CN103361386B - 一种罗素伐他汀中间体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及罗素伐他汀中间体 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯和羟基被保护的 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯的制备方法，该方法以 (R)-4- 氰基 -3- 羟基丁酸甲酯为底物，使其在酶的作用下反应生成所述 (R)-3- 羟基戊二酸单甲酯，特别是，所述的酶为重组腈水解酶，所述的反应在 pH 为 7.0~9.0 的水相缓冲液中以及温度 25 ℃ ~35 ℃下进行。 本发明方法通过采用特定的重组腈水解酶，解决了现有生物法中底物浓度过低，转化率低的问题。该方法反应条件温和，反应效率高，操作简便， 具有重要的工业应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的生物制备方法。
背景技术
心脑血管疾病是危害人类（特别是中老年）健康最常见、最严重的疾病之一。血脂异常是动脉粥样硬化、冠心病以及其它心脑血管疾病的重要危险因素。根据近年卫生部在全国范围内进行的中国居民营养与健康状况调查显示，总患病率为18.6％，全国患者总人数达1.6亿。
调脂药可有效降低此类疾病的发生率和死亡率，对心血管疾病的防治产生积极的作用和深远的影响。他汀类药物（3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂）由于副作用较少，是目前世界上最为畅销的降胆固醇和降血脂药物。由阿斯利康(Astrazeneca)公司开发的罗素伐他汀(Rosuvastatin,英文商品名Crestor)于2002年11月首次在荷兰获批，2003年8月通过美国FDA上市审批，2009年在全球销售额44亿美元，排名第十七位。罗素伐他汀在药效和安全性方面均达到令人满意的结果，被称为“超级他汀”。
罗素伐他汀的手性侧链合成是其生产的关键步骤。(R)-3-羟基戊二酸单甲酯及其后续的羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯是合成罗素伐他汀侧链的重要手性前体。利用化学方法合成(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的方法，由于条件极端且水解无选择性，极易破坏手性基团和其它活性基团，生成副产物，因此并没有得到广泛的应用。
中国发明专利公开CN101805756A公开了一种生物催化法生产他汀类药物中间体的方法，其中公开了利用消旋的4-氰基-3羟基丁酸乙酯生产(R)-3-羟基戊二酸乙酯。采取该方法，虽然能够克服化学法的不足，但是消旋体水解后得到的目标产品只有50%的理论得率，意味着一半的底物被浪费，不符合绿色化学和原子经济性的原则，而且该方法的底物投料量较低，只有20mmol/L，不具有工业应用的价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种罗素伐他汀中间体(R)-3-羟基戊二酸单甲酯和羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，实现了接近100%的转化率和高反应底物浓度。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
一种(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，该方法以(R)-4-氰基-3-羟基丁酸甲酯为底物，使其在酶的作用下反应生成所述(R)-3-羟基戊二酸单甲酯，特别是，所述的酶为重组腈水解酶，该重组腈水解酶的制备方法为：将含有腈水解酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下振荡培养，培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入诱导剂，于25～33℃下继续培养8～12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8～12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10℃～-25℃，然后冷冻干燥24～48小时，即得冻干的粉状重组腈水解酶；所述的反应在pH为7.0～9.0的水相缓冲液中以及温度25℃～35℃下进行。
根据本发明，所述的诱导剂可以且优选为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。所述的水相缓冲液可以为磷酸盐缓冲液或Tri-HCl缓冲液。重组腈水解酶与底物的投料质量比可以为0.01～0.1:1，优选为0.02～0.05:1例如0.03:1。反应起始时，底物浓度可以为0.8～1.5mol/L，优选为1.0～1.5mol/L。
根据本发明的一个具体方面：所述方法具体实施如下：将重组腈水解酶加入到水相缓冲液中，然后采用恒流泵流加底物，待底物加毕，使反应体系在温度25℃～35℃下以及搅拌下反应，至底物转化率大于等于99.0%，终止反应。
进一步地，终止反应后，用盐酸调节体系至酸性（例如pH2～6，优选pH2～3），然后用硅藻土过滤，用乙酸乙酯冲洗滤渣；滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相；有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后得到黄褐色油状物即为(R)-3-羟基戊二酸单甲酯。
本发明采取的又一技术方案是：
一种羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，该羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯为(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯，其包括如下步骤：
（1）按照上述的方法制备得到(R)-3-羟基戊二酸单甲酯；
（2）使(R)-3-羟基戊二酸单甲酯与叔丁基二甲基氯硅烷（TBSCl）在有机溶剂中，催化剂和有机碱缚酸剂存在下，于常温下搅拌反应，得到3-叔丁基二甲基硅氧基-戊二酸甲酯叔丁基二甲基硅酯，其中，(R)-3-羟基戊二酸单甲酯、叔丁基二甲基氯硅烷以及有机碱缚酸剂的投料摩尔比为0.4～0.5:1:1.05～1.2。
（3）使3-叔丁基二甲基硅氧基-戊二酸甲酯叔丁基二甲基硅酯在碳酸钾存在下、溶剂中发生水解反应生成所述(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯。
优选地，步骤（2）中，所述催化剂为4-二甲氨基吡啶（DMAP），其与(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的投料摩尔比为0.002～0.01:1。
具体地，有机碱缚酸剂可以为咪唑、N,N-二异丙基乙胺、吡啶、三乙胺等，可以是其中的一种，也可以是多种的组合。
优选地，步骤（3）中，采用甲醇、四氢呋喃以及水的组合作为溶剂，所述碳酸钾与3-叔丁基二甲基硅氧基-戊二酸甲酯叔丁基二甲基硅酯的投料摩尔比为4.5～5:1。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明方法通过采用特定的重组腈水解酶，解决了现有生物法中底物浓度过低，转化率低的问题。该方法反应条件温和，反应效率高，操作简便，特别是，反应底物的浓度可以有大幅提高，提高了制备(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的效率和降低了反应的成本，具有重要的工业应用价值。
本发明提供的羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，操作简单，条件温和，且所得羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的收率高。
附图说明
图1为实施例4所制备的产物的氢核磁谱图。
具体实施方式
本发明提供一种利用重组腈水解酶制备(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的方法，反应方程式如下：
反应所用的物质除重组腈水解酶外，均可通过商购获得。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。
实施例1重组腈水解酶的制备
从甘油管或转化平板将含有腈水解酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到4mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基活化过夜（37℃，200rpm）。从过夜培养物以1/100接种量转接100mL含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基，37℃、200rpm振荡培养至OD600值达到0.6-0.8，加入IPTG于30℃继续培养过夜。离心收集细胞，用10mL磷酸缓冲液（2mM，pH7.0）悬浮细胞。细胞悬浮液置于冰浴中超声波破碎10分钟，离心，上清液预冻过夜，冻干24h-48h，即得冻干粉状的重组腈水解酶。
实施例2克级(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备
将85ml磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)加至250mL圆底烧瓶中，加入450mg重组腈水解酶；称取15g(R)-4-氰基-3-羟基丁酸甲酯并采用恒流泵流加至体系中，在30℃下磁力搅拌反应24h后取样进行LC-MS分析，转化率>99%，终止反应，用盐酸调节反应液pH至酸性（pH=2～3），硅藻土过滤，用乙酸乙酯冲洗滤渣；滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相；无水硫酸钠干燥，浓缩后得14g黄褐色油状物即为(R)-3-羟基戊二酸单甲酯，收率81.4%，GC纯度88.2%。
实施例3公斤级(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备
在反应器中加入8.5L磷酸盐缓冲液(0.1M，pH8.0)，再加入45g重组腈水解酶；称取1.5Kg(R)-4-氰基-3-羟基丁酸甲酯并采用恒流泵流加至体系中，在30℃下机械搅拌反应24h后取样进行LC-MS分析，转化率>99%，终止反应。盐酸调节反应液pH至酸性（pH=2～3），硅藻土过滤，用乙酸乙酯冲洗滤渣；滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相；无水硫酸钠干燥，浓缩后得1.4Kg左右黄褐色油状物即为(R)-3-羟基戊二酸单甲酯，收率75%，GC纯度88%。
实施例4羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯（(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯，化合物1）的制备
合成路线如下：
具体实施如下：
（1）、(R)-3-羟基戊二酸单甲酯(203g，1.25mol，1eq)加至5000mL圆底烧瓶中，加入1700mL二氯甲烷，加入咪唑(201g，2.95mol，2.35eq)；反应液用冰浴冷却，缓慢加入TBSCl(430g，2.85mol，2.3eq)，加入DMAP(0.8g，6.6mmol，0.005eq)；反应液于常温下搅拌，LC-MS监控，搅拌30h后反应完全，终止反应。向反应液中加入水(1500mL)与氯化钠(300g)，搅拌至完全溶解后分出有机相；水相用乙酸乙酯(250mL×2)萃取，合并有机相浓缩得到543g化合物2的粗品直接用于下一步反应。
（2）、将步骤（1）所得粗品加至5000ml圆底烧瓶中，加入甲醇(330mL)、四氢呋喃(330mL)、水(660mL)，加入碳酸钾(850g，6.16mol，4.93eq)，于常温下搅拌，TLC监控，反应12h后反应完全，终止反应。向反应体系中加入水(1500mL)与石油醚(1200mL)，溶液分三相，取出中间相，浓缩除去甲醇与四氢呋喃；加水稀释后用石油醚洗涤(500mL×3)，水相用盐酸调节pH至1，用乙酸乙酯萃取(1000mL×3)，合并有机相浓缩除去溶剂得到深色油状物，向该油状物中加入石油醚(1000mL)，加入无水硫酸钠，活性炭（50克）搅拌3h，过滤后浓缩得到淡黄色油状物265g，即为(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯（化合物1），收率76.6%。产物光学纯度大于99.6%。(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯的氢核磁谱图参见图1。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，所述羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯为(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯，其特征在于：所述制备方法包括如下步骤：
(1)以(R)-4-氰基-3-羟基丁酸甲酯为底物，使其在酶的作用下反应生成所述(R)-3-羟基戊二酸单甲酯，所述的酶为重组腈水解酶，该重组腈水解酶的制备方法为：将含有腈水解酶基因的重组大肠杆菌单菌落接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下活化8～12小时，将活化后得到的培养物接种到含氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，于35～40℃下振荡培养，培养至OD600值达到0.6～0.8时，加入诱导剂，于25～33℃下继续培养8～12小时，离心，收集沉淀物，加入磷酸盐缓冲液得悬浮液，将悬浮液置于冰水浴中超声破碎8～12分钟，再离心，将上清液预冻至温度降至-10℃～-25℃，然后冷冻干燥24～48小时，即得冻干的粉状重组腈水解酶；所述的反应在pH为7.0～9.0的水相缓冲液中以及温度25℃～35℃下进行；
(2)使(R)-3-羟基戊二酸单甲酯与叔丁基二甲基氯硅烷在有机溶剂中，催化剂和有机碱缚酸剂存在下，于常温下搅拌反应，得到3-叔丁基二甲基硅氧基-戊二酸甲酯叔丁基二甲基硅酯，其中，(R)-3-羟基戊二酸单甲酯、叔丁基二甲基氯硅烷以及有机碱缚酸剂的投料摩尔比为0.4～0.5:1:1.05～1.2，其中所述催化剂为4-二甲氨基吡啶，其与(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的投料摩尔比为0.002～0.01:1，所述有机碱缚酸剂为选自咪唑、N,N-二异丙基乙胺、吡啶及三乙胺中的一种或多种的组合；
(3)使3-叔丁基二甲基硅氧基-戊二酸甲酯叔丁基二甲基硅酯在碳酸钾存在下、溶剂中发生水解反应生成所述(R)-3-叔丁基二甲基硅氧基戊二酸单甲酯，其中采用甲醇、四氢呋喃以及水的组合作为溶剂，所述碳酸钾与3-叔丁基二甲基硅氧基-戊二酸甲酯叔丁基二甲基硅酯的投料摩尔比为4.5～5:1。
2.根据权利要求1所述的羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的诱导剂为异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。
3.根据权利要求1所述的羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述的水相缓冲液为磷酸盐缓冲液或Tri-HCl缓冲液。
4.根据权利要求1所述的羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，重组腈水解酶与底物的投料质量比为0.01～0.1:1，反应起始时，底物浓度为0.8～1.5mol/L。
5.根据权利要求4所述的羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，重组腈水解酶与底物的投料质量比为0.02～0.05:1，反应起始时，底物浓度为1.0～1.5mol/L。
6.根据权利要求1至5中任一项权利要求所述的羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述方法具体实施如下：将所述重组腈水解酶加入到水相缓冲液中，然后采用恒流泵流加底物，待底物加毕，使反应体系在温度25℃～35℃下以及搅拌下反应，至底物转化率大于等于99.0％，终止反应。
7.根据权利要求6所述的羟基被保护的(R)-3-羟基戊二酸单甲酯的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，终止反应后，用盐酸调节体系至酸性，然后用硅藻土过滤，用乙酸乙酯冲洗滤渣；滤液用乙酸乙酯萃取，合并有机相；有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩后得到黄褐色油状物即为(R)-3-羟基戊二酸单甲酯。
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