CN101260381B - 一种工程菌及其构建和用其制备d-缬氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种工程菌，该工程菌可以同时表达D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶。其构建方法是将D-海因酶基因克隆到质粒pET-28a，将N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因克隆到质粒pQE-30，然后利用共转化技术将两个重组质粒pET28a-hyd和pQE30-cab共转入同一大肠杆菌细胞。本发明还提供了利用该工程菌转化5’-异丙基海因生产D-缬氨酸的方法。该方法具有产品光学纯度高，生产工艺简单、环保等特点，与现有市场产品相比，生产成本低。
Description
技术领域
本发明属于蛋白质工程技术领域。涉及人工构建工程菌以及酶催化产物的分离纯化。具体是一种可以同时表达重组D-海因酶和重组N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的工程菌的构建以及利用该菌转化生产D-缬氨酸。
背景技术
D-缬氨酸是一种重要的有机手性源，主要应用于手性药物、手性添加剂等领域。用D-缬氨酸代替L-缬氨酸合成的杀虫菊脂杀虫活性提高5000倍，而对动物的毒性却要降低10倍；D-缬氨酸也是合成抗菌性药物的重要原料，如合成抗菌活性药物更生霉素的中间体及二碘代苯二甲酰衍生物药物、合成青霉素前体苯酰基-L-半胱氨酸-D-缬氨酸二硫化物原料、以及合成具有增强免疫力抵抗AIDS等疾病的青霉胺类衍生物；由于D-氨基酸构成的多肽不被或者缓慢的被蛋白酶水解，因此D-氨基酸越来越多地被用于合成生理活性肽。另外，D-缬氨酸参与合成的一种抗肿瘤药物放线菌素D，合成具有增强生物体抵抗病原体的α-酰基胞壁二肽衍生物。
D-缬氨酸的制备，文献报道的方法主要有诱导结晶法，化学拆分法和微生物不对称转化法。微生物不对称转化法是利用可以同时产D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的菌株或者两种各产一酶的天然菌株按比例混合转化5’-单替代海因生成相应的D-氨基酸，其转化过程见图1。该法由于收率高、产物光学活性高、生产工艺简单以及环保无污染等优点，已经逐步取代其它方法而成为生产D-氨基酸的主流。20世纪80年代，日本首创了用微生物转化技术生产D-缬氨酸的新技术。我国有采用可以同时生产两酶的天然菌株生产D-氨基酸的报道(中国专利公告号87108140)。但是天然菌株如农杆菌在发酵过程中容易被噬菌体污染并且需要添加带来环境污染的甲硫乙基海因诱导剂等，因此其生产规模受到很大的限制。如果将两个酶在一个工程菌中表达，进行生物转化，将有可能克服上述缺陷。我们已经从假单胞菌YZ26中克隆到D-海因酶基因(中国专利公告号1560244)，从中华根瘤菌Sinorhizobium sp.SS-ori中克隆到N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因(高技术通讯，13(145)：22-26)，并在大肠杆菌中得到了高效表达(中国抗生素杂志，29(1)：11～14)。
发明内容
本发明的目的是提供一种工程菌及其构建方法，该工程菌可以同时表达D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶。
本发明的另一目的是提供一种利用上述构建的工程菌制备D-缬氨酸的方法。
本发明提供的一种工程菌，含有重组质粒pET28a-hyd和pQE30-cab，可以同时表达D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶。
本发明工程菌，可通过如下方法构建：
(1)将D-海因酶基因(hyd)克隆到质粒pET-28a(Novergen公司)，将N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(以下简称水解酶)基因(cab)克隆到质粒pQE-30(Qiagen公司)；
(2)然后利用共转化技术将两个重组质粒pET28a-hyd和pQE30-cab共转入同一大肠杆菌细胞E.coli BL21(DE3)，获得可以同时表达D-海因酶和水解酶的工程菌细胞E.coliBL21(DE3)/(pET28a-hyd，pQE30-cab)。该工程菌可以转化5’取代基不带电荷的海因衍生物生成相应的D-氨基酸。
所述的D-海因酶基因以假单胞菌Pseudomonas putia YZ26菌株基因组DNA为模板，用PCR法分离克隆得到D-海因酶基因，DNA序列分析表明全长1440bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，不含内含子，共编码479个氨基酸残基，其DNA序列见中国专利(公告号1560244)。
所述的N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因以中华根瘤菌Sinorhizobium sp.SS-ori菌株基因组DNA为模板，用PCR法分离克隆得到N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶(以下简称水解酶)基因，DNA序列分析表明全长915bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，不含内含子，共编码304个氨基酸残基，其DNA序列见《N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶基因的克隆与表达》(高技术通讯13(145)：22-26)。
本发明提供的一种利用上述构建的工程菌制备D-缬氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)将上述构建好的工程菌接种于含50μg/mL Amp和40μg/mL Kan的液体LB培养基，在37℃培养至OD600nm达到0.7-1.2时，加入IPTG至终浓度为0.01-0.4mmol/L，再在16-25℃继续培养8～14h；所述的IPTG可以用乳糖代替；
(2)收集上述培养好的工程菌细胞置于容器中，按每升菌液菌体量加入500mL的比例加入含有50mmol/L异丙基海因溶液，用氮气置换容器中的空气后封口，在35-43℃振荡反应，当底物的转化率达到90％，离心去除菌体；
(3)上清液经活性碳脱色，真空旋转蒸发，乙醇漂洗，双蒸水重新溶解后调节pH至酸性，通过强酸性阳离子树脂，以3～5倍双蒸水洗去杂质，然后以0.5mol/L的氨水洗脱，得到D-缬氨酸溶液，经真空旋转蒸发近干，用无水乙醇洗涤后过滤获得D-缬氨酸。
与现有技术相比本发明的优点和效果：本发明构建的工程菌可以同时表达D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶。在利用该工程菌制备D-缬氨酸过程中，无需中间产物二次穿膜，在一个细胞内就可完成整个转化过程，提高了转化效率，避免了中间产物在二次穿膜过程中被氧化；该方法生产工艺简单、环保等特点，与现有市场产品相比，相对生产成本低。
附图说明
图1：D-氨基酸的生物转化反应示意图
图2：重组质粒pET28a-hyd和pQE30-cab的示意图
图3：D-缬氨酸产品的IR图谱
图4：D-缬氨酸产品的NMR图谱
具体实施方式
实施例1：重组质粒和工程菌的构建
以本室保存菌种假单胞菌Pseudomonas putia YZ26基因组DNA为模板，利用引物5’-CCCGAA TTC CAT ATG TCC CTG TTG ATC CGT-3’和5’-CCC GGA TCC TCA GCG CTG AACTGG-3’进行PCR扩增。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳回收，经Nde I/BamH I双酶切后连接到同样酶切后的载体pET-28a上，获得重组质粒pET28a-hyd(图2)，转化E.coli DH5α感受态细胞，单菌落PCR筛选阳性重组子，Nde I/BamH I双酶切鉴定插入片段大小，最后用DNA序列分析确认。
以为本室保存菌种中华根瘤菌Sinorhizobium sp.SS-ori基因组DNA模板，利用引物5’-GGGGA TCC ATG ACA CGT CAG AAG ATA C-3’和5’-GGG AAG CTT TCA GAA TTC CGC GATCA-3’进行PCR扩增。将PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳回收，经BamH I/Hind III双酶切后连接到同样酶切后的载体pQE-30上，获得pQE30-cab(图2)，转化E.coli DH5α感受态细胞，单菌落PCR筛选阳性重组子，BamH I/Hind III双酶切鉴定插入片段大小，最后用DNA序列分析确认。
取重组质粒pET28a-hyd和pQE30-cab各2μL加入100μL用氯化钙制备的E.coli BL21(DE3)感受态细胞，冰浴30min。42℃热休克2min，然后冰浴5min，加入800μL LB液体培养液，在37℃下振荡培养1h，将菌液离心后吸出800μL上清，重新悬浮菌体后涂在含50μg/mL Amp和40μg/mL Kan的LB平板上，37℃过夜培养。
实施例2：工程菌活性检测
根据酶催化反应性和产物D-氨基酸的结构性质，可以用茚三酮显色法经颜色测定OD570nm 光吸收值计算产物生成的量及酶活性。也可以用HPLC法直接测定。
1.茚三酮显色法
取200μL菌液离心后弃上清，所得菌体用100mmol/L PBS(pH8.0)洗一次，再用1mL溶于相同缓冲液的25mmol/L异丙基海因重新悬浮菌体，对照只用100mmol/L PBS悬浮，37℃ 震荡反应1h，13000r/min离心10min，取400μL反应液加入等体积的2mol/L NaAc缓冲液(pH5.5)，60℃温浴5min，再加入400μL茚三酮(58mg还原茚三酮，58mg水合茚三酮溶于5mL乙二醇甲醚)60℃震荡反应20min，加入2.4mL 65％乙醇震荡后室温放置5min后于OD570nm 读数。用已知浓度的D-缬氨酸为标准产物，在相同体系情况下，绘制标准曲线，求出K值，根据公式计算酶活性。
2.HPLC法
取适量菌体与底物异丙基海因反应一定时间后，12000r/min离心，取上清液直接上样，色谱柱为HypersilTM GOLD C18(250mm×4.6mm，5μm)，用20mmol/L磷酸缓冲液(pH6.5，含10mmol/L四丁基溴化胺)-甲醇(体积比为90∶10)进行洗脱，流速为1mL/min，检测波长为220nm，根据标准物的出峰时间与峰面积可进行定量测定。
酶活单位(U)定义为在上述条件下，以菌体浓度为10OD600nm计，每mL菌体在1min内转化底物生成1μmol D-缬氨酸所需酶量。
分别以海因、苯海因、对羟基苯海因、异丙基海因、羧甲基海因为底物，取适量菌体在最适条件下进行活性测定。结果(表1)显示在五种底物中，不同底物酶活力测定(以最终产物D-氨基酸计算)表明苯海因为最适底物，工程菌不能转化羧甲基海因。
表1工程菌对不同底物的催化反应
注：ND表示未检测到
实施例3：用工程菌E.coli BL21(DE3)/(pET28a-hyd，pQE30-cab)转化5’-异丙基海因生产D-缬氨酸
取按实施例1，从平板上挑取单菌落接于5mL LB(含50μg/mL Amp和40μg/mL Kan)液体培养基中37℃培养10～12h。取上述预培养菌以2％接种量转接于新鲜的含抗生素Amp(50μg/mL)和Kan(40μg/mL)的1L LB液体培养液，37℃震荡培养至菌体浓度达到OD600nm≈1.2时加入IPTG至终浓度为0.2mmol/L，在20℃继续培养10～12h，离心收集菌体。
用无离子水配制400mL 50mmol/L 5’-异丙基海因溶液，用饱和NaOH调pH至9.0，加入 上述收集得到的菌体后装入三角瓶中，用氮气将三角瓶中的氧气置换后封口，在摇床上37℃振荡反应42h。反应结束后经13000r/min离心，上清液用3％活性炭在25℃振荡脱色。脱色后的溶液用13000r/min离心去杂质，上清在60℃真空旋转蒸干，所得固体用无水乙醇洗3次，然后用ddH2O重新溶解后离心取上清。上清液用6N HCl调pH到3.0后通过强酸性苯乙烯阳离子交换树脂(001×7)，先以3倍床体积的去离子水洗去杂质，然后以0.5mmol/L的氨水洗脱得到D-缬氨酸溶液，60℃真空旋转蒸发至近干，用无水乙醇洗涤后得D-缬氨酸，底物转化率和产物收率为别为91.4％和72.2％。
实施例4：D-缬氨酸的产品鉴定
取按实施例三所得D-缬氨酸进行如下分析：
1.熔点测定
取少量产品D-缬氨酸放于载玻片上，于X-5显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)上进行熔点测定，测得样品的熔点为＞290℃，文献值为＞295℃。
2.比旋光度测定
用上海物理光学仪器厂WZZ-1自动指示旋光仪测得产品D-缬氨酸的比旋光度为 
文献值： 
3.元素分析
样品采用氧化温度为1150℃，还原温度为850℃，燃烧后的混合气经吸附柱分离，利用德国Vario EL元素分析仪，热导检测C、H、N元素。产品D-缬氨酸的元素分析表明下述组成：
实测值：C 51.25％， H 9.50％， N 12.17％
理论值：C 51.28％， H 9.40％， N 11.97％
4.红外光谱分析
称取产品D-缬氨酸5mg和995mg溴化钾于玛瑙研钵中充分混合研细，即为5mg/g固体标准溶液，准确称取100mg进行压片，压力控制在24MPa，压片时间为3min。然后将压制好的晶片在日本岛晶公司FTIR-8300红外光谱仪上进行扫描，样品的透射光谱检测3次，保证3次光谱检测中的最大相对误差小于2％，3次光谱检测的平均值作为最终光谱数据。产品D-缬氨酸的红外光谱图见图3
5.1H NMR
溶剂：D2O；共振频率：300MHz；脉动宽度(pw)：10μs；谱宽：30.12KHz；循环延迟时间(d1)：1s；温度：25℃。
D-缬氨酸的结构与编号：
样品利用瑞士BRUKER公司DRX-300超导核磁共振仪进行检测，产品D-缬氨酸的核磁谱图见图4。根据诱导效应、共轭效应、场效应的综合分析，其1H化学位移归属见表2，其中的-NH2和-COOH因谱峰较宽，所以未观察到。产物中H和CH3的1H化学位移值与标准物(Sigma产品)一致。
表2D-缬氨酸的1H化学位移(ppm)
Claims (4)
1.一种工程菌，其特征在于含有如附图2所示的重组质粒pET28a-hyd和pQE30-cab。
2.如权利要求1所述的工程菌的构建方法，包括如下步骤：
(1)将D-海因酶基因hyd克隆到质粒pET-28a，将N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶基因cab克隆到质粒pQE-30；
(2)利用共转化技术将两个重组质粒pET28a-hyd和pQE30-cab共转入同一大肠杆菌细胞E.coli BL21(DE3)，获得可以同时表达D-海因酶和水解酶的工程菌E.coliBL21(DE3)/(pET28a-hyd，pQE30-cab)。
3.一种用权利要求1所述的工程菌制备D-缬氨酸的方法，包括如下步骤：
(1)将上述构建好的工程菌接种于含50μg/mL Amp和40μg/mL Kan的液体LB培养基，在37℃培养至OD600nm达到0.7-1.2时，加入IPTG至终浓度为0.01-0.4mmol/L，再在16-25℃继续培养8～14h；
(2)收集上述培养好的工程菌细胞置于容器中，按每升菌液菌体量加入500mL底物的比例加入浓度为50mmol/L异丙基海因溶液，用氮气置换容器中的空气后封口，在35-43℃振荡反应，当底物的转化率达到90％，离心去除菌体；
(3)上清液经活性碳脱色，真空旋转蒸发，乙醇漂洗，双蒸水重新溶解后调节pH至酸性，通过强酸性阳离子树脂，以3～5倍双蒸水洗去杂质，然后以0.5mol/L的氨水洗脱，得到D-缬氨酸溶液，经真空旋转蒸发近干，用无水乙醇洗涤后过滤获得D-缬氨酸。
4.如权利要求3所述制备D-缬氨酸的方法，其特征在于所述的IPTG用乳糖代替。
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