JP4934037B2 - ニトリラーゼ突然変異体を使用した３−ヒドロキシカルボン酸の生成 - Google Patents

Description

本発明は分子生物学および微生物学分野に関する。より具体的には本発明は、３−ヒドロキシニトリルを３−ヒドロキシカルボン酸に転換する改善されたニトリラーゼ活性を有する突然変異ニトリラーゼに関する。

（関連出願の相互参照）
本願は、２００４年８月１６日に出願された米国非仮出願第１０／９１９１８２号の優先権の利益を主張する。

優れた性能、ユニークな特性、改善された費用効率、品質、および生態学的影響が小さい新しいポリマーは、工業にとって持続的な関心の対象である。特に分枝した緻密な構造および末端に位置する反応性基を有する官能性ポリマーは、従来の直鎖ランダムコポリマーと比べてより低い固有粘度およびより高い反応性のために需要がある。

このような優れたポリマーは、超分枝ヒドロキシカルボン酸コモノマー（超分枝ＡＢ_ｎタイプ、式中、ＡおよびＢはヒドロキシル−またはカルボキシル由来反応性基がある部分であり、ｎは２以上である）（（非特許文献１）および（非特許文献２））、および３−ヒドロキシ吉草酸（３−ＨＶＡ）および３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢＡ）をはじめとする多様な直鎖ヒドロキシカルボン酸コモノマー（直鎖ＡＢタイプ）を共重合させて調製できる。

３−ヒドロキシカルボン酸は、直鎖ポリエステルを作成するための（コ）モノマーとして有用である。ポリエステルは熱可塑性、熱硬化性、半晶質、非晶質、硬質、およびエラストマー材料として有用である。それらは繊維、フィルム、成形品、およびコーティングのベースである（非特許文献３）。

３−ヒドロキシ吉草酸が、カンジダ・ルゴーサ（Ｃａｎｄｉｄａ ｒｕｇｏｓａ）を使用した発酵中で、吉草酸の３−ヒドロキシル化によって調製されており（非特許文献４）（特許文献１）、そしてシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、アルスロバクター・オキシダンス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ）、およびアルスロバクター・クリスタロピエテス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｐｉｅｔｅｓ）（米国特許公報（特許文献２））による吉草酸の発酵性３−ヒドロキシル化によって、３−ヒドロキシ吉草酸の単一鏡像異性体が同様に調製された。吉草酸の発酵性酸化のためのこれらの方法は、典型的に３−ヒドロキシ吉草酸を低生成物濃度で生成し、発酵液からの３−ヒドロキシ吉草酸の手の込んだ高価な分離を必要とする。（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸が、ポリ（３−ヒドロキシ酪酸／３−ヒドロキシ吉草酸）の化学分解（非特許文献５）、または発酵性自己分解（特許文献３）によって調製されているが、ヒドロキシ酪酸／ヒドロキシ吉草酸共重合体の分解は、副産物３−ヒドロキシ吉草酸からの３−ヒドロキシ酪酸の困難な分離もまた必要とする。（Ｒ）−（−）−３−ヒドロキシ吉草酸はまた、３−オキソ吉草酸の酵素的還元（非特許文献６）、またはメチル３−オキソ吉草酸の非対称性水素付加と続く鹸化（非特許文献７）によって調製されている。

ニトリルは多様な化学プロセスによって、容易に対応するカルボン酸に転換される。これらのプロセスは、典型的に強度に酸性または塩基性の反応条件および高い反応温度を必要とし、通常望まれない副産物および／または望まれない廃棄物として大量の無機塩を生成する。３−ヒドロキシバレロニトリルから３−ヒドロキシ吉草酸への転換など、水酸基をさらに有するニトリルの化学加水分解のための反応条件は、第一級、第二級、または第三級水酸基の通常望ましくない排除をもたらし、炭素−炭素二重結合を生成する。

ニトリルから対応するカルボン酸への酵素触媒加水分解は、反応が周囲温度で実施されることが多く、強度に酸性または塩基性の反応条件を必要せず、高転換率で高選択性に所望の生成物を生じるため、化学的方法が好ましいことが多い。ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼの２つの酵素の組み合わせを使用して、水溶液中で脂肪族ニトリルを対応するカルボン酸に転換できる。脂肪族ニトリルは最初にニトリルヒドラターゼによってアミドに転換され、次に引き続いてアミダーゼによってアミドが対応するカルボン酸に転換される。ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、アルスロバクター（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バクテリディウム（Ｂａｃｔｅｒｉｄｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、およびミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）をはじめとする多種多様な細菌遺伝子が、多様なスペクトルのニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ活性を有することで知られている（非特許文献８）。真菌フザリウム・メリスモイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｅｒｉｓｍｏｉｄｅｓ）ＴＧ−１もまた、脂肪族ニトリルおよびジニトリルの加水分解のための触媒として使用されている（非特許文献９）。ノボ・インダストリ（Ｎｏｖｏ Ｉｎｄｕｓｔｒｉ）からのロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種（ＳＰ４０９）からの固定化ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼを使用して、３−ヒドロキシプロピオニトリル、３−ヒドロキシヘプタンニトリル、および３−ヒドロキシノナンニトリルが、それぞれ６３％、６２％および８３％の収率で、対応する３−ヒドロキシカルボン酸に加水分解された（非特許文献１０）。対応するアミドの形成はまた、ＴＬＣによっても観察された。対照的にバシラス・パリダス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｌｌｉｄｕｓ）Ｄａｃ５２１の精製されたニトリルヒドラターゼは多様な脂肪族ニトリルを加水分解したが、３−ヒドロキシプロピオニトリルを加水分解しなかった（非特許文献１１）。

単一酵素、ニトリラーゼ、もまた水溶液中でニトリルを対応するカルボン酸およびアンモニアに転換するが、アミド（式１および２）の中間体形成がない。

（非特許文献１２）および（非特許文献１３）は、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）Ｋ２２から単離されて、多様な脂肪族ニトリルの対応するカルボン酸への加水分解を触媒する脂肪族ニトリラーゼについて述べている。コマモナス・テストステローニ（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ ｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ）からニトリラーゼが単離されており、それは一連の脂肪族α，ω−ジニトリルを対応するω−シアノカルボン酸またはジカルボン酸に転換できる（特許文献４）（非特許文献１４）。脂肪族ニトリラーゼはまた、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＮＣＩＭＢ１１２１６（非特許文献１５）（非特許文献１６）、ロドコッカス・ロドクラウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ）ＰＡ−３４（非特許文献１７）、フザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）分化型メロニス（ｍｅｌｏｎｉｓ）（非特許文献１８）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）種ＡＫ２２６（非特許文献１９）、アルカリゲネス・フェカーリス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）ＡＴＣＣ ８７５０（非特許文献２０）、およびアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（非特許文献２１）によっても生成される。

Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼをコード化している遺伝子は、クローンされて組み換え発現されている（米国特許公報（特許文献５）に相当する（特許文献６）および（非特許文献２２））。Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼは、３−ヒドロキシニトリルを対応する３−ヒドロキシカルボン酸に高収率で転換する（米国特許公報（特許文献７））。生成する３−ヒドロキシ酸は、高度に分枝したコポリエステルをはじめとするポリマー調製のための基質として有用である。２つの特に有用な３−ヒドロキシカルボン酸は、３−ヒドロキシ吉草酸（３−ＨＶＡ）および３−ヒドロキシ酪酸（３−ＨＢＡ）である。１００％転換に至る高収率で、３−ヒドロキシバレロニトリル（３−ＨＶＮ）または３−ヒドロキシブチロニトリル（３−ＨＢＮ）を対応する３−ヒドロキシカルボン酸に転換する、改善されたニトリラーゼ活性を有するニトリラーゼは、工業生産コストを低減するために非常に有用であろう。

特公昭５９−０５３８３８ Ｂ４号公報 米国特許第３，５５３，０８１号明細書 国際公開第９９２９８８９号パンフレット カナダ特許第２，１０３，６１６号明細書 米国特許第６，８７０，０３８号明細書 国際公開第０１／７５０７７号パンフレット 米国特許第６，５６２，６０３号明細書 ＥＰ５４６０４９号明細書 国際公開第９３２４６３１号パンフレット 米国特許第５，６０５，７９３号明細書 米国特許第５，８１１，２３８号明細書 米国特許第５，８３０，７２１号明細書 米国特許第５，８３７，４５８号明細書 Ｊ．Ｃ．サロモネ（Ｓａｌｏｍｏｎｅ）編、「ポリマー材料小百科事典（Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ）」よりハルト（Ｈｕｌｔ）ら著、６５６〜６５８頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９年 Ｊ．Ｃ．サロモネ（Ｓａｌｏｍｏｎｅ）編、「ポリマー材料小百科事典（Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ）」よりウォイト（Ｖｏｉｔ）ら著、６５８〜６５９頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９９年 Ｊ．Ｉ．クロシュヴィッツ（Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ）編、「ポリマー科学・工学小百科事典（Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」よりグッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）著、７９３〜７９９頁、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９０年 ハセガワ（Ｈａｓｅｇａｗａ）ら著、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．５９：２５７〜２６２頁（１９８１年） ゼーバッハ（Ｓｅｅｂａｃｈ）ら著、Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ ７７：２００７〜２０３４頁（１９９４年） バイヤー（Ｂａｙｅｒ）ら著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４２：５４３〜５４７頁（１９９４年） バーク（Ｂｕｒｋ）ら著、Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃｓ ９：２６５３〜２６５５頁（１９９０年） スガイ（Ｓｕｇａｉ）ら著、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：１４１９〜１４２７頁（１９９７年） アサノ（Ａｓａｎｏ）ら著、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４４：２４９７〜２４９８頁（１９８０年） デ・ラット（ｄｅ Ｒａａｄｔ）ら著、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１、１３７〜１４０（１９９２年） クランプ（Ｃｒａｍｐ）ら著、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １４３１：２４９〜２６０頁（１９９９年） コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら著、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４６：５５８７〜５５９０頁（１９９０年） コバヤシ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ）ら著、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １７２：４８０７〜４８１５頁（１９９０年） レヴィ・シル（Ｌｅｖｙ−Ｓｃｈｉｌ）ら著、Ｇｅｎｅ １６１：１５〜２０頁（１９９５年） ベンジス−ガーバー（Ｂｅｎｇｉｓ−Ｇａｒｂｅｒ）ら著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３２：１１〜１６頁（１９８９年） グラッドレー（Ｇｒａｄｌｅｙ）ら著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔ．１６：４１〜４６頁（１９９４年） バーラ（Ｂｈａｌｌａ）ら著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：１８４〜１９０頁（１９９２年） ゴールドラスト（Ｇｏｌｄｌｕｓｔ）ら著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：５８１〜６０１頁（１９８９年） ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら著、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５５：１４５９〜１４７３頁（１９９１年） ヤマモト（Ｙａｍａｍｏｔｏ）ら著、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ、Ｂｉｏｅｎｇ．７３：４２５〜４３０頁（１９９２年） ガバガン（Ｇａｖａｇａｎ）ら著、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３：４７９２〜４８０１頁（１９９８年） チャウハン（Ｃｈａｕｈａｎ）ら著、Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、６１：１１８〜１２２頁（２００３年） フォード（Ｆｏｒｄ），Ｊ．Ｈ．著、Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｌｌ．ｖｏｌ．ＩＩＩ：３４〜３６頁（１９５５年） ブラウン（Ｂｒｏｗｎ），Ｇ．Ｂ．著、Ｏｒｇ Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｌｌ．ｖｏｌ．ＩＩＩ：６１５〜６１７頁（１９５５年） トロルザス（Ｔｒｏｌｌｓａｓ）ら著、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３０：８５０８頁（１９９７年） トロルザス（Ｔｒｏｌｌｓａｓ）ら著、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｔ（Ａ）：Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：２７９３頁（１９９８年） トゥオング（Ｔｈｕｏｎｇ）ら著、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ（１９８５年）７〜８月６７（７〜８）：６７３〜６８４頁 オーチコウロフ（Ｏｕｔｃｈｋｏｕｒｏｖ）ら著、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ、２４（１）：１８〜２４頁（２００２年） フェング（Ｆｅｎｇ）ら著、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３９（５０）：１５３９９〜１５４０９頁（２０００年） コーワン（Ｃｏｗａｎ）ら著、Ｅｘｔｒｅｍｏｐｈｉｌｅｓ、２：２０７〜２１６頁（１９９８年） ペース（Ｐａｃｅ），Ｈ．およびブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ），Ｃ．著、Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２（１）：レビュー１〜９頁（２００１年） オレイリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ），Ｃ．およびターナー（Ｔｕｒｎｅｒ），Ｐ．著、Ｊ Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、９５：１１６１〜１１７４頁（２００３年） 「生物工学手技（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」Ｖｏｌ．１：「酵素および細胞の固定（Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｓ）」；ゴードンＦ．ビッカースタッフ（Ｇｏｒｄｏｎ Ｆ．Ｂｉｃｋｅｒｓｔａｆｆ）編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，ＵＳＡ；１９９７年 「工業および農業用組み換え微生物（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｅｓ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」ムローカ（Ｍｕｒｏｏｋａ）ら編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９４年） メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら著、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７（４）：１０５６〜１０６２頁（１９９９年） クームズ（Ｃｏｏｍｂｓ）ら著、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２５９〜３１１頁、図版１、アンジェレッティ，ルース・ホーグ（Ａｎｇｅｌｅｔｔｉ，Ｒｕｔｈ Ｈｏｇｕｅ）編、Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）（１９９８年） フロマント（Ｆｒｏｍａｎｔ）ら著、Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ、２２４（１）：３４７〜５３頁（１９９５年） リン−ゲオルケ（Ｌｉｎ−Ｇｏｅｒｋｅ）ら著、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、２３（３）：４０９〜１２頁（１９９７年） サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９年） ニクソン（Ｎｉｘｏｎ）ら著、ＰＮＡＳ、９４：１０６９〜１０７３頁（１９９７年） トーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第二版（１９８９年）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年） デシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．著、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３６（３）：２２７〜２３４頁（１９９２年） 「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）、およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、米国微生物学会、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４年） Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）ら著、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｇｅｎｅ Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、（１９８４年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ，ＮＹ オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら著、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」（１９９４〜１９９８年）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ハマナ（Ｈａｍａｎａ）ら著、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４０１〜１４０４頁（１９８２年） イトウ（Ｉｔｏｈ）ら著、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２：９１６５〜９１７２頁（１９９７年）

したがって解決すべき問題は、３−ヒドロキシニトリルをそれらの対応するカルボン酸に高収率で転換するための有用な活性がある、ニトリラーゼ酵素を提供することである。より具体的には、３−ヒドロキシニトリル（例えば３−ヒドロキシバレロニトリルまたは３−ヒドロキシブチロニトリル）から、それぞれの３−ヒドロキシカルボン酸への転換のためのニトリラーゼ活性の顕著な改善（Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗのニトリラーゼ活性と比較して）を有するニトリラーゼ酵素は、工業生産コストを下げるのに有用であろう。

アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを突然変異させ、３−ヒドロキシニトリルを３−ヒドロキシ酸に転換する際のニトリラーゼ活性改善についてスクリーンした。Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの活性と比較してニトリラーゼ活性を改善する、いくつかのアミノ酸置換が同定された。したがってＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼと比較して、改善されたニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコード化している単離された核酸分子が提供され、該単離された核酸分子は、配列番号４で表される配列の少なくとも１つのアミノ酸の置換をコード化しており、該置換は、
ａ）２１０位におけるアラニン、イソロイシン、またはシステインでの置換、
ｂ）６５位におけるシステインでの置換、
ｃ）１６８位におけるリジン、バリンまたはロイシンでの置換、および
ｄ）１７４位におけるイソロイシンでの置換
からなる群から選択される。

本発明の実施形態は、酵素的に活性のニトリラーゼポリペプチドをコード化している単離された核酸断片であり、該ポリペプチドは、配列番号６、８、１２、１４、１６、および１８からなる群から選択されるポリペプチド配列を有し、３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に転換する際に、同一反応条件下でのＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼのニトリラーゼ活性よりも少なくとも１．８倍高いニトリラーゼ活性を有する。

本発明はまた、配列番号５、７、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される単離された核酸断片中で具現化され、単離された核酸断片は、同一水性反応条件下で３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に転換する際に、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼの活性と比較して、少なくとも１．８倍さらに高い改善をニトリラーゼ活性に有するポリペプチドをコード化している。本発明のさらに別の実施形態としては、本発明の核酸断片によってコード化されているポリペプチド、適切な調節塩基配列に作動可能に結合する単離された本発明の核酸断片を含むキメラ遺伝子、本発明のキメラ遺伝子を含む発現カセット、本発明のキメラ遺伝子を含む形質転換された微生物、および本発明の発現カセットを含む形質転換された微生物が挙げられる。

さらに別の実施形態は、（ａ）水性反応混合物中の３−ヒドロキシニトリルと、改善されたニトリラーゼ触媒とを接触させるステップであって、該ニトリラーゼ触媒が、同一反応条件下でのＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼの活性と比較して、少なくとも１．８倍、ニトリラーゼ活性を改善させることを特徴とする、本発明の単離された核酸断片によってコード化されているものであるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された３−ヒドロキシカルボン酸を任意選択的に単離するステップを含む、３−ヒドロキシニトリルを３−ヒドロキシカルボン酸に加水分解するための改善されたプロセスである。

さらに別の発明の実施形態は、（ａ）水性反応混合物中の３−ヒドロキシバレロニトリルと、ニトリラーゼ触媒とを接触させるステップであって、該ニトリラーゼ触媒が、同一反応条件下でのＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼの活性と比較して、少なくとも１．８倍、ニトリラーゼ活性を改善させることを特徴とする、本発明の単離された核酸断片によってコード化されているものであるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された３−ヒドロキシ吉草酸を任意選択的に単離するステップを含む、３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に加水分解するための改善されたプロセスである。

さらに別の発明の実施形態は、（ａ）水性反応混合物中の３−ヒドロキシブチロニトリルと、配列番号６のポリペプチド配列を有する酵素的に活性のニトリラーゼ触媒とを接触させるステップであって、該ニトリラーゼ触媒が、同一反応条件下でのＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼの活性と比較して、少なくとも１．９倍、ニトリラーゼ活性を改善させることを特徴とするものであるステップと、（ｂ）ステップ（ａ）で生成された３−ヒドロキシ酪酸を任意選択的に単離するステップを含む、３−ヒドロキシブチロニトリルを３−ヒドロキシ酪酸に加水分解するための改善されたプロセスである。

（提供配列の簡単な説明）
次の詳細な説明、およびその内容を本願の一部として参照により本明細書に援用する、添付のコンピュータ可読形式の配列一覧から本発明をより完全に理解できる。

以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＣおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に沿っている。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。

配列番号１は、変異性ＰＣＲ、およびＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを増幅するために使用されるプライマーの核酸配列である。

配列番号２は、変異性ＰＣＲ、およびＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを増幅するために使用されるプライマーの核酸配列である。

配列番号３は、プラスミドｐＮＭ１８中で対照として使用されるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼコード配列の核酸配列である。配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現を容易にするためのＧＴＧからＡＴＧへの開始コドンの変化以外は、野生型Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ配列と同一である。

配列番号４は、プラスミドｐＮＭ１８から発現されるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。

配列番号５は、プラスミドｐＮＭ１８／Ｂ２およびｐＮＭ１８／Ｈ９中に見いだされる突然変異ニトリラーゼコード配列の核酸配列である。

配列番号６は、プラスミドｐＮＭ１８／Ｂ２およびｐＮＭ１８／Ｈ９から発現される突然変異ニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。

配列番号７は、プラスミドｐＮＭ１８／Ｂ４中に見いだされる突然変異ニトリラーゼコード配列の核酸配列である。

配列番号８は、プラスミドｐＮＭ１８／Ｂ４から発現される突然変異ニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。

配列番号９は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基２１０位に単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ｍｅｔ）を有する突然変異ニトリラーゼを作り出すのに使用されるプライマーの核酸配列である。

配列番号１０は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基２１０位に単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ｍｅｔ）を有する突然変異ニトリラーゼを作り出すのに使用されるプライマーの核酸配列である。

配列番号１１は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基２１０位に単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ｃｙｓ）をもたらすコドン変化を含有する突然変異ニトリラーゼの核酸配列である。

配列番号１２は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基２１０位に単一アミノ酸置換（Ｔｈｒ２１０→Ｃｙｓ）を含有する突然変異ニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。

配列番号１３は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基１６８位に単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｌｙｓ）をもたらすコドン変化を含有する突然変異ニトリラーゼの核酸配列である。

配列番号１４は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基１６８位に単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｌｙｓ）を含有する突然変異ニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。

配列番号１５は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基１６８位に単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｖａｌ）をもたらすコドン変化を含有する突然変異ニトリラーゼの核酸配列である。

配列番号１６は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基１６８位に単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｖａｌ）を含有する突然変異ニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。

配列番号１７は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基１６８位に単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｌｅｕ）をもたらすコドン変化を含有する突然変異ニトリラーゼの核酸配列である。

配列番号１８は、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの残基１６８位に単一アミノ酸置換（Ｐｈｅ１６８→Ｌｅｕ）を含有する突然変異ニトリラーゼの推定アミノ酸配列である。

（生物学的寄託の簡単な説明）
出願人は、ブダペスト条約の取り決めの元に次の生物学的寄託を行った。

本明細書における用法では、「ＡＴＣＣ」は、米国ヴァージニア州２０１１０−２２０９マナッサスのユニバーシティ・ブールヴァード１０８０１のＡＴＣＣに所在する米国微生物系統保存機関国際寄託局を指す。「国際寄託番号」は、ＡＴＣＣに寄託された培養物の受入番号である。

列挙した寄託株は、表示された国際受託機関に少なくとも３０年間保存され、それを開示する特許の付与時に一般に公開される。寄託株の利用可能性は、政府の行動によって付与された特許権から逸脱して主題発明を実施する認可とはみなされない。

３−ヒドロキシニトリルを３−ヒドロキシカルボン酸に１００％転換に至る高収率で転換する際に、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼの活性と比較して顕著に改善されたニトリラーゼ活性があるいくつかのニトリラーゼ酵素が提供される。本ニトリラーゼを使用して、３−ヒドロキシカルボン酸（３−ＨＶＡおよび３−ＨＢＡ）を生成する方法もまた提供される。

Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを変異性ＰＣＲおよび／または部位特異的変異誘発によって変異させて、３−ヒドロキシニトリルをそれぞれの３−ヒドロキシカルボン酸に転換するための改善されたニトリラーゼ活性を示す一酸の突然変異ニトリラーゼを作り出す。３−ヒドロキシカルボン酸生成のためのニトリラーゼ活性の改善は、付随の実施例で述べられるように、形質転換された微生物の宿主細胞（非固定化および固定化）を使用して測定される。

３−ヒドロキシニトリルのニトリル官能基を対応するカルボン酸に転換する能力を有するニトリラーゼ酵素は、顕著な利点を提供する。本ニトリラーゼを使用したニトリルの加水分解は、比較的安価なおよび容易に入手できる出発原料から、化学またはその他の酵素的方法との比較で非常にわずかな副産物および廃棄物生成を伴う高収率の３−ヒドロキシ酸合成をするために有用である。

３−ヒドロキシ吉草酸または３−ヒドロキシ酪酸を調製するための特許請求されるプロセスは、わずかな廃棄物または反応副産物しか発生させず、３−ヒドロキシカルボン酸は容易に生成混合物から回収される。３−ヒドロキシニトリルから３−ヒドロキシカルボン酸への加水分解のための既知の化学的方法は、酵素触媒ニトリル加水分解を使用して得られる高収率および選択性を生じることができない。非酵素的ニトリル加水分解反応は、典型的に、多くの場合強酸または塩基の存在下でニトリル溶液を高温で加熱することを伴うのに対し、酵素触媒反応は、酸または塩基の添加なしに中性ｐＨで水溶液中において周囲温度で実施される。例えば水性水酸化バリウムが使用されて、８５〜９０％の収率で３−アミノプロピオニトリルが３−アラニンに（非特許文献２３）、および７２％の収率で３−シアノ酪酸がメチルコハク酸に（非特許文献２４）加水分解されている。これらの２つの手順の最初のものを３−ヒドロキシバレロニトリルで反復しても、検出可能な３−ヒドロキシ吉草酸（比較例参照）はほとんど生成されない。

本発明によって生成される３−ヒドロキシ吉草酸および３−ヒドロキシ酪酸は、ポリエステル（特に超分枝ヒドロキシカルボキシル（コ）モノマーと組み合わさった高度に分枝したポリエステル）を調製するための成分として有用であり、生分解性ポリエステル生成における（コ）モノマーとして有用である（米国特許公報（特許文献７））。ジメチロールプロピオン酸を分枝コモノマーとして、そして多様な直鎖ヒドロキシカルボン酸およびラクトンを使用して、いくつかのクラスの高度に分枝したコポリエステルポリオールが調製されている。これらポリマーのいくつかは魅力的な特性を示す。同様の全体的組成である（が異なる微細構造の）対応するブロック共重合体が報告されている（例えば（非特許文献２５）および（非特許文献２６）で述べられるＤＭＰＡ／ε−カプロラクトンブロック共重合体）。ジメチロールプロピオン酸またはトリメチロール酢酸との共重合における直鎖コモノマーとして、ε−カプロラクトンを３−ヒドロキシ吉草酸などの３−ヒドロキシカルボン酸で置換した場合に、望ましい顕著に増強されたＴ_ｇがある反応性コーティングのための高度に分枝したコポリエステルポリオール基質が報告されている（米国特許公報（特許文献７））。より高いＴ_ｇは、分枝コポリエステルが応用できる用途の範囲を顕著に広げる。

本開示ではいくつかの用語および略語が使用される。次の定義が提供される。

飽和「ヒドロカルビルラジカル」とは、炭素および水素からのみ構成されるあらゆるラジカルと定義され、そこでは単一結合が排他的に使用されて、炭素原子を共に結びつける。したがって少なくとも１つの炭素原子を有する炭素および水素原子のあらゆる安定配置が、飽和ヒドロカルビルラジカルの範囲内に含まれる。

「ハイパーブランチした」、「高度に分枝した」、および「樹状巨大分子」（デンドリマー）という用語は、樹状構造を有する三次元の高度に分枝した分子として概して説明できる。デンドリマーが高度に対称性であるのに対し、ハイパーブランチしたまたは高度に分枝したと称される同様の巨大分子は、ある程度まで非対称性を保持しながら、なおも高度に分枝した樹状構造を維持してもよい。デンドリマーは、ハイパーブランチした巨大分子の単分散バリエーションであると言うことができる。ハイパーブランチした、高度に分枝した、および樹状の巨大分子は、常態ではイニシエーターまたは核を有する１つまたは複数の反応性部位、およびいくつかの周囲分枝層、および任意選択的に連鎖終結分子層からなる。層は通常、世代と称される。

「ニトリラーゼ触媒」は、ここではニトリラーゼ活性を特徴とする酵素触媒を指す。酵素触媒は、微生物のホールセル、透過化処理微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の細胞構成要素、部分的に精製された酵素、または精製された酵素の形態であってもよい。「改善されたニトリラーゼ」、「突然変異ニトリラーゼ」、および「タンパク質工学ニトリラーゼ」という用語は、同義的に使用され、同一反応条件下におけるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性との比較で、３−ヒドロキシニトリル（例えば３−ヒドロキシバレロニトリルまたは３−ヒドロキシブチロニトリル）から対応する３−ヒドロキシカルボン酸への転換に対して顕著に改善されたニトリラーゼ活性を有する本ニトリラーゼを指す。本明細書における用法では、「同一の反応条件」とは、同一のおよび／または実質的に同様の反応条件を指し、ここで、測定されるニトリラーゼ活性の違いは、ここで述べられるアミノ酸置換によって表されるように、本ニトリラーゼの構造的な差違いの結果であると考えられる。Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼは配列番号３によって表される。これは、（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現を容易にするために導入される）ＧＴＧからＡＴＧへの開始コドンの変化以外は、野生型Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼと同一である。本発明ではｐＮＭ１８から発現されるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号３）のコード配列は、ニトリラーゼ活性比較のための適切な対照とみなされる。

本発明では、「１単位の酵素活性」または「１単位の活性」または「Ｕ」は、規定の温度で１分あたり１μｍｏｌの規定の３−ヒドロキシカルボン酸生成物を生成するのに必要な酵素活性量として定義される。本発明では、生成される例証の３−ヒドロキシカルボン酸は、３−ヒドロキシ吉草酸および３−ヒドロキシ酪酸である。

本発明では、「ニトリラーゼ活性」という用語は、タンパク質、乾燥細胞重量、またはビーズ重量の単位質量（例えばミリグラム）あたりの酵素活性を指す。ニトリラーゼ活性の比較は、乾燥細胞重量またはビーズ重量に比例して測定される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーザーデンシトメトリー分析を使用した定量では、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ対照（配列番号４）と改善された突然変異体の間のニトリラーゼ発現レベルは識別不能であるので、ニトリラーゼ活性の比較および報告された改善は、乾燥細胞重量またはビーズ重量と比較して測定された。

本明細書における用法では、「相対ニトリラーゼ活性」という用語は、基準（対照）ニトリラーゼ活性の複数（または一部）として発現されるニトリラーゼ活性を指す。本発明では、相対ニトリラーゼ活性の「顕著な改善」とは、同一反応条件下における対照のニトリラーゼ活性と比較して、少なくとも１．２倍高いニトリラーゼ活性の改善である。別の実施形態では、改善は同一反応条件下における対照のニトリラーゼ活性と比較して、少なくとも１．８倍高いニトリラーゼ活性である。さらに別の実施形態では、改善は同一反応条件下における対照のニトリラーゼ活性と比較して、少なくとも５倍高いニトリラーゼ活性である。

「３−ヒドロキシニトリル」は、「β−ヒドロキシニトリル」の同等物である。「３−ヒドロキシニトリル」としては次の化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。３−ヒドロキシプロピオニトリル、３−ヒドロキシブチロニトリル、３−ヒドロキシバレロニトリル、３−ヒドロキシヘキサンニトリル、３−ヒドロキシヘプタンニトリル、３−ヒドロキシノナンニトリル、３−ヒドロキシ−３−イソプロピル−４−メチルペンタンニトリル、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパンニトリル、２−プロピル−３−ヒドロキシペンタンニトリル、および３−ヒドロキシ−３−メチル−ｎ−ペンタンニトリル。本発明で好ましい３−ヒドロキシニトリルとしては、３−ヒドロキシバレロニトリルおよび３−ヒドロキシブチロニトリルが挙げられる。

「３−ヒドロキシカルボン酸」は、「β−ヒドロキシカルボン酸」の同等物である。「３−ヒドロキシカルボン酸」としては次の化合物をが挙げられるが、これに限定されるものではない。３−ヒドロキシプロピオン酸、３−ヒドロキシ酪酸、３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシヘキサン酸、３−ヒドロキシ−３−イソプロピル−４−メチルペンタン酸、３−ヒドロキシ−３−フェニルプロパン酸、２−プロピル−３−ヒドロキシペンタン酸、３−ヒドロキシ−２，２−ジメチルプロピオン酸、および３−ヒドロキシ−３−メチル−ｎ−吉草酸。本発明で生成される３−ヒドロキシカルボン酸としては、３−ヒドロキシ吉草酸および３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。生成される３−ヒドロキシカルボン酸は、酸またはその対応するアンモニウム塩の形態であってもよい。

「３−ヒドロキシバレロニトリル」はまた、３−ヒドロキシペンタンニトリルおよび３−ＨＶＮとしても知られている。

「３−ヒドロキシ吉草酸」はまた、３−ヒドロキシペンタン酸および３−ＨＶＡとしても知られている。

「３−ヒドロキシブチロニトリル」はまた、３−ヒドロキシブタンニトリルおよび３−ＨＢＮとしても知られている。

「３−ヒドロキシ酪酸」はまた、３−ヒドロキシブタン酸および３−ＨＢＡとしても知られている。

「宿主細胞」、「異種の宿主細胞」、および「宿主生物体」という用語は、外来性または異種遺伝子、遺伝子断片、またはＤＮＡ断片を受容できる細胞を指す。

「組み換え生物体」、「形質転換宿主」、「形質転換体」、「組換え生物体」、および「形質転換された微生物宿主」という用語は、異種のまたは外来性ＤＮＡで形質転換された宿主生物体を指す。本発明の組み換え生物体は、活性ニトリラーゼ酵素をコード化している外来性コード配列または遺伝子を発現する。「形質転換」とは、宿主生物体中へのＤＮＡ断片の転移を指す。転換されたＤＮＡ断片は、染色体性にまたは染色体外性に（すなわちベクターを経由して）宿主生物体に組み込むことができる。「形質転換カセット」とは、通常はプラスミドの一部として、宿主細胞への挿入のために都合良く配列された１組の遺伝的要素を含有するＤＮＡの特定断片を指す。「発現カセット」は、通常はプラスミドの一部として、宿主細胞中への挿入のために都合良く配列された１組の遺伝的要素を含有するＤＮＡの特定断片を指し、それはまた、宿主中での増強された遺伝子発現も可能にする。

「プラスミド」および、「ベクター」という用語は、多くは細胞の中心的代謝の一部でない遺伝子を保有して、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。このような要素は、あらゆる供給源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの直線または環状の自律的複製配列、ゲノム組み込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよく、その中でいくつかのヌクレオチド配列はユニークな構造に結合され、または組み込まれる。

「遺伝子」とは、コード配列に先行する制御配列（５’非コード配列）およびその後ろの制御配列（３’非コード配列）を含めた特異性タンパクを発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、自然界に見いだされるような配列のそれ自体の制御配列を有する遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界には一緒に見られない制御およびコード配列を含む天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列された制御配列およびコード配列を含んでいてもよい。「内在性遺伝子」とは、天然生物のゲノム中の自然な部位にある天然遺伝子を指す。「外来性遺伝子」または「異種の遺伝子」とは、常態では宿主生物に見られないが、遺伝子移入によって宿主生物中に導入される遺伝子を指す。外来遺伝子は、非天然生物に挿入された天然遺伝子、またはキメラ遺伝子を含むことができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。

「核酸」という用語は、生細胞中に出現する高分子量の複合化合物を指し、その基本単位はリン酸架橋で結合するヌクレオチドである。核酸はリボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の２タイプにさらに分割される。

核酸文脈で言及される場合、「Ａ」、「Ｇ」、「Ｔ」、および「Ｃ」の文字は、それぞれプリン塩基（アデニン（Ｃ_５Ｈ_５Ｎ_５）およびグアニン（Ｃ_５Ｈ_５Ｎ_５Ｏ））およびピリミジン塩基（チミン（Ｃ_５Ｈ_６Ｎ_２Ｏ_２）およびシトシン（Ｃ_４Ｈ_５Ｎ_３Ｏ））を意味する。

「コード配列」または「コード領域」という用語は、特定アミノ酸配列をコード化しているＮＡ配列を指す。「ＯＲＦ」および「読み取り枠」および「コード配列」および「コード領域」という用語は同義的に使用されて、タンパク質に翻訳されるＤＮＡ配列の一部を指す。ＯＲＦは通常、配列中では開始を指定する３つの塩基対（開始コドン）によって、タンパク質配列中へのＤＮＡ配列の翻訳中では、停止を指定する３つの塩基対（停止コドン）によって輪郭を描き出される。

本明細書における用法では、「単離された核酸分子」または「断片」は、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを指す。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸分子は、１つまたは複数のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでいてもよい。

「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」という用語は、二本鎖ＤＮＡ中の特定ヌクレオチド配列内で加水分解開裂を触媒する酵素を指す。

「オリゴヌクレオチド」という用語は、プライマー、プローブ、検出されるオリゴマー断片、標識複製遮断プローブ、およびオリゴマー対照を指し、総称的にポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）と、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）と、プリンまたはピリミジン塩基（ヌクレオチド）、または変性プリンまたはピリミジン塩基のＮ−グリコシドであるあらゆるポリヌクレオチドとを指す。また「オリゴヌクレオチド」の定義には、核酸類似体（例えばペプチド核酸）および構造的に変性されたもの（例えばホスホロチオレート結合）も含まれる（（非特許文献２７）もまた参照されたい）。「核酸」、「ポリヌクレオチド」、または「オリゴヌクレオチド」の長さの区別は意図されない。

「プライマー」という用語は、相補鎖の合成がポリメラーゼによって触媒される条件下に置かれると、相補鎖に沿って核酸合成または複製の開始点として作用する（合成または天然）オリゴヌクレオチドを指す。

「適切な調節塩基配列」とは、転写、ＲＮＡプロセシング、ＲＮＡ安定性、または関連コード配列の翻訳に影響し、コード配列の上流（５’非コード配列）、内部、または下流（３’非コード配列）に位置するヌクレオチド配列を指す。調節塩基配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列が挙げられる。

「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。概してコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターはそっくりそのまま天然遺伝子から誘導されてもよく、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなってもよく、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる発達段階において、あるいは異なる環境条件に呼応して、遺伝子の発現を導いてもよいことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中で、ほとんどの場合に、またはほとんどの環境条件下で、遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成プロモーター」と称される。特定の化合物または環境条件の存在下での遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「誘導可能プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよい。

本明細書における用法では、「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響される、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターはコード配列の発現に影響できる場合、そのコード配列と作動可能に連結する（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節の下にある）。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向で制御配列に作動可能に連結できる。

「３’非コード配列」は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指し、ポリアデニル化認識配列（常態では真核細胞に限られる）およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコード化しているその他の配列を含む。ポリアデニル化シグナル（常態では真核細胞に限られる）は、通常、ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することを特徴とする。

当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの使用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用が、宿主細胞の好ましいコドンバイアスに近くなるように、遺伝子をデザインすることが望ましい。配列情報が入手できる場合の宿主細胞に由来する遺伝子の調査によって、そのコドンバイアスを判定できる。コドン最適化は当該技術分野でよく知られており、酵母（非特許文献２８）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（非特許文献２９）をはじめとするが、これに限定されるものではない、様々なシステムについて述べられる。

「発現」という用語は、通常、タンパク質である遺伝子産物の配列をコード化している遺伝子から遺伝子産物への転写および翻訳意味する。

「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は同義的に使用されて、発現される遺伝子産物を指す。

「コドン縮重」とは、コード化されているポリペプチドのアミノ酸配列に影響しないヌクレオチド配列のバリエーションを可能にする、遺伝的コードにおける多様性を意味する。例えばトリプレットコドンＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ、およびＣＴＧは、全てアミノ酸ロイシンをコード化することが当該技術分野でよく知られている。また所定部位において化学的に同等のアミノ酸を生じるが（「保存的変化」）、コード化されているタンパク質の機能特性に影響しない遺伝子中の変更が一般的であることも当該技術分野でよく知られている。したがって疎水性アミノ酸であるアミノ酸アラニンのコドンをコード化されているタンパク質の機能特性に影響することなく、別のより疎水性が低い残基（グリシンなど）または疎水性がより高い残基（バリン、ロイシン、またはイソロイシンなど）をコード化しているコドンによって置換してもよい。同様に、１つの負に帯電した残基を別のものにする（グルタミン酸からアスパラギン酸など）、または１つの正に帯電した残基を別のものにする（アルギニンからリジンなど）置換も機能的に等しい生成物を生じることが期待できる。タンパク質分子のＮ−末端およびＣ−末端部分に変更をもたらすヌクレオチド変化もまた、タンパク質を活性変更することは予期されない。提案される各修正は当該技術分野における日常的技術の十分範囲内であり、コード化されている生成物の生物学的活性が保持されるかどうかを決定する。

（アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼ）
Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（ＥＣ３．５．５．１）は、脂肪族または芳香族ニトリルからカルボン酸を生成するための頑強な触媒である（米国特許公報（特許文献５）、および（非特許文献２２））。それはまた３−ヒドロキシニトリルから３−ヒドロキシカルボン酸への転換を触媒することも示されている（米国特許公報（特許文献７））。

Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼはじめとする全ての既知のニトリラーゼは、酵素活性部位中に求核性システインを有し（非特許文献３０）（非特許文献３１）および（非特許文献２２）、全てチオール試薬（それぞれＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ酵素活性に大幅な減少を生じる、１．０ｍＭ濃度の塩化銅、硝酸銀、酢酸第二水銀、または塩化第二鉄）によって不活性化を被る。システイン残基はまた、スルフィン酸に不可逆的に酸化されることができ、酵素活性が失われる。様々な不活性化機序に対するニトリラーゼ酵素の感受性にも関わらず、固定化Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ細胞は頑強であり、多数のリサイクル反応後にそれらのニトリラーゼ活性のほとんどを保持する（米国特許公報（特許文献５））。

Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼとその他の細菌ニトリラーゼとの配列比較が報告されている（非特許文献２２）。７２Ｗニトリラーゼは、アミノ末端（配列番号４のアミノ酸残基４０〜５５）近くの１６個のアミノ酸領域と、必須システイン残基を含有する触媒領域（配列番号４のアミノ酸残基１６０〜１７３）とをはじめとするいくつかの保存シグネチャ領域を有する。このシステイン残基（配列番号４のＣｙｓ１６４）は保存グルタミン酸（配列番号４のＧｌｕ４８）およびリジン残基（配列番号４のＬｙｓ１３０）と共に、全てのニトリラーゼ中に見いだされる触媒の三つ組モチーフを形成する（非特許文献３１）。報告されているニトリラーゼ間で保存されるいくつかの構造的な類似性にもかかわらず、酵素の基質特異性は大きく異なる（非特許文献３２）。

（酵素特性）
３−ヒドロキシバレロニトリルから３−ヒドロキシ吉草酸、または３−ヒドロキシブチロニトリルから３−ヒドロキシ酪酸への転換に対する改善された相対ニトリラーゼ活性を有する突然変異体７２Ｗニトリラーゼを規定条件下でアッセイした。３−ＨＶＮから３−ＨＶＡへの転換を測定するスクリーニング法は、改善されたニトリラーゼ活性を有するニトリラーゼ突然変異体の選択に用いた。

ニトリラーゼ活性の改善は、対照（Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼ）のニトリラーゼ活性との比較によって判定した。ニトリラーゼ活性は、測定された活性（Ｕ）単位を触媒重量で除して計算した。触媒重量は、精製タンパク質重量、細胞湿重量、乾燥細胞重量または固定化触媒重量（すなわちＧＡ／ＰＥＩ−架橋触媒／アルギン酸ビーズ）に関して測定できる。本発明では、乾燥細胞重量（Ｕ／ｇ ＤＣＷ）１グラムあたりの活性単位、または触媒ビーズ（固定化触媒比較）１グラムあたりの活性単位としてニトリラーゼ活性が報告された。単位触媒重量としての乾燥細胞重量に基づくニトリラーゼ活性比較では、ニトリラーゼタンパク質生成のレベルを考慮すべきである。様々な形質転換体と対照の間の発現レベルが測定され、本質的に同一であることが観察された。したがって様々な突然変異体で報告されているニトリラーゼ活性の改善は、酵素に対する構造的な変更に起因すると考えられる。

本突然変異ニトリラーゼの（およびＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼ対照、配列番号４の）コード配列を同一のベクター（ｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ）および宿主（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５背景中で発現させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（レーザーデンシトメトリーを使用して定量）は、各突然変異体（そして対照）中のニトリラーゼタンパク質発現レベルが、（同一の発現システムおよび宿主を使用したことから予期されたように）本質的に等しいことを実証した。Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号４）を発現する相対酵素活性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）対照形質転換体（ｐＮＭ１８）中で測定されたニトリラーゼ活性と比較した、様々な突然変異体触媒について測定されたニトリラーゼ活性の増加倍数として報告された。

非固定化触媒では、乾燥細胞重量１グラムあたりの２５℃（ｐＨ７．０）における０．５Ｍの３−ヒドロキシニトリル溶液から３−ヒドロキシカルボン酸への転換率を測定して、突然変異ニトリラーゼ（Ｕ／ｇ乾燥細胞重量）のニトリラーゼ活性を判定した。固定化触媒比較では、３５℃（ｐＨ７．０）における０．４Ｍの３−ＨＶＮ溶液から３−ＨＶＡへの転換率を測定して、１グラムのビーズ（Ｕ／ｇビーズ）あたりのニトリラーゼ活性単位として報告して比活性を判定した。１単位のニトリラーゼ活性（Ｕ）は、２５℃（または固定化触媒では３５℃）における１μモルの３−ヒドロキシカルボン酸／分の生成と同等である。本発明では、３−ヒドロキシ吉草酸または３−ヒドロキシ酪酸の生成を基準にしてニトリラーゼ活性の単位を報告する。

特定の突然変異ニトリラーゼでは、ＤＮＡコード領域内の点置換突然変異および得られるアミノ酸変化は、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗアミノ酸配列（配列番号４）に準拠して、次の形式の１つを使用して特定される。
１．拡張形式：配列番号４内の対応するアミノ酸残基の位置と共に野生型アミノ酸が提供され（標準３文字略語を使用する）、それに同一残基位置で突然変異体中に見いだされた新しいアミノ酸が続く。例えば「Ｔｈｒ２１０からＡｌａ」または「Ｔｈｒ２１０→Ａｌａ」は、突然変異の結果としてスレオニンがアラニンに変化する、アミノ酸残基位置２１０における配列番号４の突然変異を表現する。
２．省略形式：野生型アミノ酸（標準１文字略語によって示される）に配列番号４のアミノ酸残基位置が続き、それに突然変異体アミノ酸（これも標準１文字略語によって示される）が続く。例えば「Ｔ２１０Ａ」は、突然変異の結果としてスレオニンがアラニンに変化する、配列番号４中のアミノ酸残基位置２１０の突然変異を表現する。

（３−ヒドロキシニトリルから３−ヒドロキシカルボン酸への加水分解）
３−ヒドロキシニトリル（例えば３−ヒドロキシバレロニトリルまたは３−ヒドロキシブチロニトリル）と酵素触媒の水性懸濁液とを混合することで、加水分解反応が実施される。組み換え微生物のホール細胞（本突然変異ニトリラーゼを発現する）が、いかなる前処理もなしに酵素触媒として使用できる。代案としてはポリマーマトリックス（例えばアルギン酸ビーズまたはポリアクリルアミドゲル（ＰＡＧ）粒子）内、または不溶性固体担体（例えばセライト）上に微生物細胞を固定化して、酵素触媒の再生および再使用を容易にすることができる。精製されたまたは部分的に精製された酵素はまた、ホールセルから単離して触媒として直接使用でき、または酵素はポリマーマトリックス内、または不溶性担体上に固定化できる。Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの固定化については、以前に報告されている（米国特許公報（特許文献５））。細胞または単離された酵素の固定化方法については広く報告されており、当業者によく知られている（非特許文献３３）。

水性反応混合物中の酵素触媒の濃度は、酵素触媒の特定触媒活性に左右され、所望の反応速度を得るように選択される。加水分解反応中で触媒として使用される微生物細胞の細胞湿重量は、典型的に総反応体積１ｍＬあたり０．００１ｇ〜０．２５０ｇの湿潤細胞、好ましくは１ｍＬあたり０．００２ｇ〜０．０５０ｇの湿潤細胞の範囲である。

加水分解反応温度は、反応速度および酵素触媒活性安定性の双方を最適化するように選択される。反応温度は反応混合物の氷点（およそ０℃）のすぐ上から６５℃の範囲であってもよく、反応温度の好ましい範囲は５℃〜３５℃である。微生物細胞触媒懸濁液は、蒸留水に、または反応初期ｐＨを５．０〜１０．０、好ましくは６．０〜９．０に保つ水性緩衝溶液に、細胞を懸濁して調製してもよい。反応が進むにつれて反応混合物のｐＨは、対応するニトリル官能基からのカルボン酸のアンモニウム塩形成のために変化するかもしれない。反応は、ｐＨ調節なしで３−ヒドロキシバレロニトリルまたは３−ヒドロキシブチロニトリルが完全に転換にするまで実施でき、または反応経過中に適切な酸または塩基を添加して所望のｐＨを維持できる。

３−ヒドロキシバレロニトリルおよび３−ヒドロキシブチロニトリルは、２５℃においてあらゆる比率で水と完全に混和性であることが分かった。３−ヒドロキシニトリルの溶解性もまた、溶液温度および／または水相中の塩濃度（緩衝液または生成物３−ヒドロキシカルボン酸アンモニウム塩）によって左右されるように反応条件が選択される場合、反応混合物が最初に酵素触媒と溶解３−ヒドロキシニトリルとを含有する水相、および有機相（未溶解３−ヒドロキシニトリル）の２相から構成されてもよい。反応が進むにつれて、３−ヒドロキシニトリルは水相に溶解し、最終的に単相生成混合物が得られる。反応はまた、酵素加水分解反応速度とほぼ等しい速度で３−ヒドロキシニトリルを反応混合物に添加することで単相水性反応混合物を維持し、高出発原料濃度における酵素の基質阻害の潜在的問題を避けて実施してもよい。

（生成混合物からの３−ヒドロキシカルボン酸の単離）
３−ヒドロキシ吉草酸または３−ヒドロキシ酪酸が、プロトン化カルボン酸およびその対応するアンモニウム塩（生成混合物のｐＨ依存性）の混合物として生成混合物中に存在するかもしれず、カルボン酸と生成混合物にさらに存在するかもしれないあらゆる緩衝液との塩として、さらに存在するかもしれない。３−ヒドロキシカルボン酸生成物は、必要に応じてプロトン化カルボン酸としてまたはカルボン酸の塩として、反応混合物から単離してもよい。

３−ヒドロキシニトリルの完全な転換時における生成混合物中の３−ヒドロキシカルボン酸の最終濃度は、０．００１Ｍから３−ヒドロキシカルボン酸生成物の溶解限度の範囲であってもよい。好ましくは３−ヒドロキシ吉草酸の濃度は、０．１０Ｍ〜２．０Ｍの範囲である。３−ヒドロキシ吉草酸は、濃塩酸で反応混合物のｐＨを１．０〜２．５に調節し、塩化ナトリウムによる得られた溶液の飽和、およびメチルｔ−ブチルエーテル、エチルエーテル、またはジクロロメタンなどの適切な有機溶剤による３−ヒドロキシ吉草酸の抽出により、生成混合物から（触媒除去後に）単離してもよい。次に合わせた有機抽出物を合わせて適切な乾燥剤（例えば硫酸マグネシウム）と共に撹拌し、濾過して（例えば回転蒸発によって）溶剤を除去し、所望の生成物を高収率かつ高純度（典型的に純度９８〜９９％）で生成する。所望ならば、再結晶化または蒸留によって生成物をさらに精製できる。

３−ヒドロキシバレロニトリルについて上で述べたのと類似の方法を使用して、３−ヒドロキシブチロニトリルから３−ヒドロキシ酪酸への酵素的加水分解を実施し（付随する実施例を参照されたい）、３−ヒドロキシ酪酸を３−ヒドロキシブチロニトリルの１００％転換までの１００％収率で生成した。

（３−ヒドロキシカルボン酸を使用したポリマー合成）
直鎖３−ヒドロカルボン酸またはそのエステルを使用した高度に分枝したコポリエステルの合成が、以前に報告されており（米国特許公報（特許文献７））、そこでは少なくとも２つの反復単位が、構造Ｒ^１Ｏ−ＣＲ^４Ｒ^５ＣＲ^６Ｒ^７Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１の少なくとも１つの直鎖３−ヒドロキシカルボン酸またはそのエステル、および構造（Ｒ^２Ｏ）_ｎ−Ｒ−［Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１］_ｍの少なくとも１つの超分枝ヒドロキシカルボン酸またはそのエステル次から誘導される。式中、Ｒは自由原子価がｎ＋ｍのＣ_１〜１２ヒドロカルビルラジカルまたは部分的にまたは完全に置換されたヒドロカルビルラジカルであり、そこではいくつかのまたは全ての水素原子が炭素原子で置換されていてもよく、Ｒ^１はＨ、Ｃ_１〜１２またはヒドロキシル置換されたＣ_１〜１２ヒドロカルビルラジカルであり、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^７はＨまたはＣ_１〜１２ヒドロカルビルラジカルであり、Ｒ^２はＨまたは（Ｏ）ＣＲ^３であり、ｎ＋ｍは３以上であり、ｎおよびｍの１つが１であるという条件で、これらの反復単位はまたヒドロキシカルボン酸のエステルなどのポリエステルを形成する同等化合物から誘導されてもよい。化合物（Ｒ^２Ｏ）_ｎ−Ｒ−［Ｃ（Ｏ）ＯＲ^１］_ｍは、３以上の官能性に基づいて超分枝モノマーと称されることもある。このような重合中にこのようなモノマーの１つ以上が存在してもよい。ｎ＋ｍは３または４であることが好ましい。これらのモノマーと一緒に当該技術分野でよく知られている通常のエステル化触媒を使用して、ポリエステル（例えばプロトン酸と、ルイス酸と、またはスルホン酸、リン酸、およびホスホン酸、チタンアルコキシド、ジアルキルスズ酸化物、そしてスズ、亜鉛、マンガン、カルシウム、マグネシウム、またはアンチモンの酸化物、炭酸塩およびカルボン酸塩をはじめとする基礎的触媒）を形成してもよい。ポリエステルを製造する方法は当該技術分野でよく知られている。

（３−ヒドロキシカルボン酸の分析）
３−ヒドロキシカルボン酸の生成を分析するのに適した分析法は当該技術分野でよく知られており、ＨＰＬＣ、ＣＥ、ＧＣ、およびＭＳが挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば屈折率検出器、および移動相として水性１０ｍＭ酢酸／１０ｍＭ酢酸ナトリウム中の７．５％（ｖ／ｖ）メタノール（３−ヒドロキシバレロニトリル反応のための）を用いたスペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）ＬＣ−１８−ＤＢカラム（１５ｃｍ×４．６ｍｍ径）、または５０℃で移動相として０．００１Ｎ硫酸（３−ヒドロキシブチロニトリル反応のための）を用いたバイオ・ラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３０ｃｍ×７．８ｍｍ径）のいずれかを使用して、３−ヒドロキシ吉草酸生成量を判定するためにＨＰＬＣ分析が使用されている。

（微生物の発現）
本ニトリラーゼ突然変異体は、異種の宿主細胞中、好ましくは微生物宿主中で生成されてもよい。本発明で特に有用なのは、大規模発酵法に容易に適応できる細胞である。このような生物体は工業バイオプロセシングの当該技術分野でよく知られており、その例は（非特許文献３４）に見られ、発酵性細菌ならびに酵母および糸状菌類が挙げられる。宿主細胞としては、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）種、クルイヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）種、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種が挙げられるが、これに限定されるものではない。特に好ましいのは大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。その中で突然変異ニトリラーゼ遺伝子が発現できる適切な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主細胞の例としては、ここで特定される宿主細胞およびＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ ４７０７６）、ＦＭ５（ＡＴＣＣ ５３９１１）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）、ＭＣ４１００（ＡＴＣＣ ３５６９５）、Ｗ１４８５（ＡＴＣＣ １２４３５）、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これに限定されるものではない。

Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼの異種性発現については、以前に報告されている（非特許文献２２）および米国特許公報（特許文献５）。チャウハン（Ｃｈａｕｈａｎ）らは、活性Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼを発現した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１１７７））について報告する。組み換え的に発現された（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１）ニトリラーゼのコード配列は、野生型７２Ｗニトリラーゼ配列（配列番号３）と比較して、２つの小さな配列変化を含有した。開始コドンはＧＴＧからＡＴＧに変化して組み換え発現を容易し、クローニング中にＣ−末端近くの単一アミノ酸変化をもたらすアーチファクト（Ｐｒｏ３６７［ＣＣＡ］→Ｓｅｒ［ＴＣＡ］）が導入された。

配列番号５、７、１１、１３、１５、および１７によって提供されるコード配列で表される本突然変異ニトリラーゼは、組み換え宿主（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））中で発現された。工業的に適切な宿主中での組み換え発現はいくつかの利点を有する。第１にそれから目的とする遺伝子が得られた微生物の多くで利用できる遺伝的ツールと比較して、一般に使用される産生宿主の多くでは遺伝的ツールボックスが通常よく開発されている。これらの宿主における組み換え発現は、常態では天然宿主における発現よりも費用効率が高い。例えばＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ細胞は、発酵によって生育させると比較的高価な炭素基質であるグリセロール上で生育し、安価なグルコースを使用しては成功裏に生育しないことが示されている。対照的に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）形質転換体は、約半分の時間でＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ細胞と同一細胞密度にグルコースで生育させることができ、生触媒生成のコストを顕著に下げる（米国特許公報（特許文献５））。

外来性タンパクの高レベル発現を導く制御配列を含有する微生物発現システムおよび発現ベクターは、当業者にはよく知られている。これらを使用して、本突然変異ニトリラーゼの遺伝子産物生成のために、キメラ遺伝子を構築できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入し、突然変異ニトリラーゼ酵素の高レベル発現を提供できる。本発明のヌクレオチドを使用して、天然Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（ｐＮＭ１８対照、配列番号４）と比較して、増強または改変された活性レベルを有する遺伝子産物を生成する。

さらにキメラ遺伝子は、宿主細胞の特性を改変するのに効果的である。例えば適切なプロモーターの制御下にある本ニトリラーゼをコード化しているキメラ遺伝子の少なくとも１つのコピーを宿主細胞に導入して、３−ヒドロキシバレロニトリルまたは３−ヒドロキシブチロニトリルをそれぞれ３−ヒドロキシ吉草酸または３−ヒドロキシ酪酸に転換する改善された能力を宿主細胞に与える。本発明のキメラ遺伝子は、本突然変異ニトリラーゼ配列の遺伝子発現を推進するのに有用な適切な調節塩基配列を含む。調節塩基配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、およびリボソーム結合部位が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの配列が宿主生物体に由来すれば好ましいが、当業者はまた、異種の調節塩基配列を使用してもよいことを認識する。

キメラ遺伝子はそれを適切な発現ベクター中にクローニングすることで、適切な宿主中に導入できる。適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはカセットは、当該技術分野でよく知られている。典型的にベクターまたはカセットは、関連した遺伝子、選択可能マーカー、および配列の転写および翻訳を導いて、自律複製または染色体の組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始制御を有するコード配列の５’領域および転写終了を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含む。双方の制御領域が宿主細胞に相同的な遺伝子から誘導されることが最も好ましいが、このような制御領域は、生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子から必ずしも誘導されなくてよい。

一実施形態では、調節塩基配列はプロモーターを誘導する。プロモーターは、構成要素でもまたは誘導可能であってもよい。誘導可能なプロモーターは、概して特定刺激に対して応答性である（例えばＩＰＴＧはｌａｃプロモーターを誘導する）。誘導可能プロモーターは、少数の例を挙げると化学薬品、生育サイクル、温度変化、ｐＨ変化、およびモル浸透圧濃度変化をはじめとする多様な刺激に対して応答性であってもよい。

所望の宿主細胞中での本突然変異ニトリラーゼの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あって、当業者にはなじみが深く、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）中での発現に有用）と、ＡＯＸ１（ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）中での発現に有用）と、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌＰ_Ｌ、ｌＰ_Ｒ、Ｔ７、ｔａｃ、Ｐ_ＢＡＤ、ｎｐｒ、およびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）中での発現に有用）などが挙げられるが、これに限定されるものではない。実例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のトリプトファンオペロンプロモーターＰｔｒｐ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の乳糖オペロンプロモーターＰｌａｃ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｔａｃプロモーター、ファージλライトプロモーターＰ_Ｒ、ファージλレフトプロモーターＰ_Ｌと、Ｔ７プロモーター、およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのＧＡＰ遺伝子のプロモーターからなる群から選択されるプロモーターの少なくとも１つを含み、またはそれはコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる微生物群から選択される少なくとも１つの強力なプロモーターである。

終止制御領域はまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子から誘導されてもよい。任意選択的に終止部位は不必要であってもよいが、含まれれば最も好ましい。

さらに挿入された遺伝的材料は、リボソーム結合部位を含んでもよい。リボソーム結合部位は、ファージλＣＩＩ遺伝子からのものであってもよく、またはコマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クルイヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）の遺伝子からのリボソーム結合部位からなる群から選択される。

任意選択的に本遺伝子産物は、好ましくは形質転換宿主の分泌産物であってもよい。増殖培地中への所望のタンパク質の分泌は、精製手順を簡単にしてコストを下げる。分泌シグナル配列は、発現可能タンパク質の細胞膜を横切る能動輸送を促進するのに有用なことが多い。分泌できる形質転換された宿主は、分泌シグナルをコード化しているＤＮＡ配列を宿主に組み込んで作り出してもよい。適切なシグナル配列を選択する方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば（特許文献８）、（特許文献９））を参照されたい。分泌シグナルＤＮＡは、発現制御ＤＮＡと本コード配列またはコード配列断片との間、および後者の読み枠内に位置してもよい。

（タンパク質操作）
本突然変異ニトリラーゼは、変異誘発によって生成された。本ヌクレオチドを使用して、さらに向上されたまたは改変された活性を有する遺伝子産物を製造できるかもしれないことが考察される。１）ランダム変異誘発、２）ドメイン交換（亜鉛フィンガードメインまたは制限酵素を使用した）、３）変異性ＰＣＲ（非特許文献３５）、４）部位特異的変異誘発（非特許文献３６）、および５）「遺伝子シャフリング」（参照により本明細書に援用する米国特許公報（特許文献１０）、米国特許公報（特許文献１１）、米国特許公報（特許文献１２）、および米国特許公報（特許文献１３））をはじめとするが、これに限定されるものではない、天然遺伝子配列を変異させて活性が改変または向上された遺伝子産物を生成する様々な方法が知られている。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、ヌクレオチドの誤取り込みによる同時の多数の突然変異生成と共に、ＤＮＡ断片を増幅できる。これはｄＮＴＰの比率を変更するまたは反応に様々な量の塩化マンガンを添加するなど、ＰＣＲ条件を修正して達成できる（非特許文献３７）（非特許文献３８）。次に突然変異ＤＮＡ断片のプールをクローンして、突然変異プラスミドのライブラリーを得ることができ、それを次に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主中での発現に続いてスクリーンできる。

遺伝子シャッフリング法は、その容易な実行、および高率な変異誘発と容易なスクリーニングのために特に魅力的である。遺伝子シャフリングのプロセスは、目的とする遺伝子との類似性および／または相違性を有するＤＮＡ領域の追加的集団存在下における、目的とする遺伝子の特定サイズの断片への制限エンドヌクレアーゼ開裂を伴う。次に断片のプールを変性させ再アニールして、変異遺伝子を作り出す。次に変異した遺伝子を変更した活性についてスクリーニングする。

本発明の本微生物の配列を変異させて、この方法によって変更されまたは増強される活性についてスクリーニングしてもよい。配列は二本鎖であるべきで、５０ｂｐ〜１０ｋＢの範囲の様々な長さであることができる。配列は当該技術分野でよく知られている制限エンドヌクレアーゼを使用して、約１０ｂｐ〜１０００ｂｐの範囲の断片に無作為に消化されてもよい（非特許文献３９）。本微生物の配列に加えて、微生物の配列の全部または部分とハイブリッド形成可能な断片集団を添加してもよい。同様に、本配列とハイブリッド形成可能でない断片集団を添加してもよい。典型的にこれらの追加的断片集団は、総核酸と比較して重量で約１０〜２０倍過剰に添加される。一般にこのプロセスに従えば、混合物中の異なる特定の核酸断片の数は約１００〜約１０００個になる。無作為核酸断片の混合集団は、変性されて一本鎖核酸断片を形成し、次に再アニールされる。その他の一本鎖核酸断片との相同性領域を有する一本鎖核酸断片のみが再アニールする。無作為核酸断片は、加熱によって変性されてもよい。当業者は、二本鎖核酸を完全に変性するのに必要な条件を判定できる。好ましくは温度は、約８０℃〜１００℃である。核酸断片を冷却によって再アニールしてもよい。好ましくは温度は約２０℃〜７５℃である。再生は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）または塩の添加によって加速できる。適切な塩濃度は、０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲であってもよい。次にアニールされた核酸断片は、核酸ポリメラーゼおよびｄＮＴＰ（すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ）存在下でインキュベートされる。核酸ポリメラーゼは、クレノウ断片、Ｔａｑポリメラーゼまたは当該技術分野で知られているあらゆるその他のＤＮＡポリメラーゼであってもよい。アニールに先だって、アニールと同時に、またはアニール後に、ポリメラーゼを無作為核酸断片に添加してもよい。変性、再生、およびポリメラーゼ存在下でのインキュベーションのサイクルは、所望の回数反復される。好ましくはサイクルは約２〜５０回反復され、より好ましくは手順は１０〜４０回反復される。得られる核酸は約５０ｂｐ〜約１００ｋＢの範囲のより大きな二本鎖ポリヌクレオチドであり、標準クローン化および発現プロトコルによって、発現および変更された活性についてスクリーニングしてもよい（非特許文献３９）。

さらにハイブリッドタンパク質は、遺伝子シャフリング（エクソンシャフリング）法を使用した、機能性領域の融合によってアセンブルできる（非特許文献４０）。本遺伝子の機能性領域は、その他の遺伝子の機能性領域と組み合わせて、所望の触媒機能を有する新しい酵素を作り出すことができる。ＰＣＲオーバーラップ伸長法を使用してハイブリッド酵素を構築し、当業者によく知られている技術を使用して、様々な発現ベクター中にクローン化してもよい。

（３−ヒドロキシカルボン酸の工業生産）
本突然変異ニトリラーゼ遺伝子を使用して３−ヒドロキシカルボン酸の商業生産が所望される場合、ニトリラーゼ触媒を生成するための多様な培養法を適用してよい。発酵は、当該技術分野で一般的であり、よく知られているバッチ、流加、または連続様式で実行してもよい（非特許文献４１）（非特許文献４２）。

古典的なバッチ培養法は閉鎖システムであり、そこでは培養液の組成が発酵の最初に設定され、培養プロセス中の人為的変化を受けない。したがって培養プロセス開始時に培養液に所望の生物体または生物体群を接種して、システムには何も添加せずに生育または代謝活動を生じさせる。しかし典型的には「バッチ」培養は、炭素源の添加に関するバッチであり、ｐＨおよび酸素濃度などの因子の調節が試みられることが多い。バッチシステムでは、システムの代謝産物および生物質量組成は、培養が終結する時点まで常に変化する。バッチ培養内で細胞は、静的な遅滞期から高い対数増殖期へ、そして最後に成長率が減退または停止する静止期へ調節される。処置を施さない場合、静止期にある細胞はやがて死滅する。システムによっては対数期にある細胞が、最終生成物または中間体の生産の大部分を担うことが多い。その他のシステムでは、静止または対数期後生成を得ることができる。

標準バッチシステムのバリエーションが、流加バッチシステムである。流加バッチ培養プロセスも本発明において適切であり、培養の進行と共に基材が段階的に添加されること以外は、典型的なバッチシステムを含む。流加バッチシステムは、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する傾向があって、培養液中に限定量の基材を有することが望ましい場合に有用である。流加バッチシステム中の実際の基材濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶存酸素、およびＣＯ_２などの排ガス分圧などの測定可能因子の変化に基づいて推定される。バッチおよび流加バッチ培養法は、当該技術分野で一般的であり周知であって、実例は（非特許文献４１）および（非特許文献４２）にある。

ニトリラーゼ触媒の商業生産は、連続培養によって達成してもよい。連続培養は開放システムであり、規定の培地をバイオリアクターに連続的に添加して、等量の慣熟培地をプロセシングのために同時に除去する。連続培養は、概して細胞を恒常的な高い液相密度に維持し、そこでは細胞が主に対数増殖期にある。代案としては連続培養を固定細胞で実施してもよく、そこでは炭素および養素が連続的に添加され、価値ある生成物、副産物または老廃物は細胞集団から連続的に除去される。細胞固定化は、天然および／または合成材料から構成される広範囲の固体担体を使用して実施してもよい。

連続または半連続培養は、細胞生育または最終細胞濃度に影響する１つの因子または任意の数の因子の調節を可能にする。例えば一方法では、炭素源または窒素レベルなどの制限的栄養物質を固定された割合に維持し、その他の全パラメーターの調節ができるようにする。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの因子を連続的に変化させることができる。連続システムは定常状態生育条件を維持することを目指すので、培地が抜き取られることによる細胞損失は、培養中の細胞生育率に対してバランスが取れていなくてはならない。連続的培養プロセスのために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに細胞形成速度を最大化する技術は工業微生物学の当該技術分野でよく知られており、多様な方法が（非特許文献４１）で詳述される。

本発明における発酵培地は、適切な炭素基質を含有しなくてはならない。適切な基質としては、グルコースおよびフルクトースなどの単糖類と、ラクトースまたはスクロースなどの二糖類と、デンプンまたはセルロースまたはそれらの混合物などの多糖類と、乳清透過液、コーンスティープリカー、甜菜モラセス、および大麦の麦芽などの再生可能な供給材料からの未精製混合物とが挙げられるが、これに限定されるものではない。したがって本発明で利用される炭素源は、多種多様な炭素含有基質を包含してもよく、生物体の選択によってのみ制限されることが考察される。

細菌培養の維持および生育に適した材料および方法は、当該技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。（非特許文献４３）または（非特許文献４１）。

ＰＣＲ増幅、ＤＮＡクローニングのための所望の末端を生じるためのエンド−およびエキソ−ヌクレアーゼによるＤＮＡ改変、ライゲーション、および細菌形質転換に必要な手順は、当該技術分野でよく知られている。ここで使用される標準組み換えＤＮＡおよび分子クローン化技術は当該技術分野でよく知られており、（非特許文献３９）、および（非特許文献４４）、および（非特許文献４５）で述べられている。

細菌細胞の生育および維持に使用した全ての試薬、および材料は、特に断りのない限りウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、メリーランド州ゲイサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得られた。３−ヒドロキシバレロニトリルは、トリエチルアルミニウム（ＦＲ１４４６１２７）の存在下で水素シアン化物と１，２−エポキシブタンとを反応させて、およびトリフル酸ジ−ｎ−ブチルボリルの存在下でのアセトニトリルおよびプロピオンアルデヒドの反応によって調製された（非特許文献４６）。光学活性３−ヒドロキシバレロニトリルは、酢酸２−シアノ−１−メチルエチルのリパーゼ触媒加水分解によって調製された（非特許文献４７）。

明細書中の略語は次のような測定単位、技術、特性、または化合物に対応する。「ｓ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「ａｍｐ」はアンピシリンを意味し「ｋｂ」はキロベースを意味し、「ｋｄ」はキロダルトンを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、および「ｗｔ」は重量を意味し、「ＯＲＦ」は読み取り枠を意味し、「ＰＣＲ」はポリメラーゼ連鎖反応を意味し、「ＳＳＣ」はクエン酸ナトリウム緩衝液を意味し、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィーを意味し、「ｃａ．」はおよそを意味し、「ｒｘｎ」は反応を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥細胞重量を意味し、「ＯＤ」は指定波長での光学濃度を意味し、「ＡＵ」は吸光度単位を意味し、「ｒｐｍ」は分あたり回転数を意味し、「ｓｌｐｍ」は分あたり標準リットルを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ＩＵ」は国際単位を意味し、および「ＩＰＴＧ」はイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを意味する。

（実施例１）
（変異性ポリメラーゼ連鎖反応によるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼランダム変異誘発ライブラリーの構築）
製造業者の取扱説明書（ミネソタ州ミネアポリスのジェントラシステムズ（Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）））に従って、ピュアジーン（Ｐｕｒｅｇｅｎｅ）ＤＮＡ単離キットを使用してＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）からゲノムＤＮＡを調製した。カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））からのジーンモルフ（ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ）ＰＣＲ変異誘発キットと共に提供される取扱説明書に従って、配列番号１（５’−ＧＣＧＣＡＴＡＴＧＧＴＴＴＣＧＴＡＴＡＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＣ−３’）および配列番号２（５’−ＡＴＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＡＣＣＧ−３’）として同定されたプライマーを使用して、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ遺伝子（コード配列；配列番号３）上で変異性ＰＣＲを実施した。低い突然変異頻度（０〜３個の突然変異／ｋｂ）および中程度の突然変異頻度（３〜７個の突然変異／ｋｂ）を生じるのに奨励される反応条件を用いた。カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのｐＴｒｃＨｉｓ２ ＴＯＰＯＴＡ発現キットと共に提供される取扱説明書に従って、１．１ｋｂ ＰＣＲ生成物の１０％を発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２ ＴＯＰＯ中にライゲートした。供給元インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の推奨に従って、ライゲーション混合物の半分を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０中に形質転換した。形質転換混合物の１％を５０ｍｇ／Ｌアンピシリン添加ＬＢプレート上に播種した。得られた形質転換体は２００〜４００個のコロニーに達し、生成した全ＰＣＲ生成物は、改善された酵素活性をスクリーンする必要数には十分すぎる４００，０００〜８００，０００個のコロニーを生じられることが示唆された。突然変異頻度はクローンの無作為選択サンプルのヌクレオチド配列分析によって確認された。配列分析からはまた、予期されたように挿入物のおよそ５０％が正方向であることが確認された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析からは、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって推奨されるように生育および誘導すると、正方向挿入のある本質的に全てのクローンが４１ｋＤのニトリラーゼタンパク質を発現することが確認された。

さらに配列番号１および配列番号２として同定されたプライマーを使用して、標準ＰＣＲによってＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ遺伝子を増幅し、製造業者の推奨に従って得られたＤＮＡ生成物をインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＴｒｃＨｉｓ２−ＴＯＰＯ中にクローンし、プラスミドｐＮＭ１８を生じさせた。ｐＮＭ１８での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０の形質転換からは、対照として有用な株が生じた。ｐＮＭ１８（配列番号３）中のＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ「対照」配列は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中での発現を容易にするＧＴＧからＡＴＧへの開始コドンの変化以外は、野生型Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗのコード配列と同一であった。

（実施例２）
（ニトリラーゼ活性増大についてのＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼランダム変異誘発ライブラリーのスクリーニング）
各変異性ＰＣＲライブラリーからのおよそ５，０００個のコロニーを５０ｍｇ／Ｌアンピシリン添加ＬＢ寒天上に播種した。ロボット工学を使用して、９６−ウェルマイクロタイタープレート内でハイスループットスクリーニングを実施した。５０ｍｇ／Ｌアンピシリンおよび１ｍＭ ＩＰＴＧ添加液体ＬＢ中で、個々のコロニーを３７℃で２００ｒｐｍの振盪で１８時間生育させた後、培養に１０ｍＭの３−ヒドロキシバレロニトリル（３−ＨＶＮ）を３７℃で１時間添加し８０Ｈｚ往復振盪した。細菌を濾過して除去し反応を停止して、分析する上清をマイクロタイタープレート内に密封し、分析まで４℃で保存した。質量分析法（ＡＰＣＩ−ＭＲＭ、５ｍＬ／分の移動相９５％ＭｅＯＨ／５％Ｈ_２Ｏ、ニードルあたり４ｍＬ／分の５０％ＭｅＯＨ／５０％Ｈ_２Ｏでのニードル洗浄）によって、３−ヒドロキシ吉草酸（３−ＨＶＡ）の生成を測定した。対照（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８）のおよそ５倍を超える３−ＨＶＮの転換を示す３個のクローンが同定され、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ４、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ２および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９と命名された。

（実施例３）
（ニトリラーゼ活性に関する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（対照）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ４、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ２および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９のアッセイ）
滅菌１２５ｍＬフラスコに、５０ｍｇ／Ｌアンピシリン含有ＬＢ培地５０ｍＬを入れて、次に凍結細胞原液を掻き取ってフラスコ内に入れ、得られた混合物を３７℃および２００ｒｐｍで１２〜１６時間インキュベートして接種材料を調製した。得られた培養の光学濃度を記録し、次に水中８０％のグリセロールを最終濃度１５％（ｖ／ｖ）に添加して、得られた接種材料の１４．３ｍＬのアリコートを５０ｍＬ遠心管に入れ、使用まで−８０℃で凍結保存した。４Ｌ滅菌フラスコに、１．８０ＬのＬＢブロス、０．９ｍＬのアンピシリン水溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）、および１．８ｍＬのＩＰＴＧ（１．０Ｍ）水溶液を添加した。次にフラスコに８７．５ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（対照）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ４、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ２または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９接種材料を添加し、フラスコ内容物を混合して、得られた混合物の２５０ｍＬのアリコートを６個の各滅菌１Ｌフラスコに移した。培養を、２００ｒｐｍで回転混合しながら３７℃で８時間インキュベートして、各フラスコからの細胞を４℃で遠心分離して収集し−８０℃で凍結保存した。

磁気撹拌棒を装着した４ｍＬガラスバイアルに１．０ｍＬの水中の１．０Ｍ ３−ヒドロキシバレロニトリルを添加して、バイアルとその内容物を温度調節水浴内で２５℃に平衡化した。撹拌しながら、２５℃に予備平衡化した４００ｍｇ湿潤細胞ペーストを含有する１．０ｍＬの０．１００Ｍカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）をバイアルに添加した。所定時間にサンプル（０．１００ｍＬ）を採取して、０．１００ｍＬの水、０．０２０ｍＬの６．０Ｎ酢酸、および０．２００ｍＬの水中の０．２０Ｍ酪酸ナトリウム（ＨＰＬＣ外標準）を含む溶液と混合した。得られた混合物を遠心分離して、スペルコ（Ｓｕｐｅｌｃｏ）ＬＣ−１８−ＤＢカラム（１５ｃｍ×４．６ｍｍ）：移動相：水性１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）、１０ｍＭ酢酸（ＡｃＯＨ）、７．５％（ｖ／ｖ）メタノールを使用して、得られた上清を３−ヒドロキシ吉草酸についてＨＰＬＣによって分析した。アッセイで使用した各細胞ペーストの乾燥細胞重量（ｄｃｗ）を使用して、３−ヒドロキシ吉草酸の生成速度に基づいて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（表１）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ４（表２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ２（表３）、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９（表４）のニトリラーゼ活性を判定した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（対照）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ４、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ２、および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９の相対ニトリラーゼ活性の比較を表５に示す。

（実施例４）
（ニトリラーゼ活性を増大させるＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼにおける突然変異の同定）
ヌクレオチド配列分析を使用して、ニトリラーゼ活性増大を有する３つのクローン（ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ４、ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ２、およびＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９）それぞれに存在する突然変異を判定し、対応するアミノ酸変化を推定した。ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８対照（配列番号３および４）と比べて、同一であるＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ２およびＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９（配列番号５および６）は１つのアミノ酸変化（Ｔｈｒ２１０からＡｌａ、Ｔ２１０Ａ）を有し、ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｂ４（配列番号７および８）は、３つのアミノ酸変化（Ｔｙｒ６５からＣｙｓ（Ｙ６５Ｃ）、Ｐｈｅ１７４からＩｌｅ（Ｆ１７４Ｉ）、およびＴｈｒ２１０からＩｌｅ（Ｔ２１０Ｉ））を有する。これらの変化のいずれもこの酵素の触媒領域内、または多数のニトリラーゼ酵素中の概して保存された領域内には含有されず、これらの特定の残基における変化がニトリラーゼ活性の改善を生じるかを先験的に予期する方法がないことが示唆された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーザーデンシトメトリー分析による定量では、これらの変化のいずれもニトリラーゼタンパク質生成に対して検出可能な効果を有さなかった。

（実施例５）
（スレオニン残基２１０における飽和変異誘発）
カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））からのクイックチェンジ（Ｑｕｉｋ Ｃｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発キットを使用して、７２Ｗニトリラーゼ酵素の２１０位のスレオニン残基を別の１９個の各アミノ酸に変化させた。製造業者の取扱説明書に従って変性オリゴヌクレオチドを使用し、得られたコドン変化の同定をヌクレオチドシーケンシングによって判定した。この方法によって得られなかったあらゆるコドン変化は、所望の特定コドン変化を組み込んだ非変性オリゴヌクレオチドを使用して生じさせた。例えば２１０Ｍｅｔ（Ｔ２１０Ｍ）は、配列番号９（５’−ＣＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＣＧＡＣＧＧＴＣＡＴＧＣＧＣＴＣＧＴＡＣＧＣＡＡＴＣＧＡＡＧＧ−３’）、および配列番号１０（５’−ＣＣＴＴＣＧＡＴＴＧＣＧＴＡＣＧＡＧＣＧＣＡＴＧＡＣＣＧＴＣＧＣＧＴＴＧＧＣＴＴＣＧ−３’）として同定されたプライマーを使用して得られた（下線付きヌクレオチドは、新規コドンを示す）。

全ての２０個の酵素変異型からニトリラーゼ活性を測定した。以前に同定された２１０Ａｌａ（Ｔ２１０Ａ）の改善（実施例３および４）に加えて、対照（ｐＮＭ１８）と比較して増大した活性が２１０Ｃｙｓについて観察された（Ｔ２１０Ｃ、配列番号１１および１２）（表６および７）。２１０Ｃｙｓの変化は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析による判定でニトリラーゼタンパク質生成に対して検出可能な効果を有さなかった。本発明者らは残基２１０で、ニトリラーゼ活性に改善を生じるその他の変化を見いださず、ニトリラーゼ活性に対していくつかの変化は効果を有さず（例えば２１０Ｖａｌ（Ｔ２１０Ｖ））、いくつかの変化は有害効果を有した（例えば２１０Ｇｌｙ（Ｔ２１０Ｇ））。これらの結果は、残基２１０におけるいかなる特定の突然変異の効果も先験的に予期する方法がないことを示唆する。

（実施例６）
（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８細胞（対照）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９細胞のカルシウム−架橋アルジネート中の固定化）
４．０Ｌ滅菌フラスコに、１．８０ＬのＬＢブロス、０．９ｍＬのアンピシリン（１００ｍｇ／ｍＬ）溶液、および１．８ｍＬのＩＰＴＧ（１．０Ｍ）水溶液を添加した。次にフラスコに、８７．５ｍＬの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（対照）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９接種材料を添加してフラスコ内容物を混合し、得られた混合物の２５０ｍＬのアリコートを７個の各滅菌１Ｌフラスコに移した。培養を２００ｒｐｍで回転混合して３７℃で８時間インキュベートし、得られた細胞懸濁液を合わせて４℃で遠心分離によって細胞を収集し、−８０℃で凍結保存した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（対照）では６００ｎｍにおける平均初期ＯＤが０．１３３ＡＵ、８時間後の平均最終ＯＤは２．１３ＡＵであり、約６ｇの細胞ペーストが生じた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９では、平均最終ＯＤが１．６８ＡＵであり、約５ｇの細胞ペーストが生じた。

磁気撹拌棒を装着し、５０℃で７．４６ｇの蒸留脱イオン水を含有する１００ｍＬの培養液ボトル内に、迅速に撹拌しながら０．４１３ｇのＦＭＣバイオポリマープロタナール（ＢｉｏＰｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｏｔａｎａｌ）（登録商標）ＬＦ １０／６０アルジネートを緩慢に添加した。アルジネートが完全に溶解するまで混合物を迅速に撹拌しながら７５〜８０℃に加熱して、得られた溶液を水浴中で２５℃に冷却した。アルジネート懸濁液に、４．７５ｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ｐＮＭ１８）湿潤細胞ペースト（乾燥細胞重量２３．７％）および２．３７ｍＬの蒸留水、または４．９７ｇの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ｐＮＭ１８／Ｈ９）湿潤細胞ペースト（乾燥細胞重量２２．６％）および２．１５ｍＬの蒸留水のいずれかを撹拌しながら添加した。２５℃で撹拌しながら８０ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）に、細胞／アルジネート混合物をシリンジで滴下して添加した。２時間撹拌した後、得られたビーズから緩衝液をデカントし、それを２５℃で３０ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）に再懸濁した。撹拌しながら０．６１ｇの水中の２５重量％グルタルアルデヒド（ＧＡ）を添加してビーズを２５℃で１．０時間混合した。次に懸濁液に２．４２ｇの水中の１２．５重量％ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（ＢＡＳＦルパゾール（Ｌｕｐａｓｏｌ）（登録商標）ＰＲ９７１Ｌ、平均分子量約７５０，０００）を添加して、２５℃でビーズをさらに１時間混合した。次に架橋ビーズを２５℃で３０ｍＬの５ｍＭ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄し、５℃で１．０Ｍ酢酸アンモニウム、４ｍＭ酢酸カルシウム、および１０ｍＭ炭酸水素アンモニウムを含有する水性緩衝液（ｐＨ７．１）中に保存した。

（実施例７）
（３−ヒドロキシバレロニトリルの加水分解触媒としてのアルジネート−固定化大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（対照）の比較）
オーバーヘッド撹拌機を装着した５０ｍＬのジャケット付反応容器内（再循環温度浴で３５℃に温度調節される）に、実施例６で述べるようにして調製された６．０ｇのＧＡ／ＰＥＩ−架橋大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８細胞／アルジネートビーズ（対照）を入れた。反応容器に１３．４ｍＬの蒸留脱イオン水、０．２ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）および０．４０ｍＬ（０．３８６ｇ）の３−ヒドロキシバレロニトリル（総濃度０．４００Ｍ）を添加して、混合物を３５℃で撹拌した。サンプル（０．２００ｍＬ）を０．２００ｍＬの２００ｍＭ酪酸ナトリウム（ＨＰＬＣ外標準）と共に混合し、上清をＨＰＬＣで分析した。２５時間後、３−ＨＶＮの転換は１００％であり、３−ＨＶＡの収率は１００％であった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８細胞／アルジネートビーズ触媒（対照）のニトリラーゼ活性は０．４４９ ３−ＨＶＮＵ／ｇビーズであった。

触媒が実施例６で述べるようにして調製された６．０ｇのＧＡ／ＰＥＩ−架橋大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９細胞／アルジネートビーズであったこと以外は、すぐ上で述べた反応を繰り返した。１９時間後、３−ＨＶＮの転換は１００％であり、３−ＨＶＡの収率は１００％であった。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９細胞／アルジネートビーズ触媒のニトリラーゼ活性は、２．８５ ３−ＨＶＮＵ／ｇビーズ（対照と比べて６．３５倍の改善）であった。反応終了時に、生成混合物を触媒ビーズからデカントし、さらに１３．３ｍＬの蒸留脱イオン水、０．２ｍＬの０．２０Ｍ酢酸カルシウム緩衝液（ｐＨ７．０、反応混合物中の最終カルシウムイオン濃度２．０ｍＭ）、および０．４０ｍＬ（０．３８６ｇ）の３−ヒドロキシバレロニトリル（総濃度０．４００Ｍ）を固定化細胞触媒と共に３５℃で混合した。２０時間後、３−ＨＶＮの転換は１００％であり、３−ＨＶＡの収率は１００％であった。触媒のニトリラーゼ活性は２．９９Ｕ／ｇビーズであった。このリサイクル手順を合計２１回の連続反応を繰り返し、各反応における触媒のニトリラーゼ活性および活性再生％を表１１に示す。反応２１（表８）では、２０時間後に３−ＨＶＮの転換は１００％、３−ＨＶＡの収率は１００％であり、触媒のニトリラーゼ活性は初期触媒活性の８１％であった。

（実施例８）
（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８（対照）およびＦＭ５／ｐＮＭ１８／Ｈ９細胞の構築および発酵）
当該技術分野でよく知られている塩化カルシウム手順を使用して、プラスミドｓｐＮＭ１８（実施例１）およびｐＮＭ１８／Ｈ９（実施例２）で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＦＭ５（ＡＴＣＣ ５３９１１）を独立に形質転換させた。

ドイツ国メルズンゲンのＢ．ブラウン・バイオテック・インターナショナル社（Ｂ．Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｇｍｂｈ（Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））からの１４Ｌブラウン・バイオスタット（Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｃ発酵槽内において、グルコース、アンモニア、酵母抽出物、および塩添加ミネラル培地中で、ニトリラーゼの生成を行った。発酵槽の接種に先だって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＦＭ５／ｐＮＭ１８（対照）と、それぞれ（実施例１および２で述べるように）プラスミドｐＮＭ１８およびｐＮＭ１８／Ｈ９を有するＦＭ５／ｐＮＭ１８／Ｈ９とを１０〜２０時間、種培養中で生育させた。ＩＰＴＧを規定時間に添加して、細胞をＩＰＴＧ添加の２４時間後に収集した。

（発酵プロトコル）
８０ｇの酵母抽出物、１６０ｇのカゼアミノ酸、８．０ｇのＭｇＳＯ_４＊７Ｈ_２Ｏ、８．０ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、およびのニュージャージー州マウントオリーブのＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｏｕｎｔ Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ））からの１０ｍＬのメイズ（Ｍａｚｕ）ＤＦ２０４消泡剤を含有する７．５Ｌの初期バッチで、容器培地を調製した。滅菌に続いて３６９ｇのグルコース溶液（６０％ｗ／ｗ）、１６０ｍＬの微量元素溶液（表９）、２００ｍＬのＰＯ_４溶液（２００ｍＬの蒸留Ｈ_２Ｏ中の２１．０ｇのＫ_２ＨＰＯ_４および１１．０ｇのＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ６．８に調節、蒸気滅菌済み）、および１００ｍｇ／Ｌのアンピシリンを添加した。ＮＨ_４ＯＨ（４０％ｗ／ｖ）および２０％ｗ／ｖのＨ_２ＰＯ_４をｐＨ対照に使用した。撹拌、通気、ｐＨ、圧力、溶存酸素濃度（ＤＯ）、および温度の設定点を下の表１０に示す。最初に増大する酸素要求と共に上昇する撹拌、およびそれに続く通気によって、溶存酸素濃度を空気飽和の２５％に調節した。２Ｌのフラスコ内で５００ｍＬの種培養をＯＤ_{λ＝５５０}が＞２．０になるまで３６℃、３００ｒｐｍで１０〜２０時間生育させた。培養密度２０から３０ＯＤで、発酵槽にさらにＡＭＰを１００ｍｇ／Ｌに添加した。ＩＰＴＧをＦＭ５／ｐＮＭ１８（対照）では０．１ｍＭに、ＦＭ５／ｐＮＭ１８／Ｈ９では１ｍＭに、ＦＭ５／ｐＮＭ１８では３５〜４０ＯＤ_{λ＝５５０}で、ＦＭ５／ｐＮＭ１８／Ｈ９では２０〜３０ＯＤ_{λ＝５５０}で添加した。グルコース供給を＜５ｇ／Ｌで開始して、計画速度は表１１に示す。グルコースが２ｇ／Ｌを超えて蓄積する場合、グルコース供給速度を低下させた。ＩＰＴＧ添加の２４時間後、細胞を５〜１０℃に冷却して遠心分離によって収集した。

実施例３で述べるようにして、３−ＨＶＮニトリラーゼ活性について大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５形質転換体をアッセイした。二連発酵ランで生成された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５株のニトリラーゼ活性を下の表１２に示し、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗおよび大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１（ＡＴＣＣ ＰＴＡ−１１７７、米国特許公報（特許文献５））のニトリラーゼ活性と比べた。Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗと比べた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１のニトリラーゼ触媒改善（先に述べた）は、改善されたニトリラーゼ酵素発現に起因する。対照的に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８（対照）と比べて大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８／Ｈ９で実証される顕著な改善は、酵素構造の改変から得られた改善されたニトリラーゼ酵素活性に起因する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８（対照）と比べた、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８／Ｈ９のニトリラーゼ活性の約５．５倍の改善に加えて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５／ｐＮＭ１８／Ｈ９のニトリラーゼ活性が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＳＳ１００１よりも約４．２倍高いことは注目に値する。

（実施例９）
（３−ＨＢＮおよび３−ＨＶＮの加水分解に関する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（対照）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９のニトリラーゼ活性の比較）

実施例３で述べる手順に従って、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（対照）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９の調製を繰り返し、実施例３で述べるようにして、０．５Ｍ ３−ヒドロキシバレロニトリル（３−ＨＶＮ）または０．５Ｍ ３−ヒドロキシブチロニトリル（３−ＨＢＮ）の加水分解に関するニトリラーゼ活性（表１３）について得られた細胞をアッセイした。３−ＨＢＮに関する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８／Ｈ９のニトリラーゼ活性は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０／ｐＮＭ１８（対照）と比較して約１．９倍であった。

（実施例１０）
（７２Ｗニトリラーゼの触媒領域の標的飽和変異誘発）
変性オリゴヌクレオチド、およびカリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ））からのクイックチェンジ（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）部位特異的変異誘発キットを使用して、製造業者の取扱説明書に従って、既知の細菌ニトリラーゼ中では一般には保存されない残基（下線）のＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼ（配列番号４）触媒領域（１６０Ｇ １６１Ｇ １６２Ｌ １６３Ｎ １６４Ｃ １６５Ｗ １６６Ｅ １６７Ｈ １６８Ｆ １６９Ｑ １７０Ｐ １７１Ｌ １７２Ｓ １７３Ｋ）内の飽和変異誘発を完了した。具体的には、標的となる各活性部位残基について１つずつ、９個のミニライブラリー（５００〜１０００個のコロニー）を構築した。前述（実施例２）のようにして、これらの各ライブラリーを３−ＨＶＮニトリラーゼ活性増大についてスクリーンした。１１個のクローン（全て１６８Ｆ（Ｐｈｅ１６８）ミニライブラリーから）が同定され、各クローンは対照（ｐＮＭ１８）のおよそ２〜３倍の３−ＨＶＡ生成を示した。ヌクレオチドシーケンシングを使用して、ニトリラーゼ活性増大をもたらす特定のコドン変化を判定した（表１４）。ニトリラーゼ活性は直接測定されないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は各突然変異体から、実質的に等しいレベルのニトリラーゼタンパク質が生成されたことを判定した。したがって突然変異体からの３−ＨＶＡの増大する生成は、酵素のニトリラーゼ活性増大に起因すると結論された。

Claims (16)

1. 配列番号６、８、１２、１４、１６、および１８からなる群から選択されるアミノ酸配列で表される酵素的に活性なポリペプチドをコード化している単離された核酸分子であって、
   該単離された核酸分子は、３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に転換する際に、同一反応条件下でのアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼの活性よりも少なくとも１．８倍高いニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコード化していることを特徴とする単離された核酸分子。
2. 配列番号５、７、１１、１３、１５、および１７からなる群から選択される核酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の単離された核酸分子。
3. 適切な調節塩基配列に作動可能に結合する請求項１〜２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
4. 請求項３に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする発現カセット。
5. 請求項３に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする形質転換された微生物。
6. 請求項４に記載の発現カセットを含むことを特徴とする形質転換された微生物。
7. 請求項５に記載の形質転換された微生物であって、
   前記微生物が、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）種、クルイヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）種、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種からなる群から選択されることを特徴とする微生物。
8. 請求項７に記載の形質転換された微生物であって、
   前記形質転換された微生物が、ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ ４７０７６）、ＦＭ５（ＡＴＣＣ ５３９１１）、Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ ２７３２５）、ＭＣ４１００（ＡＴＣＣ ３５６９５）、およびＷ１４８５（ＡＴＣＣ １２４３５）からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株であることを特徴とする微生物。
9. ３−ヒドロキシニトリルを３−ヒドロキシカルボン酸に加水分解する方法であって、
   水性反応混合物中の３−ヒドロキシニトリルとニトリラーゼ触媒とを同一反応条件下で接触させ、それによって前記３−ヒドロキシニトリルが対応する３−ヒドロキシカルボン酸に加水分解されるステップであって、該ニトリラーゼ触媒が請求項１〜２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子によってコード化されているものであるステップを含むことを特徴とする方法。
10. 請求項９に記載される方法であって、
    前記ステップ方法で生成された３−ヒドロキシカルボン酸を単離するステップを含むことを特徴とする方法。
11. 請求項９又は１０に記載の方法であって、
    前記３−ヒドロキシニトリルが３−ヒドロキシバレロニトリルまたは３−ヒドロキシブチロニトリルであることを特徴とする方法。
12. 請求項９又は１０に記載の方法であって、
    前記ニトリラーゼ触媒が、Ａ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼの活性と比較して、少なくとも５倍、ニトリラーゼ活性を増大させることを特徴とする方法。
13. ３−ヒドロキシバレロニトリルを３−ヒドロキシ吉草酸に加水分解する方法であって、
    水性反応混合物中の３−ヒドロキシバレロニトリルと、請求項１及び２のいずれか一項に記載の単離された核酸分子によってコード化されているニトリラーゼ触媒とを接触させ、それによって前記３−ヒドロキシバレロニトリルが３−ヒドロキシ吉草酸に加水分解されるステップを含むことを特徴とする方法。
14. 請求項１３に記載される方法であって、
    前記ステップ方法で生成された３−ヒドロキシ吉草酸を単離するステップを含むことを特徴とする方法。
15. ３−ヒドロキシブチロニトリルを３−ヒドロキシ酪酸に加水分解する方法であって、
    水性反応混合物中の３−ヒドロキシブチロニトリルと、配列番号６のポリペプチド配列を含むニトリラーゼ触媒とを接触させ、それによって前記３−ヒドロキシブチロニトリルが
    ３−ヒドロキシ酪酸に加水分解されるステップであって、該ニトリラーゼ触媒が、同一反応条件下でのＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ ５５７４６）ニトリラーゼの活性と比較して、ニトリラーゼ活性に少なくとも１．８倍の増加を有するものであるステップを含むことを特徴とする方法。
16. 請求項１５に記載される方法であって、
    前記ステップ方法で生成された３−ヒドロキシ酪酸を単離するステップを含むことを特徴とする方法。