CN102030791B - 四种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 - Google Patents
四种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了四种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。本发明以指孢囊菌NRRL 18085作为原始菌，分别对该菌的tiaM-卤化酶基因、tiaG1-糖基转移酶基因和tiaP1-P450基因实行敲除，获得tiaM-卤化酶基因敲除突变株(TCM50)、tiaG1-糖基转移酶基因敲除突变株(TCM57)、tiaP1-P450基因敲除突变株(TCM69)。对突变株发酵产物粗提物采用正相硅胶、反相硅胶、凝胶等柱层析色谱技术和制备薄层层析色谱技术等，从突变株TCM50得到化合物1，突变株TCM57得到化合物2和化合物3，突变株TCM69得到化合物4。这四种化合物对金黄色葡萄球菌，苏云金芽孢杆菌，粪肠球菌具有抑制活性，有望用于研发成为新的抗菌新药。
Description
技术领域：
本发明涉及四种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。
背景技术：
大环化合物是一类重要的治疗用抗生素。台勾霉素(Tiacumicins)是一系列18元环大环内酯抗生素的总称。台勾霉素B(Tiacumicin B)在生产台勾霉素(Tiacumicins)的菌株中是一个主要产物，其拥有一个18元环大环内酯，两个脱氧糖基和一个芳香环支链，其生产菌株主要包括，放线菌指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085，游动放线菌Actinoplanes deccanensis ATCC 21983和小孢链菌Catellatospora sp.Bp3323-81等。
指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085为小单孢菌科(Micromonosporaceae)放线菌，能够产生多种台勾霉素类化合物。
发明内容：
本发明的目的是提供四种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用。
本发明通过对指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085进行一系列针对Tiacumicin B的基因敲除突变，得到3个突变株，从这3个突变株的培养物中分离到了四种新的台勾霉素类化合物，并且发现它们对金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus ATCC 29213，苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringensis，粪肠球菌Enterococcus faecalisATCC 29212具有中等抑菌活性，可以用于制备抗菌药物，从而实现了本发明的目的。
本发明的四种台勾霉素类化合物，其结构如式(1)所示：
式(1) 式(X)
其中化合物1：R1＝H，R2＝CH3，R3＝OH，R4如式(X)所示；化合物2：R1＝Cl，R2＝H，R3＝H，R4＝H；化合物3：R1＝Cl，R2＝CH3，R3＝H，R4＝H；化合物4：R1＝Cl，R2＝CH3，R3＝H，R4如式(X)所示。
本发明以指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085作为原始菌，分别对该菌的tiaM-卤化酶基因、tiaG1-糖基转移酶基因和tiaP1-P450基因实行敲除，获得tiaM-卤化酶基因敲除突变株(TCM50)、tiaG1-糖基转移酶基因敲除突变株(TCM57)、tiaP1-P450基因敲除突变株(TCM69)。对突变株发酵产物粗提物采用正相硅胶、反相硅胶、凝胶等柱层析色谱技术和制备薄层层析色谱技术等，从突变株TCM50得到化合物1，突变株TCM57得到化合物2和化合物3，突变株TCM69得到化合物4。
本发明的化合物1是从tiaM-卤化酶基因敲除突变株(TCM50)的发酵液中分离得到的。进一步优选在突变株的发酵培养过程中，加入大孔树脂作为吸附剂，富集吸附化合物1，然后从该吸附剂中分离得到化合物1。化合物1优选的制备方法是：将大孔树脂加入tiaM-卤化酶基因敲除突变株(TCM50)的培养基中，经发酵培养后，分离出发酵液中的大孔树脂，经乙醇洗脱，乙醇提取物经浓缩回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得代谢产物粗提物，将该粗提物经硅胶柱层析，以体积比从100∶0～5∶1的氯仿-甲醇作为洗脱剂梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为20∶1梯度下洗脱下来的馏分，再经凝胶柱层析，以体积比1∶1的氯仿-甲醇作为洗脱剂洗脱，进而用ODS反相中压液相色谱，YMC*GEL ODS-A球型填料，120A孔径，50um粒径，30×2.5cm I.D.，流速为15ml/min，以体积分数从15％-70％的甲醇/水梯度洗脱120min，再以体积分数70％-85％的甲醇/水梯度洗脱40min，收集体积分数80％-84％梯度下馏分，浓缩，再用硅胶柱层析，以体积比为10∶1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，收集馏分，得到化合物1。
化合物1：无色针晶，由高分辨质谱HRFABMS(m/z 1011.4938，[M+Na]+)得到其分子式为C52H76O18.1H NMR(500MHz，CD3OD)δ7.23(d，J＝11.5Hz，1H)，6.61(t，J＝12.0Hz，1H)，6.26(d，J＝2.5Hz，1H)，6.20(d，J＝2.5Hz，1H)，5.97(m，1H)，5.85(brs，1H)，5.59(t，J＝8.5Hz，1H)，5.16(d，J＝10Hz，1H)，5.14(t，J＝9.5Hz，1H)，5.04(d，J＝10Hz，1H)，4.74(m，1H)，4.67(brs，1H)，4.64(d，J＝11.5Hz，1H)，4.44(d，J＝11.5Hz，1H)，4.25(brs，1H)，4.04(quint，J＝6.5Hz，1H)，3.95(d，J＝3Hz，1H)，3.78(dd，J＝10，3.5Hz，1H)，3.75(dd，J＝10.5，3.5Hz，1H)，3.73(d，J＝11Hz，1H)，3.58(s，3H)，3.57(m，2H)，2.86(m，1H)，2.74(m，2H)，2.70(m，1H)，2.48(m，2H)，2.61(pentet，J＝7.0Hz，1H)，2.03(m，1H)，1.83(s，3H)，1.78(s，3H)，1.67(s，3H)，1.31(d，J＝6Hz，1H)，1.29(m，1H)，1.23(t，J＝7.5Hz，3H)，1.21(d，J＝6.5Hz，3H)，1.20(d，J＝7.5Hz，3H)，1.18(d，J＝7.0Hz，3H)，1.16(s，3H)，1.15(s，3H)，0.90(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(125MHz，CD3OD)δ178.4s，172.0s，169.2s，165.2s，163.7s，150.5s，146.2d，143.7d，137.0s，136.9s，136.4s，134.6d，128.6d，126.9d，125.7d，124.6d，111.0d，106.1d，102.3d，101.8d，97.2d，94.3d，82.5d，78.6d，76.2d，76.0d，74.5s，73.5d，73.2d，72.8d，71.7d，70.6d，68.3d，64.0d，62.2q，42.5d，37.3t，35.4d，30.3t，28.7q，28.4t，26.9t，20.3q，19.6q，19.2q，18.7q，18.2q，17.6q，16.8q，15.5q，14.0q，11.4q。综上所述，推知化合物1的结构如式(1)所示，其中R1＝H，R2＝CH3，R3＝OH，R4如式(X)所示，参考文献J Antibiot(Tokyo)，1987，40(5)：575-88；J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，1987，1353-1359。
本发明的化合物2和化合物3是从tiaG1-糖基转移酶基因敲除突变株(TCM57)的发酵液中分离得到的。进一步优选在突变株TCM57的发酵培养过程中，加入大孔树脂作为吸附剂，富集吸附化合物2和化合物3，然后从该吸附剂中分离得到化合物2和3。化合物2和3优选的制备方法是：将大孔树脂加入tiaG1-糖基转移酶基因敲除突变株(TCM57)的培养基中，经发酵培养后，分离出发酵液中的大孔树脂，经乙醇洗脱，乙醇提取物经浓缩回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得代谢产物粗提物，该粗提物经硅胶柱层析，以体积比从100∶0～0∶100的氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为100∶1梯度下洗脱下来的馏分Fr.1和体积比为20∶1梯度下洗脱下来的馏分Fr.2，馏分Fr.1经凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，收集馏分，然后经硅胶柱层析，以体积比从4∶1～2∶1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为3∶1梯度下洗脱下来的馏分，再经凝胶柱层析，以甲醇为流动相，收集洗脱下来的馏分，得到化合物3；馏分Fr.2经凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，收集洗脱下来的馏分，再经薄层制备色谱，以体积比为10∶1的氯仿-甲醇为展开剂，收集Rf值为0.6的部位的馏分，得到化合物2。
化合物2：白色固体，由高分辨质谱HRFABMS(m/z 819.2922，[M+Na]+)得到其分子式为C40H54O12Cl2.1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.11(t，J＝10.5Hz，1H)，6.54(t，J＝14.0Hz，1H)，5.85(s，1H)，5.79(m，1H)，5.43(d，J＝9.5Hz，1H)，5.24(t，J＝9.5Hz，1H)，5.03(d，J＝10.0Hz，1H)，4.78(dd，J＝6.0，11.5Hz，1H)，4.62(d，J＝10.0Hz，1H)，4.60(d，J＝11.5Hz，1H)，4.45(d，J＝11.5Hz，1H)，4.26(s，1H)，4.06(dd，J＝3.0，8.5Hz，1H)，3.84(dd，J＝2.5，9.5Hz，1H)，3.72(dd，J＝3.0，9.7Hz，1H)，3.54(dd，J＝6.0，9.5Hz，1H)，3.06(m，1H)，2.98(m，1H)，2.67(brd，J＝14.5Hz，1H)；2.56(dd，J＝9.0，17.1Hz，1H)，2.49(m，1H)，2.41(m，1H)，1.93(dd，J＝7.3，10.2Hz，1H)，1.85(dd，J＝7.3，14.3Hz，1H)，1.81(s，3H)，1.75(s，3H)，1.67(dd，J＝7.3，14.3Hz，1H)，1.65(s，3H)，1.30(d，J＝10.0Hz，3H)，1.24(s，1H)，1.19(t，J＝6.3Hz，3H)，0.95(t，J＝7.5Hz，3H)，0.85(t，J＝7.5Hz，3H)；13CNMR(125MHz，CDCl3)δ169.9s，167.7s，157.2s，152.6s，144.0d，142.8s，140.6d，136.5s，135.8s，135.4s，133.0d，128.5d，126.2d，125.1s，123.7d，113.7s，113.7s，107.1s，99.1d，82.9d，76.0d，75.5d，72.5d，72.0d，70.8d，69.8d，62.5t，42.4d，36.4t，31.5t，26.7t，26.0t，25.6t，17.6q，17.1q，15.1q，13.9q，12.4q，10.9q，9.9q。综上所述，推知化合物2的结构如式(1)所示，其中R1＝Cl，R2＝H，R3＝H，R4＝H，参考文献J Antibiot(Tokyo)，1987，40(5)：575-88；J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，1987，1353-1359。
化合物3：白色固体，由高分辨质谱HRFABMS(m/z833.3047，[M+Na]+)得到其分子式为C41H56O12Cl2，1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.08(d，J＝11.5Hz，1H)，6.55(dd，J＝12.5，14.5Hz，1H)，5.86(s，1H)，5.78(m，1H)，5.45(t，J＝8.0Hz，1H)，5.13(t，J＝9.5Hz，1H)，5.04(d，J＝10Hz，1H)，4.81(dt，J＝6.5，11.5Hz，1H)，4.66(d，J＝11.5Hz，1H)，4.61(s，1H)，4.40(d，J＝11.5Hz，1H)，4.26(s，1H)，3.85(d，J＝9.5Hz，1H)，3.67(dd，J＝3.5，9.5Hz，1H)，3.60(s，3H)，3.60(overlapped，1H)，3.51(dd，J＝6.0，9.5Hz，1H)，3.02(dd，J＝6.9，14.3Hz，1H)，2.98(dd，J＝6.9，13.0Hz，1H)，2.68(brd，J＝15.0Hz，1H)，2.53(ddd，J＝3.0，9.5，19.5Hz，1H)，2.48(t，J＝5.3Hz，1H)，2.45(dd，J＝4.5，9.5Hz，1H)，2.42(dd，J＝4.5，9.5Hz，1H)，1.93(m，1H)，1.84(dd，J＝7.0，14.0Hz，1H)，1.82(s，3H)，1.74(s，3H)，1.70(dd，J＝7.0，14.0Hz，1H)，1.65(s，3H)1.32(d，J＝6.0Hz，3H)，1.25(m，1H)，1.20(t，J＝7.0Hz，3H)，0.95(t，J＝7.5Hz，3H)，0.86(t，J＝7.5Hz，3H)；13C NMR(125MHz，CDCl3)δ167.6s，170.0s，157.5s，152.7s，143.3d，142.9s，140.0d，136.6s，135.9s，135.4s，133.0d，128.6d，126.1d，125.5s，123.7d，113.8s，113.8s，107.1s，101.5d，83.0d，80.2d，76.5d，75.2d，72.5d，71.7d，69.8d，63.4t，62.1q，42.4d，36.4t，31.6t，26.8t，26.0t，25.6t，17.6q，17.2q，15.1q，13.9q，12.3q，10.9q，9.9q。综上所述，推知化合物3的结构如式(1)所示，其中R1＝Cl，R2＝CH3，R3＝H，R4＝H，参考文献J Antibiot(Tokyo)，1987，40(5)：575-88；J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，1987，1353-1359。
本发明的化合物4是从tiaP1-P450基因敲除突变株(TCM69)的发酵液中分离得到的。进一步优选在突变株的发酵培养过程中，加入大孔树脂作为吸附剂，富集吸附化合物4，然后从该吸附剂中分离得到化合物4。化合物4优选的制备方法是：将大孔树脂加入tiaP1-P450基因敲除突变株(TCM69)的培养基中，经发酵培养后，分离出发酵液中的大孔树脂，经乙醇洗脱，乙醇提取物经浓缩回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得代谢产物粗提物，该粗提物经硅胶柱层析，以体积比从100∶0～0∶100的氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为20∶1梯度下洗脱下来的馏分，经凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，收集洗脱下来的馏分，再经硅胶柱层析，以体积比为1∶2的氯仿-乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，收集洗脱下来的馏分，最后经ODS反相中压液相色谱，YMC*GEL ODS-A，12nm S-50μm，30×2.5cm I.D.，流速为15ml/min，以体积分数从20％～84％的乙腈/水为流动相梯度洗脱120min，收集乙腈/水体积分数为84％梯度下洗脱下来的馏分，得到化合物4。
化合物4：淡粉色固体，由高分辨质谱HRFABMS(m/z 1063.4264，[M+Na]+)得到其分子式为C52H74O17Cl2，1H NMR(500MHz，CDCl3)δ7.13(d，J＝11.5Hz，1H)，6.56(dd，J＝12.5，14.0Hz，1H)，5.80(m，1H)，5.76(brs，1H)，5.46(t，J＝8.0Hz，1H)，5.13(t，J＝9.5Hz，1H)，5.02(d，J＝10.0Hz，1H)，5.00(d，J＝10.0Hz，1H)，4.85(dt，J＝6.3，11.5Hz，1H)，4.66(s，1H)，4.66(d，J＝11.8Hz，1H)，4.61(s，1H)，4.41(d，J＝11.8Hz，1H)，4.26(brs，1H)，4.02(d，J＝3.0Hz，1H)，3.69(m，1H)，3.66(overlapped，1H)，3.66(d，J＝9.5Hz，1H)，3.61(overlapped，1H)，3.60(s，3H)，3.51(m，1H)，2.73(m，1H)，2.68(m，1H)，2.51(m，1H)，2.46(m，1H)，2.34(m，1H)，1.87(m，1H)，1.83(dd，J＝7.0，14.0Hz，1H)，1.79(s，3H)，1.68(s，3H)，1.67(dd，J＝7.0，14.0Hz，1H)，1.63(s，3H)，1.32(d，J＝6.0Hz，3H)，1.25(m，1H)，1.15(s，3H)，1.11(s，3H)，0.95(t，J＝7.3Hz，3H)，0.83(t，J＝7.5Hz，3H)；13CNMR(125MHz，CDCl3)δ177.2s，170.0s，167.5s，157.4s，152.4s，143.7d，142.9s，140.3d，136.4s，135.3s，134.5s，133.9d，128.5d，125.6d，125.3s，122.7d，113.6s，107.2s，107.2s，101.5d，94.8d，92.5d，81.2d，76.5d，75.0d，74.6d，73.4s，72.5d，71.7d，71.6d，70.0d，69.8d，63.3t，62.1q，41.1d，36.3t，34.2d，31.4t，28.0q，26.4t，26.0t，25.9t，19.1q，18.7q，18.3q，17.6q，17.1q，14.9q，13.9q，13.3q，10.8q，10.0q。综上所述，推知化合物4的结构如式(1)所示，其中R1＝Cl，R2＝CH3，R3＝H，R4如式(X)所示，参考文献J Antibiot(Tokyo)，1987，40(5)：575-88；J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，1987，1353-1359。
化合物1、化合物2、化合物3和化合物4都属于台勾霉素类化合物，是台勾霉素类的新化合物。
以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213，苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringensis，粪肠球菌Enterococcus faecalis ATCC 29212三种细菌作为指示菌，采用二倍稀释法进行MIC值测定，其结果如表1所示。
表1 各化合物对三种细菌的最小抑菌浓度(μg/ml)
表1中结果明确的显示，化合物1-4具有中等抑菌活性，MIC值在2-64μg/ml之间，因此有望研发成为抗菌新药。
本发明从指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085的突变株中分离了四种新的台勾霉素类化合物，丰富了台勾霉素结构多样性。并发现这四种化合物对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213，苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringensis，粪肠球菌Enterococcus faecalis ATCC 29212具有抑制活性，有望用于研发成为新的抗菌新药。
用于本发明的指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085，已在本申请以前公开记载于美国专利，其专利号为US4918174的专利中。根据该专利文献的记载，指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL 18085保藏于美国农业研究菌种保藏中心(Agricultural Research Service Culture Collection，简写：NRRL)，其登录号为NRRL 18085。
附图说明：
图1是突变株TCM50、TCM57和TCM69的次级代谢产物的HPLC图以及化合物1-4的出峰位置，HPLC条件：色谱柱为phenomex 150×4.6mm(SphereClone SAX)，流动相包括流动A相和流动B相，流动相A相：10％(体积分数)的乙腈+0.08％(体积分数)的三氟乙酸，溶剂为水，流动B相：90％(体积分数)的乙腈，溶剂为水；进样程序：0-20min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95∶5-0∶100，20-21min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0∶100，21-22min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0∶100-95∶5，22-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95∶5，检测波长254nm，流速1ml/min。其中1表示化合物1，2表示化合物2，3表示化合物3，4表示化合物4。
图2是tiaM基因敲除的突变株TCM50的构建，图2-A是tiaM基因敲除示意图：通过发生双交换将包含有转移起始序列oriT和阿伯拉霉素抗性基因acc3(IV)的1369bp置换了tiaM基因中的138bp片段，图中显示了引物的位置和置换的片段大小和PCR条带大小，其中472bp的PCR扩增条带来自于野生型D.aurantiacum NRRL 18085，而1703bp的PCR扩增条带来自于突变株TCM50；图2-B是PCR产物的电泳分析：DNA模板分别来自于：条带3、双蒸水，为阴性对照；条带2、野生型D.aurantiacum NRRL 18085；条带1、突变株TCM50；条带M、DNA标准参照物。
图3是tiaG1基因敲除的突变株TCM57的构建，图3-A是tiaG1基因敲除示意图，通过发生双交换将包含有转移起始序列oriT和阿伯拉霉素抗性基因acc3(IV)的1369bp置换了tia G1基因中的1077bp片段。图中显示了引物的位置和置换的片段大小和PCR条带大小。其中1485bp的PCR扩增条带来自于野生型D.aurantiacum NRRL 18085，而1777bp的PCR扩增条带来自于突变株TCM57。图3-B是PCR产物的电泳分析，DNA模板分别来自于：条带1、双蒸水，为阴性对照；条带2、野生型D.aurantiacum NRRL 18085；条带3、突变株TCM57；条带M、DNA标准参照物。
图4是tiaP1-P450基因敲除的突变株TCM69的构建。图4-A是tiaP1-P450基因敲除示意图，通过发生双交换将包含有转移起始序列oriT和阿伯拉霉素抗性基因acc3(IV)的1369bp置换了tiaP1-P450基因中的1020bp片段。图中显示了引物的位置和置换的片段大小和PCR条带大小。其中1435bp的PCR扩增条带来自于野生型D.aurantiacum NRRL 18085，而1784bp的PCR扩增条带来自于突变株TCM69。图4-B是PCR产物的电泳分析，DNA模板分别来自于：条带1、双蒸水，为阴性对照；条带2、野生型D.aurantiacum NRRL 18085；条带3、突变株TCM69；条带M、DNA标准参照物。
具体实施方式：
以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：tiaM-卤化酶基因敲除突变菌株(TCM50)的获得
利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的台勾霉素合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对tiaM基因的敲除引物
50PTs：5’CAGTTCGGTGCCGACACCCGCTCCTGGCAGGTCGACCGCattccggggatccgtcgacc3’
50PTa：5’GCCGGAGGCGTCGATGACGTAATCCGCCGTCTCGGTCCGtgtaggctggagctgcttc3’
其中引物的5端39bp大写字母部分序列与台勾霉素tiaM基因相匹配，而3端的小写字母部分序列分别与质粒pIJ773中一个包含转移起始序列和阿泊拉抗性基因的片段两侧的DNA序列一致或互补。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入到结合转移的供体菌中。具体步骤如下：(1)将cosmid质粒pCSG5转入大肠杆菌E.coli BW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pCSG5，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，接着回收约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用50PTs和50PTa引物通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μl的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μl，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μl，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水至50μl。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，用LB筛选平板(含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml阿泊拉霉素)上于37℃过夜培养，从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，命名为pCSG50，该质粒中的tiaM基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒pCSG50电转到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG50，作为接合转移的供体菌。
野生型指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.Hamdenensis NRRL 18085菌株在50ml YMS液体培养基中培养3天，4000r/min离心10min收集菌体，弃上清，用同样的培养基清洗菌丝体3遍，悬浮于4ml YMS培养基中，作为接合转移的受体菌。供体菌E.coliET12567/pUZ8002/pCSG50在50ml含25μg/ml卡那霉素，25μg/ml氯霉素和50μg/ml阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.8时，离心收集菌体(4000r/min，10min)，用LB清洗菌体3遍，悬浮于300μl LB培养基中，作为接合转移的供体菌。将上述受体菌和供体菌各取100μl混合均匀涂布于不含任何抗生素的2CMY固体培养基上，吹干后，于30℃培养16h。然后将平板取出后用3ml无菌水覆盖，用灭菌涂棒轻刮平板表面，吸出刮掉的含菌液体。清洗完毕后，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为35μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于30℃培养箱中，培养7天后观察。
当接合转移平板上长出小菌落后，用针头将其转接到含有35μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml甲氧苄氨嘧啶的YMS丰富培养基平板上，30℃培养3天后，将单个突变菌株分别接种到含同样抗生素的2.5ml YMS液体培养基中，于30℃培养5天。抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物
50s：5’CTGTCGGGCAGCAGTTCG3’
50a：5’TCGGGGAGTCCATCACG3’
做诊断PCR来判断筛选基因敲除突变株，能够通过上述PCR引物扩增且仅能扩增出1703bp大小片段的为阳性克隆(见图2-B)，即获得tiaM-卤化酶基因敲除突变菌株(TCM50)。
实施例2：tiaG1-糖基转移酶基因敲除突变菌株(TCM57)的获得
利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的台勾霉素合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对tia G1基因的敲除引物
57PTs：5’GTCCTGCTGGCGTCGCTACCCAGTACCGGACTGATCAAGattccggggatccgtcgacc3’
57PTa：5’GGCCTCGACGATGCGCGCCGCCAGGTCGTGGCAGTCCATtgtaggctggagctgcttc3’
其中引物的5端39bp大写字母部分序列与台勾霉素tiaG1基因相匹配，而3端的小写字母部分序列分别与质粒pIJ773中一个包含转移起始序列和阿泊拉抗性基因的片段两侧的DNA序列一致或互补。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入到结合转移的供体菌中。具体步骤如下：(1)将cosmid质粒pCSG17转入大肠杆菌E.coliBW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pCSG17，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，接着回收约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用57PTs和57PTa引物通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μl的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μl，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μl，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水至50μl。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，用LB筛选平板(含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml阿泊拉霉素)上于37℃过夜培养，从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，命名为pCSG57，该质粒中的tiaG1基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒pCSG57电转到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG57，作为接合转移的供体菌。
野生型指孢囊菌NRRL 18085菌株在50ml YMS液体培养基中培养3天，4000r/min离心10min收集菌体，弃上清，用同样的培养基清洗菌丝体3遍，悬浮于4ml YMS培养基中，作为接合转移的受体菌。供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG57在50ml含25μg/ml卡那霉素，25μg/ml氯霉素和50μg/ml阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.8时，离心收集菌体(4000r/min，10min)，用LB清洗菌体3遍，悬浮于300μl LB培养基中，作为接合转移的供体菌。将上述受体菌和供体菌各取100μl混合均匀涂布于不含任何抗生素的2CMY固体培养基上，吹干后，于30℃培养16h。然后将平板取出后用3ml无菌水覆盖，用灭菌涂棒轻刮平板表面，吸出刮掉的含菌液体。清洗完毕后，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为35μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于30℃培养箱中，培养7天后观察。
当接合转移平板上长出小菌落后，用针头将其转接到含有35μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml甲氧苄氨嘧啶的YMS丰富培养基平板上，30℃培养3天后，将单个突变菌株分别接种到含同样抗生素的2.5ml YMS液体培养基中，于30℃培养5天。抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物
57s：5’GAGCATTGGGAGGCGGTCG3’；57a：5’CGCAGGCCAGCACCACGTC3’
做诊断PCR来判断筛选基因敲除突变株，能够通过上述PCR引物扩增且仅能扩增出1777bp大小片段的为阳性克隆(见图3-B)，即获得tiaG1-糖基转移酶基因敲除突变菌株(TCM57)。
实施例3：tiaP1-P450基因敲除突变菌株(TCM69)的获得
利用PCR-targeting的方法获得体外敲除突变株。根据获得的台勾霉素合成基因簇序列，参照文献报道的PCR-targeting系统，设计一对tia P1基因的敲除引物
69PTs：5’GCAGGCCCCGCACCCGAACTCGACGAGATCCCCGACCGCattccggggatccgtcgacc’
69PTa：5’CCCCTCCCGCCACTCGAGGTCCGCCCCGGTCAGCCGCAGtgtaggctggagctgcttc3’
其中引物的5端39bp大写字母部分序列与台勾霉素tiaP1-P450基因相匹配，而3端的小写字母部分序列分别与质粒pIJ773中一个包含转移起始序列和阿泊拉抗性基因的片段两侧的DNA序列一致或互补。然后参照PCR-targeting的方法构建体外敲除质粒然后转入到结合转移的供体菌中，具体步骤如下：(1)将cosmid质粒pCSG10转入大肠杆菌E.coliBW25113/pIJ790中得到E.coli BW25113/pIJ790/pCSG10，用10mmol/L的L-阿拉伯糖诱导λ/red重组系统表达，并将其制备成为电转感受态细胞待用。(2)用内切酶EcoR I和Hind III酶切质粒pIJ773，接着回收约1.4kb含有转移原点和阿泊拉霉素抗性基因的DNA片段，以此作为PCR模板，用69PTs和69PTa引物通过PCR扩增出1.4kb的PCR产物，50μl的PCR反应体系：高保真DNA聚合酶3U，10×Buffer 5μl，dNTPs 0.5mmol/L，DMSO 2.5μl，引物各0.5μmol/L，DNA模板约1ng，加水至50μl。PCR反应条件为：预变性94℃5min；扩增循环为94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸90s，30个循环；最后72℃延伸10min。将1.4kb的PCR产物回收纯化待用。(3)将PCR产物电转入(1)步骤中制备的感受态细胞使其发生重组，用LB筛选平板(含100μg/ml氨苄青霉素，50μg/ml卡那霉素，50μg/ml阿泊拉霉素)上于37℃过夜培养，从平板上挑出阳性单克隆，抽提质粒，命名为pCSG69，该质粒中的tiaP1-P450基因的部分片段被转移原点和阿泊拉霉素抗性基因取代。(4)将构建好的重组突变质粒pCSG69电转到E.coli ET12567/pUZ8002中，构建成E.coliET12567/pUZ8002/pCSG69，作为接合转移的供体菌。
野生型指孢囊菌NRRL 18085菌株在50ml YMS液体培养基中培养3天，4000r/min离心10min收集菌体，弃上清，用同样的培养基清洗菌丝体3遍，悬浮于4ml YMS培养基中，作为接合转移的受体菌。供体菌E.coli ET12567/pUZ8002/pCSG69在50ml含25μg/ml卡那霉素，25μg/ml氯霉素和50μg/ml阿泊拉霉素的LB液体培养基中于37℃生长至OD600值约为0.8时，离心收集菌体(4000r/min，10min)，用LB清洗菌体3遍，悬浮于300μl LB培养基中，作为接合转移的供体菌。将上述受体菌和供体菌各取100μl混合均匀涂布于不含任何抗生素的2CMY固体培养基上，吹干后，于30℃培养16h。然后将平板取出后用3ml无菌水覆盖，用灭菌涂棒轻刮平板表明，吸出刮掉的含菌液体。清洗完毕后，用含有抗生素的水覆盖平板，其终浓度为35μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml甲氧苄氨嘧啶，吹干后，置于30℃培养箱中，培养7天后观察。
当接合转移平板上长出小菌落后，用针头将其转接到含有35μg/ml阿泊拉霉素和50μg/ml甲氧苄氨嘧啶的YMS丰富培养基平板上，30℃培养3天后，将单个突变菌株分别接种到含同样抗生素的2.5ml YMS液体培养基中，于30℃培养5天。抽取各个突变株的基因组DNA，利用检测引物
69s：5’GGCAACATCCCCCTGTGACC3’；69a：5’GCCCAACTGTGCGCTACGTC3’
做诊断PCR来判断筛选基因敲除突变株，能够通过上述PCR引物扩增且仅能扩增出1784bp大小片段的为阳性克隆(见图4-B)，最后获得tiaP1-P450基因敲除突变菌株(TCM69)。
实施例4：突变菌株TCM50、TCM57和TCM69的发酵以及发酵产物的萃取
1、培养基：
(1)种子培养基：每升种子培养基中含有酵母抽提物4g，可溶性淀粉4g，麦芽糖10g，CoCl2·6H2O 5mg，阿泊拉霉素35mg，余量为水，PH7.2。
(2)发酵培养基：每升发酵培养基中含有葡萄糖20g，鱼粉10g，酵母抽提物2.5g，酸水解酪蛋白2.5g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 1g，CaCO3 3g，大孔树脂(XAD-16)40g，余量为水，pH 7.0。
2、发酵：
分别将指孢囊菌突变株TCM50、TCM57和TCM 69接种到300ml种子培养基中，50m1×6瓶，28℃，200rpm，培养3d，然后按5％的接种量接种到6L发酵液中，200ml×30瓶，28℃，200rpm，培养8d，得到发酵产物。
3、发酵产物的萃取：
分别将指孢囊菌各突变株TCM50、TCM57和TCM 69的发酵产物离心，分离出大孔树脂，大孔树脂用6L乙醇洗脱4次，乙醇提取物减压回收乙醇后用2L乙酸乙酯室温萃取4次，乙酸乙酯层减压浓缩得各突变株TCM50、TCM57和TCM 69的代谢产物粗提物。各代谢产物粗提物经HPLC检测，其结果如图1所示。
实施例5：化合物1的分离
取实施例4中指孢囊菌突变菌株TCM50的代谢产物粗提物4.9g经硅胶柱(300-400mesh，150g)，以体积比从100∶0-5∶1的氯仿-甲醇梯度洗脱，氯仿-甲醇体积比为20∶1梯度下洗脱的馏分含有目标化合物1，该馏分经凝胶sephadex LH-20柱层析色谱(30g)，用体积比为1∶1氯仿-甲醇作为流动相洗脱，进而用中压液相色谱，以ODS反相硅胶(YMC*GEL ODS-A，12nm S-50μm，30×2.5cm I.D.)为固定相，检测波长238nm，收集波长268nm，流速为15ml/min，以体积分数从15％-70％的甲醇/水梯度洗脱120min，再以体积分数从70％-85％的甲醇/水梯度洗脱40min，收集体积分数为80％-84％梯度下馏分，浓缩，继而用硅胶柱(300-400mesh，50g)，以体积比为10∶1的氯仿-甲醇进行洗脱，得到化合物1(200mg)。经结构鉴定，其结构如式(1)所示，其中R1＝H，R2＝CH3，R3＝OH，R4如式(X)所示。
实施例6：化合物2和化合物3的分离
取实施例4中的指孢囊菌突变菌株TCM57的代谢产物粗提物4.5g经硅胶柱(300-400mesh，200g)，以体积比从100∶0-0∶100的氯仿-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为100∶1梯度下洗脱馏分Fr.1和氯仿-甲醇体积比为20∶1梯度下洗脱馏分Fr.2含有目标化合物。馏分Fr.1经凝胶sephadex LH-20柱层析色谱(30g)，流动相为体积比为1∶1的氯仿-甲醇；然后经硅胶柱(300-400mesh，80g)，以体积比从4∶1-2∶1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。收集石油醚-乙酸乙酯体积比为3∶1梯度下洗脱下来的馏分，经凝胶sephadex LH-20柱色谱层析(20g)，流动相为甲醇，得到化合物3(17.8mg)。Fr.2经凝胶sephadex LH-20柱层析色谱(30g)，流动相为体积比为1∶1的氯仿-甲醇，收集洗脱下来的馏分，然后经薄层制备色谱(20×20cm)，展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇，收集Rf值0.6的部位的馏分，得到化合物2(37.8mg)。经结构鉴定，化合物2的结构如式(1)所示，其中R1＝Cl，R2＝H，R3＝H，R4＝H。经结构鉴定，化合物3的结构如式(1)所示，其中R1＝Cl，R2＝CH3，R3＝H，R4＝H。
实施例7：化合物4的分离
取实施例4中的指孢囊菌突变菌株TCM69的代谢产物粗提物5.1g经硅胶柱(300-400mesh，200g)，以体积比从100∶0～0∶100的氯仿-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比20∶1梯度下洗脱下来的馏分，该馏分含目标化合物，该馏分经凝胶sephadex LH-20层析色谱，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇为流动相洗脱，收集洗脱下来的馏分，然后经正相硅胶(300-400mesh，50g)柱色谱，以体积比为1∶2的氯仿-乙酸乙酯为流动相洗脱，收集洗脱下来的馏分，最后经ODS反相中压柱色谱(YMC*GEL ODS-A，ODS-A球型填料，120A孔径，50um粒径，30×2.5cm I.D.)，流速为15ml/min，以体积分数从20％-84％的乙腈/水梯度洗脱120min，84％的乙腈/水恒梯度洗脱30min，收集乙腈/水体积分数为84％梯度下洗脱下来的馏分，得到化合物4(52.1mg)。经结构鉴定，化合物4的结构如式(1)所示，其中R1＝Cl，R2＝CH3，R3＝H，R4如式(X)所示。
实施例8：化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的抑菌活性测定
采用金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213，苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringensis，粪肠球菌Enterococcus faecalis ATCC 29212三种细菌作为指示菌，进行MIC值测定。
菌株金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213和苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringensis菌株作为指示菌培养在Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基中进行MIC测定，粪肠球菌Enterococcus faecalis ATCC 29212菌株使用脑心浸出液培养基(Brain heart infusionbroth)培养。MIC的测定参照the National Committee for Clinical Laboratory Standards方法，使用微量肉汤稀释法(broth microdilution method)测定化合物对各个指示菌的MIC(抗菌谱测定)。
抗菌药物贮存液制备：各样品精密称取5mg以上，用经过0.22μm微孔滤膜过滤的DMSO作溶剂，配置成5.12mg/ml。配制好的抗菌药物贮存液应于4℃冰箱中保存。
MIC板制备：无菌操作，将2倍比稀释后不同浓度的化合物溶液分别加到无菌的96孔透明聚苯乙烯微孔板中，第1至第11孔加化合物，第12孔不加药作为生长对照。使第1孔化合物的终浓度为128μg/ml。
接种物制备：用生长法制备浓度相当于5×108/ml的菌悬液，经肉汤1∶1000稀释后，每孔加入到终体积为100μl，使得第1孔至第11孔化合物的终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。密封后置35℃培养箱中，孵育16-20h观察结果。
结果判断：以用肉眼观察，在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，结果见表1。其结果明确的显示化合物1-4仍然保留了抗菌活力，MIC值在2-64ug/ml之间。由此可见化合物1-4具有中等抑菌活性，有望研发成为抗菌新药。
序列表
<110>中国科学院南海海洋研究所
<120>四种台勾霉素类化合物及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用
<140>201010526416.9
<150>2010-10-28
<160>12
<210>1
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
CAGTTCGGTG CCGACACCCG CTCCTGGCAG GTCGACCGCA TTCCGGGGAT CCGTCGACC 59
<210>2
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
GCCGGAGGCG TCGATGACGT AATCCGCCGT CTCGGTCCGT GTAGGCTGGA GCTGCTTC 58
<210>3
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
CTGTCGGGCA GCAGTTCG 18
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
TCGGGGAGTC CATCACG 17
<210>5
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
GTCCTGCTGG CGTCGCTACC CAGTACCGGA CTGATCAAGA TTCCGGGGAT CCGTCGACC 59
<210>6
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
GGCCTCGACG ATGCGCGCCG CCAGGTCGTG GCAGTCCATT GTAGGCTGGA GCTGCTTC 58
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
GAGCATTGGG AGGCGGTCG 19
<210>8
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
CGCAGGCCAG CACCACGTC 19
<210>9
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
GCAGGCCCCG CACCCGAACT CGACGAGATC CCCGACCGCA TTCCGGGGAT CCGTCGACC 59
<210>10
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
CCCCTCCCGC CACTCGAGGT CCGCCCCGGT CAGCCGCAGT GTAGGCTGGA GCTGCTTC 58
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
GGCAACATCC CCCTGTGACC 20
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
GCCCAACTGT GCGCTACGTC 20
Claims (5)
1.如式(1)所示的四种台勾霉素类化合物：
其中化合物1：R1＝H，R2＝CH3，R3＝OH，R4如式(X)所示；化合物2：R1＝Cl，R2＝H，R3＝H，R4＝H；化合物3：R1＝Cl，R2＝CH3，R3＝H，R4＝H；化合物4：R1＝Cl，R2＝CH3，R3＝H，R4如式(X)所示。
2.一种权利要求1所述的化合物1的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将大孔树脂加入指孢囊菌Dactylosporangium aurantiacum subsp.hamdenensis NRRL18085的tiaM-卤化酶基因敲除突变株TCM50的培养基中，经发酵培养后，分离出发酵液中的大孔树脂，经乙醇洗脱，乙醇提取物经浓缩回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得代谢产物粗提物，将该粗提物经硅胶柱层析，以体积比从100∶0～5∶1的氯仿-甲醇作为洗脱剂梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为20∶1梯度下洗脱下来的馏分，再经凝胶柱层析，以体积比1∶1的氯仿-甲醇作为洗脱剂洗脱，进而用ODS反相中压液相色谱，YMC*GEL ODS-A球型填料，120A孔径，50um粒径，30×2.5cm I.D.，流速为15ml/min，以体积分数从15％-70％的甲醇/水梯度洗脱120min，再以体积分数70％-85％的甲醇/水梯度洗脱40min，收集体积分数80％-84％梯度下馏分，浓缩，再用硅胶柱层析，以体积比为10∶1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，收集馏分，得到化合物1。
3.一种权利要求1所述的化合物2和3的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将大孔树脂加入指孢囊菌NRRL 18085的tiaG1-糖基转移酶基因敲除突变株TCM57的培养基中，经发酵培养后，分离出发酵液中的大孔树脂，经乙醇洗脱，乙醇提取物经浓缩回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得代谢产物粗提物，该粗提物经硅胶柱层析，以体积比从100∶0～0∶100的氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为100∶1梯度下洗脱下来的馏分Fr.1和体积比为20∶1梯度下洗脱下来的馏分Fr.2，馏分Fr.1经凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，收集馏分，然后经硅胶柱层析，以体积比从4∶1～2∶1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比为3∶1梯度下洗脱下来的馏分，再经凝胶柱层析，以甲醇为流动相，收集洗脱下来的馏分，得到化合物3；馏分Fr.2经凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，收集洗脱下来的馏分，再经薄层制备色谱，以体积比为10∶1的氯仿-甲醇为展开剂，收集Rf值为0.6的部位的馏分，得到化合物2。
4.一种权利要求1所述的化合物4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将大孔树脂加入指孢囊菌NRRL 18085的tiaP1-P450基因敲除突变株TCM69的培养基中，经发酵培养后，分离出发酵液中的大孔树脂，经乙醇洗脱，乙醇提取物经浓缩回收乙醇后，用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经浓缩后得代谢产物粗提物，该粗提物经硅胶柱层析，以体积比从100∶0～0∶100的氯仿-甲醇梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为20∶1梯度下洗脱下来的馏分，经凝胶柱层析，以体积比为1∶1的氯仿-甲醇为洗脱剂洗脱，收集洗脱下来的馏分，再经硅胶柱层析，以体积比为1∶2的氯仿-乙酸乙酯为洗脱剂洗脱，收集洗脱下来的馏分，最后经ODS反相中压液相色谱，YMC*GEL ODS-A，12nm S-50μm，30×2.5cmI.D.，流速为15ml/min，以体积分数从20％～84％的乙腈/水为流动相梯度洗脱120min，收集乙腈/水体积分数为84％梯度下洗脱下来的馏分，得到化合物4。
5.权利要求1所述的四种台勾霉素类化合物在制备抗菌药物中的应用。
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