CN102994522B - 一种编码延胡索酸还原酶的基因及其应用 - Google Patents

Abstract

一种编码延胡索酸还原酶的基因 frd1A，具有下列核苷酸序列之一：1）序列表No.1的DNA序列；2）序列表No.２的氨基酸残基的序列。序列表中序列1的DNA从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到444个碱基以终止密码子TAG结束，存在一个完整的ORF，自5’端的第1-3位核苷酸为frd1A基因的起始密码子ATG，自5’端的第442-444位核苷酸为frd1A基因的终止密码子TAG。本发明所提供的延胡索酸还原酶及其编码酶的基因对研发新的生物工艺生产琥珀酸具有重要的意义和广泛的用途。

Description

一种编码延胡索酸还原酶的基因及其应用

技术领域

本发明涉及一种延胡索酸还原酶及其编码酶的基因与应用。 

背景技术

琥珀酸，又名丁二酸，是一种具有重要应用价值的生物基平台化合物，能够作为化学原材料被广泛应用于合成药品及生物可降解性聚合物。目前主要利用化学合成法生产琥珀酸，然而，传统上的化学法成本高，易造成环境污染，限制了琥珀酸作为基本化工原料的广泛应用。因此，以微生物发酵法生产琥珀酸的研究与开发显得越来越重要。而作为微生物法生产琥珀酸的关键酶——延胡索酸还原酶，对其研究也就受到广泛的重视。 

延胡索酸还原酶（fumarate reductase，Frd，EC 1.3.1.6），主要催化延胡索酸还原为琥珀酸，是很多生物厌氧呼吸的关键酶，延胡索酸作为最终电子受体。革兰氏阴性菌及多数兼性厌氧革兰氏阳性菌，都具有这种特性。并且在一些绿藻、原生动物、寄生蠕虫和低等海洋生物等真核生物的新陈代谢过程中，具有重要作用。该酶催化的延胡索酸还原反应和琥珀酸脱氢酶催化的琥珀酸氧化反应互为逆反应，后者主要存在于有氧呼吸中，是TCA(三羧酸循环)循环中的关键酶之一。 

对于延胡索酸还原酶，目前在模式生物大肠杆菌中的研究比较透彻。这种结构的酶含有3到4个亚单位：A、B、C、D。其中亲水性的Frd-A和Frd-B亚基形成酶催化域，1到2个小的疏水亚基形成膜锚定结构。从大肠杆菌中分 离得到的延胡索酸还原酶是一种醌醇类膜结合型蛋白，具有4个亚基，并与Frd辅基共价结合。与琥珀酸脱氢酶（SDH）即复合体II具有较高的同源性。但是两酶的表达条件有所不同，Frd是在缺氧条件下表达，而SDH则是在有氧条件下表达。Frd由frd(ABCD)操纵子编码，表达4个不同的多肽。其中frdA基因编码66kDa的FAD亚基复合体，而frdB基因则编码27kDa的铁硫簇亚基复合体，这两个亚基组成大肠杆菌的催化域，并通过frdCD编码的Frd-C和Frd-D亚基结合于大肠杆菌内膜上。 

目前已发现延胡索酸还原酶主要可分为两类：膜结合型和可溶型。大多数的延胡索酸还原酶属于膜结合型，含有3-4个亚基，即一个催化亚基，一个铁簇蛋白亚基，以及1-2个将催化亚基和铁簇蛋白亚基结合于膜上的锚定亚基。催化亚基含有活性位点，而铁簇蛋白亚基则通过锚定亚基将电子传递给催化亚基。此类型的延胡索酸还原酶主要是在厌氧条件以及维持氧还平衡时才起还原延胡索酸生成琥珀酸的功能。而第二种类型的延胡索酸还原酶是可溶型的独立酶，与膜结合型酶的催化亚基具有同源性。目前已知的具有此种类型酶的生物还很少。 

不同微生物中延胡索酸还原酶的产生条件及所需辅酶都有所不同，或以NADH为辅酶，或以FAD为辅酶；辅酶与酶蛋白的结合方式也有差别，可共价结合，也可非共价结合；而在酶反应过程中，电子传递中的供受体也有区别，有以泛醌，也有以甲基萘醌。 

当今有关延胡索酸还原酶的研究，均是直接从菌体分离获得，之后再进行酶的特性研究，是所研究微生物自身含有的基因。诸如Cesar Luna-Chavez等人从厌氧培养的大肠杆菌膜碎片中提取到延胡索酸还原酶粗酶液，然后通过 离子交换柱、灌柱、过滤等方法纯化酶，得到了高活性的纯酶液，最后利用非离子去污剂得到了棕黑色的延胡索酸还原酶结晶。但该酶并非微生物正常代谢过程中的必须酶，只有在外界条件改变时才会产生，因此在实际生产时，对外界条件有很高的要求，不利于大规模的生产应用。研究来自于未培养微生物、编码延胡索酸还原酶新基因，不仅可以研发新的生物生产工艺提高琥珀酸产量，也可以为构建高产琥珀酸的基因工程菌提供新的理论参考模式和依据。 

目前国内外还鲜见有关未培养微生物延胡索酸还原酶新基因的研究。因此，利用宏基因组学技术，研究极端环境体系未培养微生物和克隆未培养微生物酶基因，分离筛选新型延胡索酸还原酶基因，在理论上及在实际应用中都具有特别重要的研究意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种编码延胡索酸还原酶的基因及其应用，通过构建来自于广西北部湾海洋环境沉积物宏基因组文库，采用酶的直接测序筛选策略，从基因文库里面分离得到了编码延胡索酸还原酶的新基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产琥珀酸，对于研发新的生物工艺大量生产琥珀酸具有重要的意义和广泛的用途。 

本发明所提供的一种编码延胡索酸还原酶的基因，名称为frd1A，来源于广西北部湾海洋环境体系未培养微生物，具有下列核苷酸序列之一： 

1）一种编码延胡索酸还原酶的基因frd1A，其核苷酸序列为序列表No.1所示。 

2）所述基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如序列表No.2所示。 

序列表No.2所示的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有延胡索酸还原酶活性的蛋白质。 

携带该基因的质粒大肠埃希氏菌Escherichia coli已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC No.5936，保存日期为2012年3月27日，地址 北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

序列表No.1的DNA是克隆重组质粒pGXAR313所含的外源DNA片段中携带的完整开放阅读框架（ORF，Open Reading Frame），该ORF由444个碱基组成，GC含量为49.67％。为一个可能完整的新型延胡索酸还原酶基因，新基因被命名为frd1A。从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到444个碱基以终止密码子TAG结束，为一个完整的ORF，自5’端的第1-3位核苷酸为frd1A基因的起始密码子ATG，自5’端的第442-444位核苷酸为frd1A基因的终止密码子TAG。该ORF一共444个核苷酸可编码由147个氨基酸组成的蛋白。通过Blastx分析该氨基酸序列和来自于菌株“Runella slithyformis DSM 19594”的一个“Succinate dehydrogenase/fumarate reductase iron--sulfur subunit”基因存在82％的相似性，69％的一致性。 

本发明提供的一种编码延胡索酸还原酶的基因的克隆方法包括下列步骤： 

（1）从广西北部湾海洋环境样品中提取未培养微生物宏基因组DNA，构建海洋环境宏基因组文库； 

（2）基于序列特异性的筛选策略，从海洋环境宏基因组文库中分离含有延胡索酸还原酶的克隆。 

本发明提供的编码延胡索酸还原酶的新基因，可在宿主细胞中大量表达该基因以生产延胡索酸还原酶，从而构建新的生物工艺进行琥珀酸的生产，在构建新的生物工艺生产琥珀酸等方面具有广泛的用途。 

附图说明

图1为从广西北部湾海洋环境样品中提取的未培养微生物的宏基因组DNA。 

图2为广西北部湾海洋环境宏基因文库克隆的限制性内切酶EcoRI酶切分析以判断文库质量。 

图3为原始克隆pGXAR313的酶切检测结果。 

图4为frd1A基因DNA序列以及编码产物分析图。 

图5为重组表达克隆E.coli Tuner(DE3)pLacI/pGXAR313G的构建检测分析。 

图6为携带frd1A基因的重组质粒pGXAR313G的DNA转化大肠杆菌E.coli Tuner(DE3)pLacI后得到的重组表达克隆的蛋白的SDS-PAGE分析结果。 

图7为延胡索酸在Frd1A 重组蛋白作用下的产物分析结果。 

图8为不同温度对Frd1A重组蛋白的酶活影响。 

图9为不同pH值对Frd1A重组蛋白的酶活影响。 

具体实施方式

在本发明的实施例中所用到的主要材料包括：EcoRI限制性内切酶、T4 DNA连接酶、小牛肠碱性磷酸酶CIP、pGEM-3Zf(+) 载体购自Promega公司，胰蛋白胨、PVPP(英文全称：Polyvinpolypyrrolidone)购自Sigma公司。 

实施例1 

一种编码新型延胡索酸还原酶的基因frd1A的克隆，包括下述主要步骤1、2、3、4、5。 

步骤1：从海洋环境样品中提取纯化宏基因组DNA，详细的方法步骤描述如下。 

（1） 从广西北海海洋环境体系中采集沉淀物样品，称取4-4.5 g湿润的沉积物，加入10 mL的2份TENS，所述2份TENS为：100 mM Tris-HCL, 40 mM EDTA, 200 mMNaCI, 2% （w/v）SDS, pH8.0；于振荡器上充分混匀； 

（2）加入25 mg/mL Protease-K 100 μL，经70℃水浴溶解30 min，每10 min搅拌混匀一次； 

（3）然后置于液氮中速冻2.5 min，迅速置于-20℃低温冰箱中冷冻5 min，取出后迅即经沸水浴完全溶解。步骤3一共重复3次； 

（4）再置于室温静止3 min；然后在室温下经离心处理，收集上清液置于冰上，沉淀中再加入10 mL的Buffer A ，所述Buffer A 为50 mM Tris-HCL，25 mM EDTA, 3%（w/v）SDS, 1.2%（w/v）PVPP，pH8.0，离心收集上清液；将所有的上清液一起混匀，置于冰上；上清液10～15mL中再次加入0.1g PVPP，同时加入SephadexG-200和20 mL 1份TE缓冲液；所述1份TE缓冲液为：10 mM  Tris-HCl，pH8.0，1mM Na₂EDTA；充分混匀；37℃保温2 h，每30 min混匀一次。离心除去PVPP； 

（5）将所有的上清液用等体积的苯酚、苯酚－氯仿:异戊醇以及氯仿抽提一次；所述苯酚－氯仿:异戊醇的体积比=25:24:1。 

（6）沉淀DNA，每5 mL加入等体积的8mol/L 醋酸铵，1/10体积的醋酸钾溶液；调整醋酸钾溶液的pH为4.8，并加入3倍体积以上的无水乙醇，于零下80℃放置15 min以上； 

（7）以10，000 rpm的转速进行离心收集沉淀10 min后，用75%（v/v）乙醇洗涤2～3次，干燥，溶解于适量的1份TE缓冲液；得到粗制宏基因组 DNA。 

步骤2：采用电洗脱法回收纯化粗制宏基因组DNA，详细的方法步骤描述如下。 

（1）透析袋的处理 

①切取长10-20 cm透析袋； 

②将透析袋在2％（w/v）碳酸氢钠、1mM EDTA溶液中煮沸10 min； 

③取出透析袋用蒸馏水彻底冲洗； 

④在1 mM EDTA溶液中煮沸10 min，勿倒掉溶液； 

⑤让透析袋自然冷却，4℃贮存，注意在贮存期间，应始终让透析袋浸入溶液，以防干燥； 

⑥使用前，用蒸馏水充分冲洗袋的内外壁。 

（2）酶切适量的DNA，使得目标片段有1μg左右，电泳分离后染色，确定目标片段的位置。 

（3）用手术刀片切下含有目标DNA片段的琼脂糖胶条，将它放在宽平的已被1份TAE湿润的药匙上，所述的1份TAE为40 mmol/L的Tris-acetate, 1 mmol/L的 EDTA, pH8.0。 

（4）将透析袋一端封紧，并将透析袋装满1份TAE，然后用药匙将所切胶条放入透析袋中。 

（5）使胶沉到透析袋的底部，去掉多余的缓冲液，使得琼脂糖胶条正好被缓冲液包住，用夹子夹住透析袋的上部，避免产生气泡。 

（6）将含有胶的透析袋放在装有1份TAE的电泳槽中电泳2-3 h，通常电泳强度为4～5V／cm，则DNA被电洗脱到袋子的壁上。 

（7）更换电极，再反向电泳1 min，使DNA从袋壁上返回到透析袋的内腔。 

（8）打开透析袋，小心地倒出胶周围的电泳缓冲液于一EP管内，然后用少量的1份TAE，加到袋中清洗，并将清洗液一并吸入EP管内。 

（9）染胶，检测电洗脱是否完全。 

（10）用苯酚、苯酚／氯仿和氯仿抽提一次，然后用酒精沉淀DNA。干燥后，溶解在10μl 1份TE中。所述的1份TE为10 mM  Tris-HCl，pH8.0；1 mM Na₂EDTA。 

对照图1。在实施主要步骤1和2中，1为λ/HindIII标准样，片段大小从大到小依次为：23.13 kb，9.4 kb，6.6 kb，4.4 kb，2.3 kb，2.0 kb；2为从广西北部湾海洋环境样品中提取分离纯化以后得到的未培养微生物的宏基因组DNA，跑样量为1 μL；3为第三泳道为限制性内切酶EcoRI完全酶切宏基因组DNA以判断宏基因组DNA纯度可以进行分子水平的操作，跑样量为1 μL。 

步骤3：海洋环境样品宏基因组文库的构建，详细的方法步骤描述如下。 

首先采用修改的碱变性法大量提取克隆载体pGEM-3Zf(+)质粒DNA，获得较高纯度质粒DNA，其主要形式是超螺旋CCC，经过EcoR1酶单酶切，变为线性DNA分子，线性pGEM-3Zf(+) 质粒DNA经过CIP去磷酸化酶处理后，直接用来连接部分酶切海洋环境未培养微生物宏基因组DNA。 

用EcoR1对纯化好的宏基因组DNA进行部分酶切，琼脂糖电泳分离酶切产物，将这些片段与经过CIP去磷酸化酶处理过的pGEM-3Zf(+) DNA连接，连接产物用电转化方法导入大肠杆菌DH5α，在含有X-gal、IPTG、氨苄青霉素的Luria-Bertani 固体平板上检测含有重组子的白色大肠杆菌菌落。X-gal、IPTG、氨苄青霉素的浓度分别为：40 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL。 

将阳性单菌落挑板至含有 50 μg/mL氨苄青霉素的Luria-Bertani 固体平板上，37℃培养至菌落为2-3 mm后，再次挑板，将转化子挑取到文库保存培养基于96孔培养板孔中，37℃恒温培养24 h左右, 然后保存于-80℃低温冰箱中。最终得到了30, 00个左右的白色克隆。随机挑取12个转化子提取质粒，然后用EcoR1酶切检测，发现11个有随机插入的外源DNA片段，平均长度为 4.0 kb左右。 

对照图2，其中，1：1kb ladder标准样，片段大小从大到小依次为：10.0 kb，8.0 kb，6.0 kb，5.0 kb，4.0 kb，3.5 kb，3.0 kb, 2.5 kb, 2.0 kb, 1.5 kb，1.0 kb，750 bp，500 bp，250 bp；其它泳道2-11分别为文库克隆质粒DNA经过EcoR1酶切以后的分析结果。 

步骤4：从宏基因组文库中分离筛选表达延胡索酸还原酶活性的克隆，详细的方法步骤描述如下。 

采用直接测序分离筛选方法，用双脱氧核苷酸法在ABI 377 DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列。得到一个编号为pGXAR313的阳性克隆，携带一个可能的编码延胡索酸还原酶的基因。电泳检测结果表明，pGXAR313克隆所携带的外源DNA片段大小为1.0 kb。 

对照图3。其中，1：1kb ladder 标准样，片段大小从大到小依次为：10.0 kb，8.0 kb，6.0 kb，5.0 kb，4.0 kb，3.5 kb，3.0 kb, 2.5 kb, 2.0 kb, 1.5 kb，1.0kb，750bp，500bp，250bp　pGXAR313/EcoRI；2：酶切之前提取纯化得到阳性克隆pGXAR313的质粒DNA；3为EcoR1酶切阳性克隆pGXAR313的质粒DNA的结果。 

步骤5：重组质粒E.coli BL21(DE3)pLysS/ pGXAR313G上表达延胡索酸 还原酶活性的基因的测序和开放阅读框ORF分析，详细的方法步骤描述如下。 

用软件DNAStar对直接测序所得到的序列进行拼接，用NCBI（National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上的软件对DNA序列进行分析，如ORF finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html), Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。 

对照图4，外源DNA片段中携带的可能的编码延胡索酸还原酶的新基因大小为444 bp。从5’端第1个核苷酸开始起始密码子ATG到444个碱基以终止密码子TAG结束，存在一个最有可能的完整的ORF，自5’端的第1-3位核苷酸为frd1A基因的起始密码子ATG，自5’端的第442-444位核苷酸为frd1A基因的终止密码子TAG。经过Blastn软件比较，目标ORF序列在DNA水平上找不到与现有GenBanK 数据库中任何DNA序列存在一致性。表达延胡索酸还原酶活性的基因frd1A编码一个含147个氨基酸的蛋白质，用简单组件结构研究工具（英文名称：Simple Modular Architecture Research Tool，SMART, http://smart.embl-heidelberg.de）分析，由DNA序列推测的来自于未培养微生物的表达延胡索酸还原酶活性的Frd1A蛋白组件结构，发现一个可能的独立催化区域功能结构，该催化结构域由第35个氨基酸开始，到第90个氨基酸结束。编码目标蛋白的基因一共包含441个核苷酸，编码一个由147个氨基酸组成的多肽，用Blastp分析该ORF氨基酸序列，发现该氨基酸序列和来自于菌株“Runella slithyformis DSM 19594”的一个“Succinate dehydrogenase/fumarate reductase iron-sulfur subunit”基因存在82％的相似性，69％的一致性。该氨基酸序列编码的唯一保守性假定蛋白没有明显的亲疏水性，没有形成明显的跨膜结构区域，也不存在低复杂度结构。ExPASy网站相关软件分析frd1A基因编码的 产物 的Theoretical pI/Mw（理论等电点/分子量）为：6.18 / 16.1 kDa。 

对照图4，frd1A基因DNA序列以及目标ORF所编码的氨基酸序列分析。 

实施例2 

frd1A基因重组表达质粒的构建。 

利用美国Novagen公司提供的质粒pETBlue-2作为表达载体和E. coli Tuner (DE3) pLac 作为宿主细胞进行目标基因的异源高效表达；设计正向引物FM1： 5’-CTGGAATTCTATGAATCTTACACTGAAA-3’（加下划线部分为EcoRI酶切位点）； 设计反向引物FM2：5’-TATCTGCAGTTTCGGAACCAGTATAGA-3’（加下划线部分为PstI酶切位点），扩增目标ORF，一共441个核苷酸。将PCR产物与pETBlue-2 载体连接后转化大肠杆菌NovaBlue 细胞并在含X-gal 和IPTG 的Luria-Bertani 固体平板上筛选正向连接的阳性克隆, 将包含重组表达质粒DNA的大肠杆菌细胞命名为 pGXAR313G。将 pGXAR313G 质粒转化至E.coli BL21(DE3)pLysS 得菌株Tuner（DE3）pLacI/ pGXAR313G。 

重组质粒E.coli BL21(DE3)pLysS/ pGXAR313G已在中国普通微生物菌种保藏管理中心完成微生物保存，保存编号编号为CGMCC No.5936，保存日期为2012年3月27日。 

实施例2请参考图5。图5为重组质粒E.coli BL21(DE3)pLysS/ pGXAR313G的构建检测结果。1：1kb ladder标准样，片段大小从大到小依次为：10.0 kb，8.0 kb，6.0 kb，5.0 kb，4.0 kb，3.5 kb，3.0 kb, 2.5 kb, 2.0 kb, 1.5 kb，1.0 kb，750 bp，500 bp，250 bp；2：E.coli BL21(DE3)pLysS/ pGXAR313G 酶切之前的质粒DNA检测结果，跑样量为5 μL；3：使用限制性内切酶MluI和NotI 酶切E.coli BL21(DE3)pLysS/ pGXAR313G之后的质粒DNA检测结果，跑样量为5 μl。 

实施例3 

Frd1A目标蛋白在大肠杆菌系统中的诱导表达和纯化。 

将已被验证正确的具有活力的重组大肠杆菌转接于10 mL含有羧苄青霉素的 LB培养基中，培养10-15 h。从10 mL LB 菌液中取5-10 mL加入到盛有500 mL含有羧苄青霉素LB 液体培养基的1000 mL的三角瓶中， 37℃，220 rpm 振荡培养。2-3 h 后取出1 mL菌液测定OD₆₀₀，当OD₆₀₀ 到0.4-0.6的时候加入IPTG 至终浓度为 1.0 mmo/L，37 ℃ 、220 rpm 振荡培养10 h后，制备粗酶液；采用Novagen公司的Ni-NTA、 His-Bind Resins对重组蛋白进行分离纯化。对制备的对照样品以及分离纯化的目标蛋白进行SDS-PAGE 蛋白表达检测。 

实施例三请参照图6。 图6为重组质粒pGXAR313G所携带frd1A基因转化大肠杆菌E.coli Tuner(DE3)pLacI后得到的重组表达克隆的SDS-PAGE分析结果。1：蛋白质标准样品带，自上而下大小依次为：116.0 kDa, 66.0 kDa, 45 kDa, 35 kDa, 25.0 kDa, 18.8 kDa；2：E.coli BL21(DE3)pLysS/ pETBlue-2 蛋白检测结果，跑样量为2 μL；3：E.coli BL21(DE3)pLysS/ pGXAR313G 蛋白检测结果，跑样量为2 μL；4：采用镍柱亲和层析技术分离纯化得到的Frd1A 蛋白检测结果，跑样量为2 μL。 

实施例4 延胡索酸在Frd1A 蛋白作用下的产物分析 

以延胡索酸为底物，在100 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液体系中，调整pH为7.0，加入 1 mM二硫苏糖醇DTT，使用不同浓度的 NAD⁺ 或者 NADP⁺为H受体，目标蛋白(0.95 mg/ mL in 25 mM Tris，1 mM EDTA, 2 mM DTT, pH7.6)25－50μg，补充双重蒸馏水至为1 mL，32 ^oC下反应。60 min后取出，经离心处理，用滤膜(Vivaspin 500,Vivascience)过滤后取上清液用作检测，反应完毕的体系于－20 ℃条件下保存。使用色谱分离柱：EC250/5.4（4.6×250 mm，5μm）； 流动相采用0.005 M 硫酸水溶液，pH 2.8（用氢氧化钠溶液调节）；控制流速为1.0 mL/min；进样量为20 μL；柱温为室温；利用示差折光检测器在紫外检测波长210 nm处检测产物峰。实验结果表明，由于加氢的作用影响，琥珀酸洗脱峰出现的时间要比延胡索酸要延迟。在Frd1A 蛋白催化作用下，产生了大量的琥珀酸。 

请参见图7，其中，产物琥珀酸为图中第二个标示的出峰。 

实施例5 

不同温度和不同pH条件对延胡索酸还原酶的酶活影响 

从20℃到60 ℃，设置不同的实验温度条件，测定不同温度下重组蛋白Frd1A的酶活。使用的分析仪器有：美国安玛西亚UltroSPec 4300 Pro紫外可见光/分光光度计，在340 nm波长处监测OD值的变化。 

结果请参见图8，结果发现在30℃时目标蛋白具有最高的酶活。 

在其它条件相同的情况下设置不同pH值(6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，测定不同pH值下重组蛋白Frd1A的酶活。 

结果请参见图9，结果显示pH值为7.0的目标蛋白具有最高的酶活。 

Claims (3)

1.一种编码延胡索酸还原酶的基因frd1A，其特征在于，其核苷酸序列为序列表No.1所示。

2.权利要求1所述基因编码的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如序列表No.2所示。

3.权利要求1所述的基因frd1A在制备延胡索酸还原酶中的应用。