CN106987609A

CN106987609A - 甲氧异黄酮的生物转化制备方法与用途

Info

Publication number: CN106987609A
Application number: CN201710013283.7A
Authority: CN
Inventors: 张德生; 蔡雅婷; 丁秀玉; 江建民
Original assignee: Bio Jourdeness International Group Co ltd
Current assignee: Bio Jourdeness International Group Co ltd
Priority date: 2016-01-13
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2017-07-28
Also published as: TW201725267A; TWI580784B; US20170198318A1

Abstract

本发明有关于甲氧异黄酮的生物转化制备方法与用途，所述制备方法包括：合成具有编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列；将核酸序列接合至表达质粒以形成环状重组质粒；将环状重组质粒置于微生物表达系统中，培养于含有8‑羟基大豆苷元的培养基，使环状重组质粒表达以产生甲氧异黄酮；藉此，所得的甲氧异黄酮具有抑制黑色素形成的用途。

Description

甲氧异黄酮的生物转化制备方法与用途

技术领域

本发明有关于一种利用生物转化制备甲氧异黄酮的方法，尤其指利用带有链霉菌(Streptomyces peucetius)SpOMT2884基因序列的环状重组质粒的微生物宿主，于含有8-羟基大豆苷元(8-hydroxydaidzein)的培养基培养一段时间后，以产生甲氧异黄酮的方法，且此甲氧异黄酮具有抑制黑色素形成的效果。

背景技术

异黄酮(isoflavones)主要存在于植物中，其中以大豆类的含量较高，故又称其为大豆异黄酮；存在大豆中的两种主要异黄酮为大豆苷元(daidzein)与金雀异黄素(genistein)。大豆异黄酮功效广泛，包含抑制细胞增生、抑制醛糖还原酶、抑制酪氨酸酶、抗突变、抗黑色素生成、增进癌症化学治疗效果等等。大豆异黄酮经微生物发酵后的衍生物，如甲基化(methylation)的甲氧异黄酮(methyl-isoflavones)，其稳定性、生物活性以及细胞膜通透性与生物利用性皆优于无甲基化的大豆异黄酮许多；曾有研究指出，4’-甲氧大豆苷元(4’-methoxydaidzein，又名formononetin)的抗黑色素生成活性，比大豆苷元高出10倍。

O-甲基转移酶(O-methyltransferase,OMT)是催化甲氧异黄酮产生的重要酶，其作用为将甲基基团(methyl group)，取代底物(substrate)羟基基团(hydroxyl group,-OHgroup)的氢原子(H)，使之成为甲氧基团(methoxy group,-OCH₃group)。O-甲基转移酶广泛存在于自然界中，目前已知植物或是微生物皆能表现此类酶。

由于甲氧异黄酮在自然界的产量十分稀少，已有研究利用生物转化的方式来制备甲氧异黄酮；例如美国专利US7432425B2将源自植物的7-O-甲基转移酶(7-OMT)基因，转殖入紫花苜蓿(alfafa)中，此基因转殖植物便能将大豆苷元(daidzein)转换成4’-O-甲基化异黄酮(4’-O-methlated-isoflavonoid)。然而，源自植物的O-甲基转移酶的底物特异(substrate specificity)性较高，单一种O-甲基转移酶能转化的底物种类较少，而源自微生物的O-甲基转移酶的底物特异性较低，一种O-甲基转移酶能转化较多种类底物，因此有研究者利用源自微生物的O-甲基转移酶进行试验，利用链霉菌(Streptomyces peucetius)SpOMT2884基因，转殖到微生物载体中转化7,8-二羟基黄酮(7,8-dihydroxyflavone)，藉此产生具有抗氧化能力的7-羟基-8-甲氧黄酮(7-hydroxyl-8-methoxyflavone)(Journal ofBiotechnology,2014,volume 184,page128-137)。

由于黄酮或异黄酮种类繁多，各自具备的功能亦不相同，因此，若能利用生物转换方法，转换出更多具有不同生物功能的甲氧异黄酮，将有助于增进大豆异黄酮应用于美妆、保健或医药组合物的广泛性。

发明内容

发明人本着孜孜不倦的精神，并通过其丰富专业知识及多年的实务经验所辅佐，而据此研发出本发明。

本发明主要目的为提供一种利用生物转化制备甲氧异黄酮(Methoxy-isoflavones)的方法，其主要将8-羟基大豆苷元，以链霉菌(Streptomyces peucetius)的O-甲基转移酶SpOMT2884，转化后制得甲氧化的8-羟基大豆苷元(甲氧异黄酮)，且制备的产物具有抗黑色素生成的功效。

为了达到上述实施目的，本发明提供一种生物转化制备甲氧异黄酮的方法，其包含下列步骤：

步骤一：合成具有编码(encoding)链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列、第一限制酶序列与第二限制酶序列的核酸序列，其中第一限制酶序列与第二限制酶序列分别位于编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列的上下游；

步骤二：将所述编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列以第一限制酶与第二限制酶切割；

步骤三：将表达质粒以第一限制酶与第二限制酶切割，并与步骤(2)切割后的核酸序列接合以形成环状重组质粒；

步骤四：将环状重组质粒置于适合的微生物表达系统中，并以含有8-羟基大豆苷元的培养基培养微生物表达系统，以产生甲氧异黄酮。

于本发明的一实施例中，链霉菌SpOMT2884蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:1。

于本发明的一实施例中，第一限制酶为NdeI且第二限制酶为XhoI。

于本发明的一实施例中，表达质粒为pETDuet^TM。

于本发明的一实施例中，微生物表达系统为大肠杆菌(Escherichia coli)。

于本发明的一实施例中，甲氧异黄酮为具有化学式I的7,4’-二羟基-8-甲氧异黄酮(7,4’-dihydroxy-8-methoxy-isoflavone)或具有化学式II的8,4’-二羟基-7-甲氧异黄酮(8,4’-dihydroxy-7-methoxy-isoflavone)。

本发明亦提供一种甲氧异黄酮在制备抑制黑色素生成的组合物中的用途，其是施予有效剂量为6.25μM～25μM的甲氧异黄酮于所需个体，以抑制黑色素生成；其中甲氧异黄酮较佳为7,4’-二羟基-8-甲氧异黄酮或8,4’-二羟基-7-甲氧异黄酮。

藉此，本发明的甲氧异黄酮可进一步作为美白的化妆材料组成成分。

附图说明

图1：本发明较佳实施例的制备方法步骤流程图。

图2：本发明具体实施例的流程示意图。

图3：本发明具体实施例的环状重组质粒示意图。

图4：本发明具体实施例的SpOMT2884蛋白质电泳图。

图5：8-羟基大豆苷元标准品、未诱导环状重组质粒表达、IPTG诱导环状重组质粒表达24小时的发酵培养基UPLC分析图谱。

图6：本发明的甲氧异黄酮生物转化示意图。

图7：本发明较佳实施例的甲氧异黄酮产量分析图。

图8：本发明较佳实施例的甲氧异黄酮细胞毒性测试以及对于细胞黑色素生成的影响。

具体实施方式

本发明的目的及其优点，将依据以下图面所示的具体实施例予以说明，以使能对本发明有更深入且具体的了解。

请参照图1，为本发明较佳实施例的制备方法步骤流程图，本发明为一种利用生物转化制备甲氧异黄酮(Methoxy-isoflavones)的方法，其包含下列步骤：步骤一(S1)：合成具有编码(encoding)链霉菌(Streptomyces peucetius)SpOMT2884蛋白的核酸序列、第一限制酶序列与第二限制酶序列的核酸序列，其中第一限制酶序列与第二限制酶序列分别位于编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列的上下游，且链霉菌SpOT2884蛋白的氨基酸序列可例如为SEQ ID NO:1；步骤二(S2)：将所述编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列以第一限制酶与第二限制酶切割，其中第一限制酶可例如为NdeI，且第二限制酶可例如为XhoI；步骤三(S3)：将表达质粒(可例如为pETDuet^TM)以第一限制酶与第二限制酶切割，并将步骤(2)切割后的核酸序列接合至表达质粒的相对应限制酶切位上，以形成环状重组质粒；以及步骤四(S4)：将环状重组质粒置于适合的微生物表达系统中，可例如置于大肠杆菌(Escherichia coli)中，并于含有8-羟基大豆苷元的培养基培养此微生物表达系统，以产生甲氧异黄酮，较佳而言甲氧异黄酮为具有如化学式I的7,4’-二羟基-8-甲氧异黄酮(7,4’-dihydroxy-8-methoxy-isoflavone)或具有如化学式II的8,4’-二羟基-7-甲氧异黄酮(8,4’-dihydroxy-7-methoxy-isoflavone)。

本发明另一目的为提供一种甲氧异黄酮在制备抑制黑色素生成的组合物中的用途，其为施予有效剂量为6.25μM～25μM的甲氧异黄酮于所需个体，以抑制黑色素生成，较佳而言，甲氧异黄酮为7,4’-二羟基-8-甲氧异黄酮或8,4’-二羟基-7-甲氧异黄酮。

本发明亦提供以上述步骤生成的甲氧异黄酮，具有抗黑色素生成的能力，可进一步用于组成美白的化妆材料。

此外，通过下述具体实施例，可进一步证明本发明可实际应用的范围，但不意欲以任何形式限制本发明的范围。

简言之，本发明利用生物转化方式将8-羟基大豆苷元转换成甲氧异黄酮，并建立一个可于发酵槽中大量生产甲氧异黄酮的的条件，也确认此甲氧异黄酮具抗黑色素生成的能力。

实施例1；建构含有链霉菌SpOMT2884基因的重组环状质粒

(微生物及材料)

表达质粒pETDuet-1^TM与大肠杆菌(Escherichia coli)购自Novagen公司(Novagen,Madison,WI,USA)。培养基内含的8-羟基大豆苷元由米曲菌(A.oryzae)大量发酵并纯化而得。米曲菌(A.oryzae)与小鼠细胞B16(4A5)自中国台湾生物资料保存及研究中心(Bioresources Collection and Research Center,BCRC)取得。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside，简称IPTG)与3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine，简称IBMX)，与MTT(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide)均购自Sigma-Aldrich公司。氨芐青霉素(ampicillin)，甘油(glycerol)购自东京化成工业(Tokyo Chemical Industry,Tokyo)，并皆为试药等级。

(建构重组大肠杆菌)

本发明欲将链霉菌SpOMT2884基因接合至由IPTG调控的质粒pETDuet^TM，以探讨8-羟基大豆苷元经生物转化产生甲氧异黄酮的情形。首先，请参照图2～图3，为本发明具体实施例的流程示意图与环状重组质粒示意图，利用合成方式取得可编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列与第一限制酶序列、第二限制酶序列的核酸序列，该核酸序列为序列表的SEQID NO:2(681bp)；接着将此核酸选殖(clone)于pETDuet^TM的NdeI/XhoI限制酶切位上，形成环状重组质粒pETDut-SpOMT2884。以电穿孔的方式将pETDut-SpOMT2884转化(transform)至大肠杆菌(Eschericial coli)中形成重组大肠杆菌(recombinant Eschericial coli)。由于大肠杆菌为应用非常广泛的微生物表达系统，其最佳培养条件已广为知悉，且复制速度快，并可以使用诱导物，如IPTG，在所需的时间内诱导目标产物表达，所以在本发明中被选作微生物表达系统。

利用抗生素氨芐青霉素筛选出重组体，将其培养于LR培养基(LeMaster andRichards minimal medium)中，当OD600的光学密度为0.6时，再于培养基中加入最终浓度为0.5mM的IPTG诱导环状重组质粒表达SpOMT2884蛋白质；分别于诱导4小时与8小时后，收集大肠杆菌的蛋白质，并以十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE)初步确认SpOMT2884的表达；大肠杆菌蛋白质收集与SDS-PAGE皆为现有技术，故在此不多赘述。

结果请参照图4，SDS-PAGE第1、2、3栏分别为：无IPTG诱导、IPTG诱导4小时、与ITPG诱导8小时后，以总蛋白质进行SDS-PAGE的结果；第2与第3栏的总蛋白质，于蛋白质大小约30千道尔顿(kDa)处(箭头所指处)，与第1栏相比，可检测到大量蛋白质表达，且此蛋白质量会随着IPTG诱导时间增加而增加；由此图可以初步确认实施例1所得到的大肠杆菌重组体，能受IPTG调控而表达目标蛋白质SpOMT2884。

实施例2：发酵作用与超高液相层析仪(Ultra Performance LiquidChromatography)分析

将大肠杆菌重组体培养于20毫升、内含50微克/毫升氨芐青霉素、0.4％甘油的培养基，于200rpm，37℃的环境下培养；当OD600的光学密度为0.6时，再于培养基中加入最终浓度为0.5mM的IPTG与0.1mM的8-羟基大豆苷元；于加入IPTG后的不同时间点收取0.5毫升的培养物，以UPLC检测其甲氧异黄酮的含量。

对于大规模的反应，将100mL的种菌培养物(seed culture)接种(inoculate)到5升的发酵槽中，此发酵槽含有2.5升的培养基，并添加有50微克/毫升氨芐青霉素、0.4％甘油，然后伴随通气(0.5,v/v/m)和搅拌(280rpm)，于37℃进行反应；当OD600的光学密度为0.6时，再于培养基中加入最终浓度为0.5mM的IPTG与0.1mM的8-羟基大豆苷元，再培养24小时。在不同时间点各收集10mL的培养物，并利用超高液相层析仪(Ultra PerformanceLiquid Chromatography，简称UPLC)分析测定甲氧异黄酮的含量。

两批共5升的大量发酵的产物会先以同等体积的乙酸乙酯(ethyl acetate)萃取，重复两次，萃取物再以抽气机浓缩，抽干后所得的剩余物以200毫升的50％甲醇回溶并以2.2μm尼龙过滤膜过滤，最后再以制备型HPLC方法(preparative HPLC method)进行纯化。

通过制备型HPLC C18反相柱(C18reversed-phase column)(Inertsil,10μm,20.0i.d.250mm,ODS 3,GL Sciences,Eindhoven,The Netherlands)进行HPLC；利用含有1.5％(v/v)醋酸(acetic acid)的水溶液A与甲醇(methanol)溶液B，以线性梯度(lineargradient elution)25％至50％的溶液B洗脱(elution)25分钟，流速为15毫升/分钟；每次使用10毫升的洗脱产物，以吸光值260nm进行HPLC；进行HPLC分析时，会同时收集所测得的产物，将其抽气浓缩，并以冷冻干燥法进行结晶。

结果请参照图5，标准品8-羟基大豆苷元的UPLC分析图谱，纵轴为吸光值260nm测得的吸光强度，横轴为保留时间，8-羟基大豆苷元的保留时间为2.1分钟；无IPTG诱导组的UPLC分析图谱，与标准品比较，此组样本只检测到8-羟基大豆苷元；IPTG诱导24小时后，培养基中除了测得8-羟基大豆苷元外，另测得二新化合物，其保留时间如下：化合物1为3.2分钟，化合物2为3.7分钟。

于图5中所测得的二化合物，通过制备型HPLC方法(preparative HPLC method)纯化且冷冻结晶后，以质谱仪与核磁共振(Nuclear magnetic resonance)分析其结构，确定化合物1为7,4’-二羟基-8-甲氧异黄酮，化合物2为8,4’-二羟基-7-甲氧异黄酮(如图6所示)，为求阅读上的简洁，后文仍以化合物1与化合物2简称此二物质。

为了进一步扩大使用重组大肠杆菌的生物转化反应，本发明人于含有2.5升LR培养基的5升发酵槽进行发酵，并收集IPTG诱导后不同时间点的发酵液，纯化且冷冻结晶后，进行称重。请参照图7，为本发明较佳实施例的甲氧异黄酮产量分析图：横轴为IPTG诱导后所经时间，纵轴为异黄酮重量(○、□、△)或干燥细胞重量(◆)。结果显示，IPTG诱导24小时后化合物1产量为9.3毫克/公升以及化合物2产量为6.0毫克/公升。

实施例3：MTT细胞毒性测试与细胞黑色素含量测试

将小鼠黑色素细胞B16(4A5)细胞以含有10％胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)的DMEM(Dulbecco’s modified Eagles medium)培养基，培养于37℃、5％二氧化碳的环境中。B16(4A5)细胞先以适当密度培养于培养盘中，24小时后，加入黑色素生成刺激试剂IBMX，与自实施例2中纯化的甲氧异黄酮于培养盘中；培养48小时后，进行MTT细胞毒性测试与细胞黑色素含量测试；由于MTT细胞毒性测试与细胞黑色素含量测试为现有技术，故在此不多做赘述。

结果请参照图8，为MTT细胞毒性测试与细胞黑色素含量测试的结果；空心方块为处理化合物1的组别，实心方块为处理化合物2的组别，于细胞毒性测试中，并以不处理任何物质的阴性对照组(negative control)为存活率100％进行比较。结果显示，当小鼠B16细胞施予100μM化合物1时，细胞存活率明显下降；而当B16细胞施予50μM化合物2时，细胞存活率已明显降低，显示化合物2的细胞毒性高于化合物1。在后续黑色素含量试验中，化合物1及化合物2的使用浓度范围介于对细胞无毒性的3.125μM～25μM。

图8细胞黑色素含量测试结果中，以施予黑色素生成刺激试剂IBMX的B16细胞为阴性对照组(negative control)，作为黑色素含量100％进行比较。此外，B16细胞亦处理已知可抑制黑色素生成的达那唑(Danazol)，作为阳性对照组(positive control)。结果显示，化合物1在处理浓度6.25μM时，便具有抑制黑色素形成的能力，当处理浓度增加至12.5μM甚至25μM，其作用更佳；然而，化合物2施予浓度必需高至25μM时，才能显著抑制B16细胞生成黑色素，显示化合物1的抗黑色素形成的能力较化合物2佳。

由上述实施说明可知，本发明与现有技术相较之下，本发明具有以下优点:

1.本发明第一以生物转化方式，将8-羟基大豆苷元转换成二种甲氧异黄酮，其中的甲氧异黄酮为7,4’-二羟基-8-甲氧异黄酮与8,4’-二羟基-7-甲氧异黄酮，且产量分别可高达9.3毫克/升以及6.0毫克/升。

2.本发明为第一确认7,4’-二羟基-8-甲氧异黄酮在无细胞毒性的作用浓度下，可抑制黑色素形成。

序列表 

<110> 张德生

佐登妮丝国际股份有限公司

<120> 甲氧异黄酮的生物转化制备方法与用途

<130> GAI16TW3995

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> 链霉菌（Streptomyces peucetius）

<220>

<223> SpOMT2884 蛋白

<400> 1

Met Thr Gln Asp Gln Trp Gln Ala Val Asp Ala Tyr Ile Ser Asp Leu

1 5 10 15

Leu Val Pro Glu Asp Asp Ala Leu Ala Glu Ala Leu Thr Ala Ser Asp

20 25 30

Ala Ala Gly Leu Pro Arg Ile Asn Val Ala Pro Asn Gln Gly Lys Leu

35 40 45

Leu His Leu Leu Ala Arg Val Gln Gly Ala Arg Thr Ala Leu Glu Ile

50 55 60

Gly Thr Leu Gly Gly Tyr Ser Thr Ile Trp Leu Ala Arg Ala Leu Pro

65 70 75 80

Ala Asp Gly Arg Leu Ile Ser Leu Glu Tyr Asp Pro Ala His Ala Glu

85 90 95

Val Ala Arg Ala Asn Ile Ala Arg Ala Gly Leu Asp Lys Val Val Glu

100 105 110

Val Arg Thr Gly Ala Ala Leu Asp Thr Leu Pro Arg Ile Ala Ala Glu

115 120 125

Pro Gly Ala Gly Pro Phe Asp Leu Val Phe Ile Asp Ala Asp Lys Arg

130 135 140

Asn Asn Ala Arg Tyr Val Glu Trp Ala Leu Arg Leu Thr Arg Pro Gly

145 150 155 160

Ser Val Ile Ile Val Asp Asn Val Val Arg Gly Gly Ala Val Val Asp

165 170 175

Gly Ser Ser Glu Asp Pro Ser Ile Val Gly Thr Arg Glu Met Phe Glu

180 185 190

Leu Val Ala Arg Glu Ala Arg Leu Glu Ala Thr Ala Val Gln Thr Val

195 200 205

Gly Val Lys Gly Tyr Asp Gly Met Leu Val Ala Arg Val Ile Ala

210 215 220

<210> 2

<211> 681

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> NdeI-SpOMT2884-XhoI

<400> 2

catatgactc aagatcaatg gcaagctgtt gatgcctaca tttctgactt gttggttcca 60

gaagatgatg cattggctga agctttgact gcttctgatg ctgctggttt gccaagaatt 120

aacgttgctc caaatcaggg aaagttgttg catttgttgg ctagagttca aggtgctaga 180

actgccttgg aaattggtac attgggtggt tactctacta tttggttggc cagagcattg 240

ccagctgatg gaagattgat ttctttggag tacgatccag cccatgctga agttgctaga 300

gctaacattg caagagccgg attggataag gttgttgaag ttagaacagg tgcagctttg 360

gacactttgc ctagaatcgc cgctgaacca ggtgctggtc cttttgactt ggtcttcatc 420

gacgccgata agagaaacaa cgctagatac gttgaatggg ctttgagatt gactagacca 480

ggttctgtta ttatcgttga taacgtcgtt agaggtggtg ctgttgtcga cggttcttct 540

gaagatcctt ctattgtcgg tactagagag atgtttgaat tggttgccag agaagcaaga 600

ttggaggcta ccgccgttca aactgttggt gtcaagggtt acgatggtat gttggtcgca 660

agagtcattg cctaactcga g 681

Claims

1.一种利用生物转化制备甲氧异黄酮的方法，其包含下列步骤：

步骤一：合成具有编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列、第一限制酶序列与第二限制酶序列的核酸序列，其中所述第一限制酶序列与第二限制酶序列分别位于所述编码链霉菌SpOMT2884蛋白的核酸序列的上下游；

步骤三：将表达质粒以所述第一限制酶与第二限制酶切割，并与步骤(2)切割后的核酸序列接合以形成环状重组质粒；以及

步骤四：将所述环状重组质粒置于适合的微生物表达系统中，并以含有8-羟基大豆苷元的培养基培养所述微生物表达系统，使所述环状重组质粒表达以产生甲氧异黄酮。

2.根据权利要求1所述的利用生物转化制备甲氧异黄酮的方法，其中所述链霉菌SpOMT2884蛋白具有氨基酸序列SEQ ID NO:1。

3.根据权利要求1所述的利用生物转化制备甲氧异黄酮的方法，其中所述第一限制酶为NdeI且所述第二限制酶为XhoI。

4.根据权利要求1所述的利用生物转化制备甲氧异黄酮的方法，其中所述表达质粒为pETDuet^TM。

5.根据权利要求1所述的利用生物转化制备甲氧异黄酮的方法，其中所述微生物表达系统为大肠杆菌。

6.根据权利要求1所述的利用生物转化制备甲氧异黄酮的方法，其中，所述甲氧异黄酮为7,4’-二羟基-8-甲氧异黄酮或8,4’-二羟基-7-甲氧异黄酮。

7.一种甲氧异黄酮在制备抑制黑色素生成的组合物中的用途，其为施予有效剂量为6.25μM～25μM的甲氧异黄酮于所需个体，以抑制黑色素生成；其中所述甲氧异黄酮为7,4’-二羟基-8-甲氧异黄酮或8,4’-二羟基-7-甲氧异黄酮。

8.根据权利要求7所述的一种甲氧异黄酮在制备抑制黑色素生成的组合物中的用途，其中所述甲氧异黄酮进一步作为美白的化妆材料组成成分。