una cepa seleccionada de Eu-bac erium limosum como se obtiene en lo anterior, para - convertir prenilflavonoides metilados en un ámbito de fermentación. La fermentación se realiza en un fermentador Braun BiostatMR M (recipiente de 2 1) llenado con 1.5 1 de caldo de infusión cerebro corazón (con 0.5 g/1 de clorhidrato de cisteína) . Posteriormente el fermentador se esteriliza al someterlo a autoclave durante 30 minutos a 121°C. Antes de la inoculación el fermentador se vuelve anaeróbico al purgar el sistema durante 1 hora con nitrógeno gaseoso. Después de esto el fermentador se inocula con un cultivo de E. limosum de 2 días de edad y se agregan 25 mg/l de IX al líquido de fermentación. La fermentación se realiza a 37°C durante 2 semanas, sin control de pH. A partir del día 1 en adelante, se dosifican tres veces al día 200 ml de caldo de infusión cerebro corazón anaeróbico (con 0.5 g/1 de clorhidrato de cisteína) que contiene 25 mg/l de IX al reactor, a 10 ml/min y simultáneamente se extrae del sistema 200 ml/min del contenido del fermentador. Se toma una muestra de 10 ml del efluente para análisis químico. Esto se realiza los días 0, 1, 2 y posteriormente cada 2 días. Los datos son el % de conversión (8-PN/(IX + 8-PN)). Se obtiene una conversión de 0% (día 0) , 43% (día 1) y 100% (día 2 y días siguientes) de IX en 8-PN. Este ejemplo muestra que la cepa seleccionada es capaz de convertir IX en 8-PN altamente estrogénico a una - estrategia basada en fermentación lo que genera aplicaciones tales que la elaboración de productos con propiedades estrogénicas a partir de precursores con el objetivo de purificar el compuesto de interés para uso como ingrediente para otras aplicaciones o para activar el precursor en extractos de lúpulo u otros extractos vegetales que comprenden prenilflavonoides metilados.

Ejemplo 4 : La suplementación de la cepa inicia la conversión ex vivo de IX en 8-PN La cepa de E. limosum más eficiente, que se obtiene del experimento de selección en el ejemplo 2 se suplementa con el cultivo B que originalmente no realiza conversión del ejemplo 1 para examinar la capacidad de esta cepa para iniciar la producción de 8-PN en el ambiente complejo de una suspensión fecal. La cepa se agrega al cultivo en proporciones que varían de 0% hasta 100% (v/v) . Esta mezcla se incuba con 10% (v/v) de 25 mg/l de IX durante un período de 7 días en caldo de infusión cerebro corazón (con 0.5 g/1 de clorhidrato de cisteína) bajo condiciones anaeróbicas. Se monitorea la concentración de 8-PN cada dos días (figura 7) . Los resultados muestran que, con el incremento en la suplementación de E. limosum, aumenta la producción de 8-PN. Una cantidad igual de cultivo de E. limosum y muestra fecal (100% en la figura 7) - proporciona una conversión completa de IX en 8-PN pero incluso a una suplementación de 1%, la mitad de IX dosificado ha sido transformado de antemano en 8-PN después de solo un día. De manera notable se alcanza una concentración máxima de 8-PN para todas las incubaciones en el primer día, lo cual indica que la totalidad de IX disponible se transforma de inmediato. No se detecta conversión adicional de 8-PN dado que la concentración de 8-PN en el día 1 y 7 no es significativamente diferente (prueba t de Students, p > 0,05) . Este ejemplo muestra que la cepa seleccionada es capaz de convertir IX en 8-PN, altamente estrogénico en el complejo ambiente de un cultivo fecal lo que genera posibles aplicaciones tal como conversión in situ de precursores en productos con propiedades estrogénicas, en otros medios diversos tales como extractos de lúpulo u otros extractos vegetales que comprenden prenilflavonoides metilados .

Ejemplo 5. Conversión de prenilflavonoides metilados en un modelo de simulación in vitro dinámico del tracto intestinal En una etapa siguiente, para demostrar la conversión in situ de precursores tales como IX en productos con propiedades estrogénicas tales como 8-PN se utiliza un modelo de simulación in vitro dinámico del tracto intestinal (Simulator of the Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME) ) , (Molly et al. (1993) Appl. Microbiol . Biotechnol . 39, 254-258) . El sistema SHIME consiste de una sucesión de cinco reactores que representan partes diferentes del tracto gastrointestinal humano. Los primeros dos reactores (el estómago [reactor 1] e intestino delgado [reactor 2] ) son del principio de llenado y extracción para simular etapas diferentes de captación y digestión de alimentos, con bombas peristálticas que agregan una cantidad definida de alimentación SHIME (3 veces/día) y líquido pancreático y biliar a los compartimientos del estómago y el duodeno y vaciamiento de los reactores respectivos después de intervalos especificados. Los últimos tres compartimientos (colon ascendente [reactor 3] transversal [reactor 4] y descendente [reactor 5] respectivamente] ) son reactores que se agitan continuamente con un volumen constante y control de pH. El tiempo de retención y pH de los diferentes recipientes se selecciona con el fin de asemejar las condiciones in vivo de las diferentes partes del tracto gastrointestinal. El paso del alimento en el intestino delgado es simulado en el reactor 2 por la adición de 60 ml de líquido artificial pancreático y biliar, pancreatina y NaHC03. La temperatura del sistema se mantiene a 37°C por - un termostato y el sistema se mantiene anaeróbico al purgarlo con N2 durante 15 minutos todos los días. Se prepara el inoculo de material fecal como se describe en De Boever et al. (2000) J". Nutri tion 130, 2599-2606. Los reactores 3, 4 y 5 se llenan con medio nutricional y se ajusta el pH al intervalo de pH respectivo. Finalmente se agrega un inoculo de 50 ml en los últimos tres reactores. Para el presente experimento se combinan dos de los sistemas descritos en lo anterior como dos reactores completamente separados los cuales son activados por las mismas bombas (bombas con dos cabezas de bomba, lo que permite dosificar exactamente las mismas cantidades de líquido en ambos sistemas) , que tienen un control idéntico de pH y temperatura y los cuales reciben el mismo alimento líquido. De esta manera todos los parámetros son controlados perfectamente y son idénticos, excepto para las comunidades microbianas intestinales en los dos sistemas las cuales se pueden introducir por separado. En este caso, introducimos una capacidad la cual es capaz de activar prenilflavonoides metilados (PF+) y una la cual no los puede metilar (PF-) . Después de un período de estabilización de dos semanas en el cual el sistema SHIME normal alimentado se dosifica con 25 mg/l de IX, se dosifica a una alimentación SHIME durante 4 semanas (día 15-44) . En las últimas dos semanas la cepa de Eubacterium - - limosum seleccionada del ejemplo 2 también se administra al primer compartimiento de colon, para simular la aplicación de la cepa como un material probiótico (días 30-44) . Las figuras 7 y 8 muestran concentraciones de IX y 8-PN en las partes del colon ascendente, transversal y descendente para las comunidades PF+ y PF- . En el compartimiento PF+, se observa la activación de prenilflavonoides metoxilados en las partes del colon distal cuando se administra únicamente IX (días 15-30) , mientras que no se produce conversión en el compartimiento PF- . Después de suplementar la cepa bacteriana (desde el día 30) , el potencial de activación aumenta en el compartimiento PF+ y también en el compartimiento PF- y se detecta producción de 8-PN estrogénicamente activo en la parte del colon distal. Este ejemplo muestra que la cepa seleccionada del ejemplo 2 es capaz de activar prenilflavonoides metilados bajo condiciones simuladas del intestino humano.

Ejemplo 6: Demostración de la capacidad de desmetilación de 5-alcoxiprenilflavonoide in vivo de la cepa seleccionada del ejemplo 2 Se realiza un experimento con ratas axénicas y asociada a flora humana (HFA) para probar la capacidad de la cepa seleccionada del ejemplo 2 para activar prenilflavonoides metilados in vivo. Se utilizan para el estudio un total de 12 ratas axénicas. Cuando las ratas tienen 5 semanas de edad, se asocian tres ratas HFA por sonda oral con cultivo fecal homogeneizado, recién vaciado el cual tiene actividad desmetilante de prenilflavonoide . Estas ratas HFA se denomina como ratas PF+ . Al mismo tiempo, a ratas 3 HFA se les asocia por sonda oral con un cultivo fecal homogeneizado recién vaciado sin actividad desmetilante de prenilflavonoide . Estas ratas HFA se les denomina como PF- . Las ratas restantes se mantienen bajo condiciones estériles. Todas las ratas se mantienen en jaulas colectivas cerradas separadas antes del inicio del experimento. Después de 3 semanas de estabilización de los cultivos microbianos dentro del intestino de la rata se inicia el primer experimento. Después de trasladar a las ratas a jaulas de metabolismo individuales, se administran diariamente 2 mg de IX/kg de peso corporal a cada rata durante 5 días y cada día se recolecta la orina acumulada de 24 horas. Después de 3 días se cuantifica la excreción urinaria de IX y 8-PN. En la tabla 4 se presenta la conversión [8-PN/(IX + 8-PN)] . A continuación, las ratas se transfieren de regreso a las jaulas colectivas durante 2 semanas antes de la segunda parte del experimento. Aquí, las 6 ratas axénicas se asocian con la cepa - de E. limosum del ejemplo 2 durante 7 días mediante sonda oral diaria con una suspensión bacteriana Log9. En el día 2, las ratas se transfieren a jaulas de metabolismo individual para recolección de orina acumulada durante 24 horas. Desde el día 2 hasta el día 7, se administran 2 mg de IX/kg de peso corporal a las ratas mediante sonda oral . En el día 7, se cuantifica la excreción de IX y 8-PN urinaria. La conversión [8-PN/(IX + 8-PN)] está presente en la tabla 4.

Tabla 4: Media y desviación estándar del porcentaje de excreción urinaria acumulada durante 24 horas de 8-PN/(IX + 8-PN) Este ejemplo muestra que la activación de los prenilflavonoides metilados es un fenómeno únicamente microbiano dado que las ratas axénicas no producen 8-PN. Además, las diferencias en la capacidad de transformación intestinal genera una excreción diferente de 8-PN dado que la orina de ratas PF+ tiene una relación mayor de 8-PN, en comparación con las ratas PF- . Finalmente, este ejemplo indica que la cepa de E. limosum seleccionada puede activar prenilflavonoides metilados in vivo dado que las ratas axénicas comienzan a producir 8-PN después de que se asocian con esta bacteria.

Claims (13)

- - REIVINDICACIONES

1. Método para producir uno o más fitoestrógenos in vivo, el método comprende: a) proporcionar una primera composición de una cepa bacteriana de una bacteria o un extracto de la misma que tiene actividad 5-alcoxiflavonoide-desalquilante y/o 61-alcoxicalcona-desalquilante, b) poner en contacto una segunda composición que comprende 5-alcoxiflavonoides y/o 6 ' -alcoxicalconas con la primera composición que comprende una cepa bacteriana o extracto de la misma de manera que permite la desalquilación de 5-alcoxiflavonoides y/o 6-metoxicalconas por la cepa bacteriana o el extracto.

2. Método como se describe en la reivindicación 1, en donde los 5-alcoxiflavonoides y/o las 6'-alcoxicalconas son 5-metoxiflavonoides y/o 6'-metoxicalconas .

3. Método como se describe en la reivindicación 1 ó 2, en donde el fitoestrógeno es 8-prenilnaringenina.

4. Método como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, el cual comprende además enriquecer la actividad desalquilante de la cepa bacteriana por incubaciones repetidas con un 5-metoxiprenilflavonoide .

5. Método como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la primera composición es un cultivo de células bacterianas del género --.u-bacteriu-n o una cepa del género Peptostreptococcus .

6. Método como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el 5-alcoxiflavonoide es isoxanthohumol.

7. Uso de una línea de células bacterianas que tienen actividad 5-alcoxiflavonoide desalquilante y/o 6'-alcoxicalcona-desalquilante para la desmetilación in vitro de un 5-metoxiflavonoide o una 6 ' -metoxicalcona.

8. Combinación de una o más composiciones farmacéuticas y/o uno o más suplementos alimenticios para administración simultánea consecutiva que comprende una primera composición farmacéutica y/o un suplemento alimenticio que comprende una bacteria, un extracto, un componente semipurificado o purificado del mismo que tiene actividad 5-alcoxiflavonoide desalquilante y/o 6'-alcoxicalcona desalquilante y una segunda composición farmacéutica y/o suplemento alimenticio que comprende una fuente de 5-alcoxiflavonoides o 6' alcoxicalconas .

9. Combinación como se describe en la reivindicación 8, en donde la fuente de 5-alcoxiflavonoides es un extracto de lúpulo.

10. Combinación como se describe en la reivindicación 8 ó 9, en donde la 6 ' -alcoxicalcona es xanthohumol y/o el 5 ' -alcoxiflavonoide es isoxanthohumol.

11. Combinación como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en donde la bacteria es Eubacterium limosum .

12. Combinación como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, en donde la bacteria, extracto, componente semipurificado o purificado del mismo se proporciona en una formulación para suministro específico del colon.

13. Método para enriquecer la actividad de 5-alcoxialquiltransferasa de una cepa bacteriana, el método comprende la etapa de dispersar la cepa sobre un medio que comprende 5-alcoxiflavonoides y seleccionar la colonia que tenga la actividad de 5-alcoxi-alquiltransferasa más alta. 1 . Método como se describe en la reivindicación 13, en donde la etapa se repite por lo menos dos veces. 15. Composición que comprende células, extractos, sobrenadante u otro material purificado o semipurificado de la cepa bacteriana enriquecida para actividad de 5-alcoxiflavonoide 5-alcoxialquiltransferasa . 16. Composición como se describe en la reivindicación 15, el cual es un extracto de la bacteria homoacetogénica del género Eubacterium o del género Peptostreptococcus .