CN112940963A

CN112940963A - 脱乙酰酶DacApva、编码基因及其在脱乙酰反应中的应用

Info

Publication number: CN112940963A
Application number: CN202110093856.8A
Authority: CN
Inventors: 周宁一; 殷超凡; 许楹
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Shanghai Jiaotong University
Priority date: 2021-01-22
Filing date: 2021-01-22
Publication date: 2021-06-11
Anticipated expiration: 2041-01-22
Also published as: CN112940963B

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种产脱乙酰酶DacA_pva的细菌、脱乙酰酶DacA_pva、编码基因dacA_pva及其在脱乙酰反应中的应用。该细菌保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2021114。该酶可催化乙酰化PVA、木聚糖和7‑氨基头孢烷酸等含乙酰基底物的脱乙酰过程，通过在大肠杆菌高效表达并纯化DacA_pva，并进一步通过HPLC及红外方法确认了其催化反应的产物为乙酸和脱乙酰基化合物。该酶催化的脱乙酰基反应具有反应过程简单、条件温和、环境友好以及较广的脱乙酰底物谱等优点。

Description

脱乙酰酶DacApva、编码基因及其在脱乙酰反应中的应用

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种产脱乙酰酶DacA_pva的细菌(Comamonas sp.strain NyZ500)、脱乙酰酶DacA_pva、编码基因dacA_pva及其在脱乙酰反应中的应用。

背景技术

聚乙烯醇(PVA)作为一种水溶性高分子材料广泛用于造纸、纺织等化工领域，是一种极其重要的化工原料。乙酰基含量是PVA在化工应用中需要考虑的重要理化性质，如完全水解的PVA必须在高温下才能溶于水，而部分水解的PVA往往可以在较低的温度下溶于水。PVA的化工生产多是以有机试剂为溶媒，由前体物质聚乙酸乙烯酯(PVAc)在高温下酸解或碱解得到，通过控制水解反应进程，可生产不同乙酰基含量的PVA。所以，化工生产中，PVA乙酰基团的脱除一方面依赖于有毒化学试剂，同时又需要高温条件，是一种高能耗且对环境不友好的工艺。同化学催化相比，生物法脱乙酰反应具有高效且环境友好等显著优点，因此，分离鉴定高效广谱的生物脱乙酰催化剂(或酶)具有非常大的应用前景。

发明内容

本发明提供了一种产脱乙酰酶DacA_pva的细菌，该细菌自活性污泥中分离，是以乙酰化PVA为唯一碳源生长的菌株，命名为Comamonas sp.strain NyZ500。从该细菌中，我们发现一个关键的水解酶基因，其编码产物为脱乙酰酶DacA_pva，它可催化乙酰化PVA、木聚糖及7-氨基头孢烷酸等含乙酰基底物的脱乙酰过程。通过在大肠杆菌高效表达并纯化DacA_pva，并进一步通过HPLC及红外方法确认了其催化反应的产物为乙酸和相应的脱乙酰基化合物，从而在分子生物学与生化水平证明了DacA_pva负责乙酰PVA、木聚糖及7-氨基头孢烷酸乙酰基团的脱除。

本发明的技术方案如下：

本发明公开了一种产脱乙酰酶DacA_pva的细菌(Comamonas sp.NyZ500)，其于2021年01月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2021114，分类命名：Comamonas sp.strain NyZ500(丛毛单胞菌NyZ500)，拉丁文学名：Comamonas sp.保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

本发明还公开了上述的细菌在脱乙酰反应中的应用。

本发明还公开了上述的脱乙酰酶DacA_pva，所述的脱乙酰酶DacA_pva的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还公开了上述的脱乙酰酶DacA_pva的基因dacA_pva。

在本发明的一实施例，所述的编码基因dacA_pva如SEQ ID No.2所示。

本发明还公开了上述的脱乙酰酶DacA_pva编码基因dacA_pva的表达载体。

在本发明的一实施例，所述的表达载体为pET-28a(+)-dacA_pva。

本发明还公开了上述的表达载体的重组细胞系。

在本发明的一实施例，所述的重组细胞系为大肠杆菌。

本发明还公开了上述的脱乙酰酶DacA_pva在脱乙酰反应中的应用。

在本发明的一实施例，上述脱乙酰酶DacA_pva在脱乙酰反应中的应用方法为：将脱乙酰酶DacA_pva加至含乙酰基底物溶液中，在25-65℃条件下进行催化反应，完成脱乙酰反应。

本发明的一实施例，含乙酰基底物可以为乙酰化PVA、、头孢菌素C或葡萄糖五乙酸酯、木聚糖或7-氨基头孢烷酸等含乙酰基底物。其中，乙酰化PVA可以为不同乙酰基含量的PVA，如含100％乙酰基的PVA，即聚乙酸乙烯酯PVAC，PVA1788(聚合度：1700，水解度：87％-89％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)PVAxx78(聚合度未知，水解度：74％-80％，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

(1)较高的催化效率。目前尚无生物法脱除乙酰化PVA乙酰基团的方法，本发明涉及的生物酶DacA_pva可以在约40分钟完成乙酰PVA乙酰基团的脱除，是一种具有应用潜力的高效生物催化剂。

(2)环境友好、能耗低。同化工转化方法相比，本发明涉及的酶法转化方法可以在温和条件下进行，并且不需要使用有毒的化学试剂，是一种对环境无污染，且能耗不高的转化方法。

(3)具有较广的脱乙酰底物谱。本发明涉及的脱乙酰酶可完成乙酰PVA、木聚糖和7-氨基头孢烷酸乙酰基团的脱除。

附图说明

图1为本发明的一实施例脱乙酰酶DacA_pva的表达纯化分子量测试结果(SDS-PAGE)示意图。

图2为本发明的一实施例以两种乙酰PVA及PVAc为底物，脱乙酰酶DacA_pva脱乙酰反应后的HPLC图。

图3为图2中脱乙酰酶DacA_pva对PVA1788脱乙酰的时间进程结果，其中，上升曲线反应乙酸的生成，下降曲线反应PVA1788中乙酰基团的含量减少。

图4为本发明的另一实施例以乙酰木聚糖和7-氨基头孢烷酸为底物，脱乙酰酶DacA_pva脱乙酰反应后的HPLC图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

一、产脱乙酰酶DacA_pva的细菌(Comamonas sp.NyZ500)的获得

将来源于苏州污水处理厂的活性污泥(约1g)加入100mL含有0.3％(w/v)PVA1788的无机盐基本培养基中(0.7g/L KH₂PO₄、0.7g/L K₂HPO₄、0.7g/L MgSO4·7H2O、1.0g/LNH₄NO₃、0.005g/L NaCl、0.002g/L FeSO4·7H2O、0.002g/L ZnSO₄·7H₂O和0.001g/LMnSO₄·H₂O)，在30℃、180rpm的摇床中进行富集培养，每隔一周，取5mL富集培养液转接到新的100mL含有0.3％(w/v)PVA1788的无机盐基本培养基中进行进一步富集，经过三轮上述富集操作后，将富集培养液涂布在含有0.3％(w/v)PVA1788的无机盐琼脂平板上，于30℃培养箱培养，直至形成单一菌落，将所获得单一菌落转接至含有PVA1788的无机盐培养基中确认其生长表型，并通过16S rRNA基因进行属分类水平鉴定，最终获得可以利用PVA1788生长的纯培养菌株Comamonas sp.strain NyZ500.将菌株NyZ500接种到LB(5g/L酵母粉，10g/L蛋白胨，10g/L氯化钠)丰富培养基中，30℃、180rpm摇床培养。根据其培养性状对菌株进行鉴定。

培养性状：菌株NyZ500培养前期为白色，后期逐渐变为粉红色，基物为黄色，培养过程不变色。

实施例2

一、DacA_pva的表达和纯化。

从Comamonas sp.strain NyZ500基因组中通过PCR扩增出去除信号肽的DacA_pva基因序列，然后用一步法克隆试剂盒将其融合到pET-28a(+)中(通过NdeI和BamHI消化)，形成His₆-DacA_pva过表达质粒pET-28a(+)-dacA_pva。将测序验证过的质粒转化到E.coli BL21(DE3)中，形成的细胞为BL21(DE3)[pET-28a(+)-dacA_pva]，将其在含有卡那霉素(50μg/mL)的LB中(180rpm，37℃)培养至OD₆₀₀为0.6，然后用0.1mM IPTG在150rpm和16℃下诱导过夜。清洗两次后，再次重悬于同样的缓冲液中，随后冰水浴中超声破碎，细胞裂解液13,000g离心40分钟后收集上清液，利用HisTrap HP亲和层析柱和AKTA蛋白纯化系统对细胞抽提液进行蛋白纯化。重组His₆-DacA_pva溶解在相同的PB缓冲液中，通过经SDS-PAGE鉴定，如图1所示，由蛋白DacA_pva氨基酸序列计算其大小约为44kDa，与其SDS-PAGE检测条带大小结果一致。蛋白浓度用Nano-300仪器测定，通过检测280nm处吸收峰(蛋白特征吸收峰)由仪器直接转换为蛋白浓度。

二、酶活性测定

底物包括PVAc及两种乙酰PVA(PVA1788和PVAxx78)。PVA均溶解在PB缓冲液(100mM，pH7.4)中，浓度为3％(w/v)。37℃条件下，将5μl DacA_pva(2.8mg/ml)加入500μl底物中开始反应，并保持适当的反应时间。反应终止时加入H₂SO₄酸化(终浓度为5mM)，并在85℃下煮沸10min停止反应，然后进行HPLC分析。同一反应体系以等量缓冲液代谢酶作为对照。实验结果如图2所示。从图中可以看出，脱乙酰酶DacA_pva可以脱除乙酰PVA的乙酰基团生成产物乙酸。伴随着反应时间的延长，脱乙酰产物乙酸逐渐增加。并且脱乙酰酶DacA_pva对PVA1788(水解度：87-89％)和PVAxx78(水解度：74-80％)表现出类似的催化效率，这说明脱乙酰酶DacA_pva对不同水解程度的乙酰PVA具有相当的催化活性。

由于PVAc不溶于水，将20mg PVAc(平均分子量为30000～50000)加入500μl PB缓冲液(pH7.4)中，加入10μl酶，在37℃下开始反应，反应适当时间，停止反应的方法同上，然后用HPLC分析，同一反应体系以等量缓冲液代谢酶作为对照。乙酸的保留时间约为14min。实验结果如图2所示。同乙酰PVA这一水溶性底物相比，脱乙酰酶DacA_pva对非水溶性底物PVAc催化效率较低，这主要是由于固体底物PVAc在溶液体系中和脱乙酰酶DacA_pva相互接触的机会大大减小所致。通过酶固定化、蛋白工程改造等技术可以进一步提高DacA_pva对固体底物PVAc的催化效率。

三、反应产物的HPLC分析

采用配备有机酸分析柱(Aminex HPX-87H，300x7.8mm，Bio-Rad)的HPLC(Waters)分析乙酰PVA及PVAc脱乙酰化产生的乙酸含量。样品经过0.22μm滤膜过滤后进样10μl进行分析。在50℃条件下，以5mM H₂SO₄为单一流动相，流速为0.6ml/min，检测波长为210nm。实验结果如图2及图3所示

四、PVA中乙酰基含量的红外分析。

PVA1788样品经过充分干燥后，进行红外光谱扫描。其乙酰基的含量是通过计算红外光谱中1251cm^-1(乙酰酯键)和1093cm^-1(羟基)波数处的吸光度的比值计算。实验结果如图3所示，从图中可以看出，脱乙酰酶DacA_pva可以在较短时间内(约40min)完成PVA1788乙酰基团的脱除。

实施例4

一、脱乙酰酶DacA_pva的底物谱分析

将DacA_pva与其它乙酰化底物反应检测其催化底物谱，具体包括乙酰木聚糖和7-氨基头孢烷酸(7ACA)。分别将乙酰木聚糖(10％，w/v)和7ACA(5mM)按照上述酶活检测方法所述溶解于PB缓冲液中制备对应的乙酰木聚糖及7ACA反应底物。对乙酰木聚糖按照上述酶活检测所述相同方法进行催化反应，而后按照上述HPLC检测方法检测反应产物乙酸。结果如图4a所示。同对照相比，可以发现DacA_pva可以完成脱除乙酰木聚糖的乙酰侧链形成乙酸。

由于脱乙酰酶DacA_pva对7ACA的脱乙酰反应非常迅速，故而将反应所用酶浓度降低(酶量为28μg)，而后在25℃-65℃条件下反应适当时间，反应液通过加入H₂SO₄调节pH后，使用0.22μm滤膜过滤后，通过HPLC(C18分析柱，流动相为20mM乙酸钠(pH5.5)和乙腈以93∶7体积比混合，流速为0.5ml/min，检测波长为254nm)检测脱乙酰7-氨基头孢烷酸(D7ACA)的生成。对照以等量PB缓冲液代替酶进行反应。结果如图4b所示。从图中可以看出，脱乙酰酶DacA_pva可以脱除7-氨基头孢烷酸的乙酰基团，将其转化为脱乙酰-7氨基头孢烷酸。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海交通大学

<120> 脱乙酰酶DacApva、编码基因及其在脱乙酰反应中的应用

<130> 20210120

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 427

<212> PRT

<213> 丛毛单胞菌属（Comamonas sp.）

<400> 1

Met Tyr Lys Leu Lys Pro Asn Pro Phe Thr Arg Arg Ser Leu Phe Lys

1 5 10 15

Ser Leu Val Thr Val Ala Val Leu Ser Ala Ser Leu Ser Gly Cys Gly

20 25 30

Gly Ser Asn Asp Asn Ala Asn Ala Leu Glu Ser Lys Phe Tyr Ala Ser

35 40 45

Trp Thr Ala Ser Met Ser Asp Ala Thr Gln Val Leu Pro Gly Ala Ala

50 55 60

Pro Ala Ala Ser Gln Ser Phe Asn Asn Gln Thr Val Arg His Val Leu

65 70 75 80

Arg Leu Ser Leu Gly Gly Asn Thr Leu Arg Val Lys Val Ser Asn Leu

85 90 95

Phe Gly Lys Ser Pro Ile Thr Phe Thr Ala Val Arg Val Ala Lys Ser

100 105 110

Thr Gly Gln Ser Asn Ile Asp Val Ser Thr Asp Lys Ser Val Thr Phe

115 120 125

Asn Gly Gln Ala Ser Val Thr Leu Glu Ala Gly Thr Glu Leu Val Ser

130 135 140

Asp Ala Val Asn Leu Glu Val Ala Pro Leu Thr Asn Ile Ala Val Ser

145 150 155 160

Met Tyr Phe Ser Ser Pro Thr Ala Met Pro Thr Val His Ala Leu Gly

165 170 175

Val Gln Thr Ala Phe Ile Gly Ala Gly Asn Gln Thr Ala Ala Thr Ser

180 185 190

Ile Ser Ala Ala Ala Ala Asp Gln Ser Gln Ser Tyr Tyr Gly Leu Thr

195 200 205

Ala Leu Glu Val Ser Ser Ile Gln Lys Thr Asn Val Val Val Thr Phe

210 215 220

Gly Asp Ser Ile Thr Asp Gly Tyr Lys Ser Thr Val Asp Ala Ser Lys

225 230 235 240

Arg Tyr Pro Asn Gln Leu Asp Asp Arg Leu Lys Thr Ala Gly Phe Ser

245 250 255

Arg Ile Gly Val Val Asn Gln Gly Ile Ser Gly Asn Arg Trp Leu Asn

260 265 270

Asp Phe Ser Gly Pro Ser Gly Thr Ser Arg Phe Asp Arg Asp Val Leu

275 280 285

Asn Val Thr Gly Ile Thr His Ala Ile Ile Leu Leu Gly Val Asn Asp

290 295 300

Leu Gly Phe Ser Ala Trp Leu Ala Pro Thr Gln Thr Val Thr Ala Glu

305 310 315 320

Gln Val Ile Ala Ala Met Thr Thr Ala Ile Val Lys Ala Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Ile Lys Val Phe Val Gly Thr Ile Ile Pro Phe Lys Gly Ala Ser

340 345 350

Met Gly Tyr Tyr Tyr Thr Asp Ala Ala Glu Ala Lys Arg Gln Thr Ile

355 360 365

Asn Thr Phe Ile Arg Asn Ser Lys Glu Ile Asp Gly Val Ile Asp Phe

370 375 380

Ala Asp Ala Leu Lys Asn Pro Ala Asp Pro Leu Thr Ile Asn Pro Ile

385 390 395 400

Tyr Asp Ser Gly Asp Ala Leu His Pro Asn Asp Ala Gly Tyr Glu Ala

405 410 415

Met Ala Ala Ala Ile Asp Leu Ser Lys Leu Gln

420 425

<210> 2

<211> 1284

<212> DNA

<213> 丛毛单胞菌（Comamonas sp.）

<400> 2

atgtataaac taaagcccaa tccatttacg cgtagaagtt tattcaaatc gctggttaca 60

gttgcagtac tttctgcaag tctgtcaggt tgcggtggaa gcaacgataa cgccaacgca 120

ttagagagca aattttatgc atcatggaca gcttcgatgt ctgatgcgac ccaagtgtta 180

cctggtgcgg cgcctgcagc ctcacagtct ttcaacaacc aaacagttcg ccacgtgtta 240

agactgtcgc tgggcggcaa cacattgcgt gtcaaggtgt ccaacctttt cggaaaatcc 300

cccattactt ttactgccgt acgagtggcg aaaagcactg ggcagtcgaa tatcgacgtt 360

agcaccgata aatcagtaac gttcaacggt caagcttctg ttactttgga agccggaact 420

gaattagtaa gcgatgccgt taacttggaa gtcgcaccgc tgacaaatat cgctgtctca 480

atgtactttt ctagtccaac tgcaatgccc acagtgcatg cgctaggcgt gcagaccgct 540

tttataggcg caggaaatca aaccgctgcc acgtcaatat ctgcagcagc ggcagaccaa 600

agtcagtcgt actacggcct gactgccttg gaagtttcca gcatccaaaa aaccaatgtg 660

gttgtcacct ttggtgactc aataaccgat ggctacaagt ccacagtaga tgcaagcaag 720

cgttatccaa atcagctgga tgatcgcttg aaaacggccg gattttctcg cattggcgtg 780

gtcaatcaag gtatttctgg taaccgctgg ctgaacgatt tttccggtcc aagcggcact 840

agcaggttcg accgtgacgt attaaacgtc accggtataa cgcacgcgat tattcttttg 900

ggagttaatg atttaggatt ttcagcttgg ttagcaccga cacagacagt gactgcggaa 960

caagttatcg cagccatgac tacggcgatt gtcaaagcca aggcgaaagg aataaaagtc 1020

tttgtcggaa ccattattcc ttttaaagga gcaagcatgg gttattatta cacagacgct 1080

gcagaggcaa agcgacaaac aattaacact ttcatcagaa attctaagga aatagatggt 1140

gttattgatt ttgccgatgc attgaaaaat cctgctgatc cattaaccat taaccctatc 1200

tatgatagcg gcgacgcttt gcacccgaac gatgcaggct atgaagcaat ggcagcggca 1260

attgatctta gcaagttaca atag 1284

Claims

1.一种产脱乙酰酶DacA_pva的细菌(Comamonas sp.strain NyZ500)，其特征在于，其于2021年01月20日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2021114。

2.权利要求1所述的细菌在脱乙酰反应中的应用。

3.一种如权利要求1所述的脱乙酰酶DacA_pva，其特征在于，所述的脱乙酰酶DacA_pva的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

4.一种编码如权利要求3所述的脱乙酰酶DacA_pva的基因dacA_pva。

5.根据权利要求4所述的脱乙酰酶DacA_pva的编码基因dacA_pva，其特征在于，所述的编码基因dacA_pva如SEQ ID No.2所示。

6.一种含有权利要求4或5所述的脱乙酰酶DacA_pva编码基因dacA_pva的表达载体。

7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pET-28a(+)-dacA_pva。

8.一种含有权利要求6或7所述的表达载体的重组细胞系。

9.根据权利要求8所述的重组细胞系，其特征在于，所述的重组细胞系为大肠杆菌。

10.一种利用权利要求3所述的脱乙酰酶DacA_pva在脱乙酰反应中的应用。

11.根据权利要求10所述的脱乙酰酶DacA_pva在脱乙酰反应中的应用，其特征在于，将脱乙酰酶DacA_pva加至含乙酰基底物溶液中，在25-65℃条件下进行催化反应，完成脱乙酰反应。

12.根据权利要求11所述的脱乙酰酶DacA_pva在脱乙酰反应中的应用，其特征在于，所述的含乙酰基底物为乙酰化PVA、木聚糖、7-氨基头孢烷酸、头孢菌素C或葡萄糖五乙酸酯。