KR101999433B1 - 사포를 이용한 목분의 dna 분리 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 목재 DNA 분리 방법에 관한 것으로, 사포를 이용하여 목분을 제조하고, 제조한 목분을 용매로 수화시키는 경우 목재 DNA를 효율적으로 분리할 수 있다.

Description

사포를 이용한 목분의 DNA 분리 방법{Method for Isolating Genomic DNA from Wood Flour using Sandpaper}

본 발명은 사포를 이용한 목분의 DNA 분리 방법에 관한 것이다.

수종 감정은 목재의 활용에 있어 필수적인 절차로써 수종에 따라 목재의 이용가치가 결정되며, 수종 감정 시험은 주로 현미경에 의한 해부학적 형태의 관찰과 평가에 의해 이루어지고 있다.

현미경에 의한 해부학적 형태의 관찰 방법은 속(genus)간의 구별에는 매우 효과적인 방법이며, 종(species)간의 구별에도 일부 효과적으로 이용되고 있다. 그러나 종간의 구별이 어려운 경우가 빈번하게 발생되고 있으며 아종(subspecies) 등의 보다 세부적인 수종의 구분을 필요로 하는 분석에서는 신뢰도가 떨어지고 있다. 그 이유는 분류관계에서 가깝게 위치하는 나무는 유사한 조직을 형성하고, 자라는 환경과 기후에 따라 동일한 나무도 목재조직에 차이를 보일 수 있기 때문이다.

이를 극복하기 위해서 다양한 수종을 현미경으로 관찰한 자료를 지속적으로 확보하고 보충하여 목재의 해부학적 수종 식별의 신뢰도를 높이려고 노력하고 있다. 또한, 최근에는 인공지능 소프트웨어를 이용하여 목재의 해부학적 관찰사진을 판독하고 수치화하여 이미 축적되어 있는 관찰사진과 비교하여 수종을 객관적으로 제시하는 자동화 분석방법의 도입이 시도되고 있다. 그러나 상기 개선 방법으로도 앞서 제기한 모든 문제를 해결할 수 없어 완벽한 수종 감정의 결과를 얻을 수 없으며, 이는 목재의 해부학적 수종 감정 방법이 가진 근본적인 한계라고 할 수 있다.

이러한 한계를 극복하고 보완하기 위해서는 해부학적 수종 감정 방법과 더불어 새로운 수종 감정 방법을 병행하는 것이 필요하다. 새로운 수종 감정 방법으로는 목재의 유전자를 분석하여 수종을 분석하는 분자생물학적 방법을 이용하는 것이 바람직하다.

목재의 유전자를 분석하는 방법은 나무가 생장하는 기후, 환경, 수령, 나무의 부위에 따라 유전자가 변하지 않으므로 나무의 종 식별에는 가장 정확한 방법이다. 그러나 이 방법은 죽은 나무조직인 목재로부터 분석 가능한 형태의 유전자를 분리해야 하고, 분석하고자 하는 나무의 종을 식별하기에 용이한 지표 유전자를 알고 있어야 하며, 식별에 활용되는 유전자의 데이터베이스가 광범위한 수종을 대상으로 확립되어 있어야 하는 한다는 문제점이 있다.

식물의 DNA를 분리하는 방법에는 식물세포에 CTAB(cetyl trimethyl ammonium bromide) 버퍼를 처리하여 DNA 및 RNA를 분리하는 방법과 이를 상업용으로 개발시킨 키트를 이용하는 방법이 있다. 하지만 상기 방법만을 이용하여 목재의 DNA를 분리하는 경우 목재의 부위에 따라 DNA 분리 정도가 달라지기 때문에 유전자 증폭을 위한 안정적인 DNA의 분리가 어렵다. 또한, 목재의 저장 기간 및 저장 환경은 DNA의 보존 상태, PCR에 의해 증폭될 수 있는 PCR 산물의 길이, PCR 성공 횟수에 영향을 미친다고 알려져 있다(비특허문헌 1 및 2). 따라서, 기존에 알려진 방법 이외에 목재의 상태에 관계없이 안정적으로 DNA를 분리하는 방법, 예를 들어 고목재 또는 가공된 목재로부터 DNA를 분리하는 방법이 필요한 실정이다.

1. Proceeding of the Royal Society of London B. 2002. 269:1039-1046 2. Plant Molecular Biology. 2006. 24:45-55

본 발명은 목재 DNA 분리 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양상은 하기 단계를 포함하는 목재 DNA 분리 방법을 제공한다:

(a) 목재를 사포로 갈아내어 목분을 수득하는 단계; 및

(b) 상기 목분에서 DNA를 분리하는 단계.

본 명세서에서 용어, '목재'는 수목의 성장에 따라 형성층이 분열증식하여 형성층의 안쪽으로 형성되는 목질 부분을 말하며, 목질화된 여러 겹의 죽은 세포로 이루어져 있다. 목질화한 부분은 뿌리, 줄기, 가지 등 나무의 대부분을 구성하고 있으며, 죽은 세포이기 때문에 건조하고 단단하다.

본 명세서에서 용어, '목분'은 목재를 분쇄할 때 발생하는 목재 분말을 의미하며, 목분을 제조할 때에는 일반적으로 액체 질소를 이용하여 목재를 냉동시킨 후 막자사발을 이용하여 분말화하는 방법, 기계적으로 분말화하는 방법 등이 이용된다. 그러나 상기 방법은 각각의 식물마다 막자사발 및 기계를 소독해야 하고, 각 식물에 대해 표준화된 전처리를 할 수 없다는 단점이 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 (a)의 목분은 목재의 표면을 사포로 갈아내어 제조할 수 있으며, 60 내지 400 그릿(grit) 사이즈의 사포를 이용할 수 있다. 사포 표면의 거칠기는 그릿(grit) 사이즈로 구분되며, 그릿 사이즈가 낮을수록 입자의 크기가 거칠고, 그릿 사이즈가 높을수록 즉 그릿 숫자가 클수록 입자의 거칠기가 비교적 낮다. 상기 사포는 목재의 표면을 갈아내어 목재를 식물세포 크기로 분쇄하는 역할을 하며, 사포의 그릿 사이즈가 60 이하인 경우 목분의 크기가 일반적인 식물세포의 크기보다 크기 때문에 식물세포의 파괴가 충분히 일어날 수 없고, 결과적으로 DNA 분리 효율이 감소할 수 있다. 또한, 상기 사포는 사용 전에 멸균한 후 이용할 수 있으며, 멸균한 사포를 이용함으로써 시료의 오염을 최소화할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 목재 DNA 분리 방법은 상기 (a) 단계 이후 목분을 용매에 수화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 수화시키는 단계는 오랫동안 건조된 세포벽으로부터 DNA가 분리되도록 하는 단계이며, 목재는 벌채된 이후부터 건조가 시작되기 때문에 목재 DNA의 분리를 용이하게 하는 단계이다. 용매는 3차 증류수 또는 세포 용해 버퍼(lysis buffer)를 이용할 수 있으며, 세포 용해 버퍼는 식물세포의 세포벽 및 세포막을 파괴하는 역할을 한다.

또한, 상기 수화시키는 단계는 24시간 내지 120시간 동안 이루어질 수 있다. 수화시간이 24시간 이상인 경우 DNA 분리 효율이 감소할 수 있고, 120시간 이상인 경우 시간 대비 DNA 분리 효율이 떨어질 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 (b)에서 DNA를 분리하는 단계는 당업계에 알려진 통상의 방법, 예를 들어 식물세포를 분쇄한 후 CTAB 버퍼를 처리하여 분리하는 방법 및 상업적으로 판매되는 키트를 이용하는 방법 등을 이용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 사포를 이용하여 목재에서 목분을 제조하고, 제조한 목분을 용매로 수화시키는 방법을 이용하여 목재 DNA를 효율적으로 분리할 수 있다.

도 1은 사포의 그릿 사이즈에 따른 목분의 크기를 현미경으로 관찰한 결과를 보여주는 사진이다.
도 2는 40 그릿 사이즈 사포로 제조한 목분에서 수화 용매 및 수화 시간의 차이에 따른 수화 정도를 보여주는 사진이다.
도 3은 60 그릿 사이즈 사포로 제조한 목분에서 수화 용매 및 수화 시간의 차이에 따른 수화 정도를 보여주는 사진이다.
도 4는 100 그릿 사이즈 사포로 제조한 목분에서 수화 용매 및 수화 시간의 차이에 따른 수화 정도를 보여주는 사진이다.
도 5는 400 그릿 사이즈 사포로 제조한 목분에서 수화 용매 및 수화 시간의 차이에 따른 수화 정도를 보여주는 사진이다.
도 6은 증류수로 수화시킨 목분에서 분리한 DNA를 이용하여 Cp-1 프라이머로 PCR을 수행한 경우 PCR 성공 횟수를 보여주는 그래프이다.
도 7은 Ap1 버퍼로 수화시킨 목분에서 분리한 DNA를 이용하여 Cp-1 프라이머로 PCR을 수행한 경우 PCR 성공 횟수를 보여주는 그래프이다.
도 8은 증류수로 수화시킨 목분에서 분리한 DNA를 이용하여 Cp-4 프라이머로 PCR을 수행한 경우 PCR 성공 횟수를 보여주는 그래프이다.
도 9는 Ap1 버퍼로 수화시킨 목분에서 분리한 DNA를 이용하여 Cp-4 프라이머로 PCR을 수행한 경우 PCR 성공 횟수를 보여주는 그래프이다.
도 10은 목분의 수화 시간 및 사포 그릿 사이즈에 따른 PCR 성공 횟수를 보여주는 그래프이다.
도 11은 NCBI 데이터베이스에 등록되어 있는 소나무, 구주적송 및 해송의 DNA 서열에서 pdest-cp1 유전자 서열을 비교한 도이다.
도 12는 소나무, 구주적송 및 해송 DNA를 이용하여 pdest-cp1 프라이머로 PCR을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.
도 13은 해송 DNA를 이용하여 pdest-cp1 프라이머로 PCR을 수행한 결과를 보여주는 사진이다.
도 14는 소나무, 구주적송 및 해송 DNA의 PCR 산물에 대한 서열분석 결과를 비교하여 보여주는 도이다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 사포 그릿 사이즈에 따른 목재의 분쇄 정도 확인

본 발명자는 조직 파쇄기(Tissue lyser)를 이용하여 목재를 분말화하는 방법, 액체질소로 동결한 후 막자사발을 이용하여 목재를 분말화하는 방법, 초음파 분쇄기(sonicator)를 이용한 목재의 분쇄방법 등과 같이 기존에 알려져 있는 방법을 이용하여 목재를 분말화하고, 목재 DNA를 분리하고자 시도하였다. 그러나, 목재 수종을 감정하기 위해 분리한 DNA를 주형으로 PCR을 30회 이상 수행하였으나 모두 실패하였다.

따라서, 목재에서 DNA를 분리하기 위하여 사포로 목재에 있는 식물세포를 파괴할 수 있는지 확인하였다. 식물세포는 매우 단단한 세포벽으로 둘러싸여 있어 식물세포 내의 DNA를 분리하기 위해서는 DNA의 분절을 최소화하면서 세포를 파괴해야 하기 때문이다. 사포 표면의 거칠기는 그릿(grit) 사이즈로 구분되며, 그릿 사이즈가 낮을수록 입자의 크기가 거칠고, 그릿 사이즈가 높을수록 즉 그릿 숫자가 클수록 입자의 거칠기가 비교적 낮다.

먼저 7.5x9 ㎝ 크기의 사포(40, 50, 60, 80, 100, 220, 400, 600, 800, 1000, 1200 및 1500 그릿)를 알루미늄 호일로 포장하여 121℃에서 20분 동안 습윤 멸균하고, 하루 동안 건조시켰다. 다음으로 리기다 소나무 변재 부분을 약 5x2.5x1.5 ㎝ 크기로 절단하여 목재 시편을 제작하고, 깨끗한 병에 넣은 후 121℃에서 20분 동안 습윤 멸균하였다. 오염 물질을 제거하기 위하여 멸균된 사포로 멸균한 목재 시편의 표면을 갈아(milling) 시편의 여섯면 모두에서 0.1 ㎝ 정도 표면을 제거하였다. 표면이 제거된 목재 시편의 횡단면을 멸균된 사포로 추가로 갈아 목분(wood flour)을 제조하고, 제조한 목분은 멸균한 에펜 튜브(eppendorf tube)에 모아 상온에서 보관하였다. 제조한 목분의 크기를 확인하기 위하여 광학 현미경을 이용하여 400배 배율로 목분을 관찰하였다. 목분의 크기가 식물세포 크기 이하로 형성되는 경우 식물세포의 파괴가 용이하기 때문에 DNA 분리 효율 또한 높아질 수 있다.

도 1은 서로 다른 그릿 사이즈(40, 50, 60, 80, 100, 220 및 400 그릿)의 사포를 이용하여 제조한 목분을 광학 현미경으로 관찰한 것으로, 사포의 그릿 사이즈가 커질수록 목분의 크기가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 400 그릿 이상의 사포를 이용하여 목재 시편을 갈아내는 경우 사포의 거칠기가 약하여 목분을 제조하기가 어렵고, 사포의 그릿 사이즈가 커질수록 미세한 사포가루가 탈락되어 목분과 분리하기 어려운 것을 확인할 수 있다. 또한, 60 그릿 이상의 사포로 목재를 갈아낸 경우 식물세포 크기(20 내지 100 ㎛) 이하의 목분이 형성되는 것을 알 수 있다. 도 1에 표시된 축적자는 20 ㎛ 길이를 의미한다.

실시예 2: 목분의 수화 정도에 따른 DNA 분리 여부 확인

2-1: 목재 DNA 분리

목재는 벌채된 이후부터 건조되기 시작하며, 벌채 이후 기간 및 건조 기간이 오래될수록 목재 내 세포벽에 존재하는 DNA가 분해될 뿐만 아니라 조각난 DNA가 세포벽에 흡착되어 존재할 가능성이 높아진다. 이러한 건조 현상은 목재 DNA의 분리를 어렵게 하기 때문에 목분을 용매에 침수시키는 수화(hydration) 방법을 이용하는 경우 DNA 분리 효율에 차이가 있는지 확인하였다. 수화 용매로는 3차 증류수와 용해 버퍼인 Ap1 버퍼(DNeasy Plant Mini kit, Cat. No. 69104, Qiagen, 미국)를 이용하였다.

상기 실시예 1과 같이 멸균된 사포(40, 50, 60, 80, 220 및 400 그릿)를 이용하여 목분을 제조하고, 목분 20 ㎎에 멸균된 3차 증류수 200 ㎕ 또는 Ap1 버퍼(buffer) 400 ㎕를 각각 첨가하여 4℃ 냉장고에서 1일 내지 5일 동안 방치하였다. 24시간을 주기로 볼텍싱(vortexing)하여 목분과 수화 용매(증류수 또는 Ap1 버퍼)가 충분히 혼합될 수 있도록 하였다. DNA 분리 전에 다시 볼텍싱하여 목분과 수화 용매를 충분히 섞어준 후 소량을 채취하여 현미경으로 관찰하였다.

이후 3차 증류수를 첨가한 목분 시료(이후 '3차 증류수 목분 시료'로 표기함)에는 Ap1 버퍼 600 ㎕ 및 RNase A 6 ㎕(100 ㎎/㎖)를 첨가하고, Ap1 버퍼를 첨가한 목분 시료(이후 'Ap1 버퍼 목분 시료'로 표기함)에는 RNase A 4 ㎕만 첨가하고 강하게 볼텍싱하여 용매와 목분이 충분히 섞이도록 하였다. 이후 각각의 목분 시료를 65℃에 10분 동안 방치하고, 2분 간격으로 튜브를 상하로 뒤집어 목분 시료가 잘 섞이도록 하였다. 10분 후 3차 증류수 목분 시료에는 P3 버퍼 260 ㎕, Ap1 버퍼 목분 시료에는 P3 버퍼 130 ㎕를 첨가하고 상하로 뒤집어 충분히 섞어주었다. 각각의 목분 시료는 5분 동안 얼음에 방치하고, 13,500 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 끝이 잘린 팁으로 상층액만을 취하여 QIAspin 컬럼(column)에 옮겨 담았다. 이후 제조사의 설명서에 따라 나머지 과정을 수행하여 목재 DNA를 수득하였으며, 수득한 목재 DNA는 -20℃에 냉동보관하였다.

도 2 내지 5는 수화 용매 및 수화 시간을 변화시켜 수화시킨 목분을 현미경으로 1,000배 확대하여 관찰한 사진으로, A는 증류수로 수화시킨 목분이고, B는 세포 용해 버퍼(Ap1 버퍼)로 수화시킨 목분이다. 도 2 내지 5에 표시된 축적자는 10 ㎛ 길이를 의미한다.

도 2는 40 그릿 사포로 제조하여 2 내지 5일 동안 수화시킨 목분; 도 3은 60 그릿 사포로 제조하여 2 내지 5일 동안 수화시킨 목분; 도 4는 100 그릿 사포로 제조하여 2 내지 5일 동안 수화시킨 목분; 및 도 5는 400 그릿 사포로 제조하여 2 내지 5일 동안 수화시킨 목분을 관찰한 사진이다.

현미경 관찰 결과를 종합하면 60 그릿 이상의 사포로 분쇄한 경우 목분의 크기가 일반적인 식물세포의 크기와 비슷하거나 그보다 작은 크기로 분쇄되는 것을 알 수 있으며, 60 그릿보다 낮은 사이즈의 사포를 이용하여 제조한 목분의 경우 입자 크기가 일반적인 식물세포의 크기보다 큰 것을 확인할 수 있다. DNA를 분리하기 위해서는 세포를 최대로 파괴해야 하기 때문에 목분의 크기가 일반적인 식물세포의 크기보다 작게 만들어지는 것이 유리하며, 따라서 그릿 사이즈가 최소 60 이상인 사포를 이용하여 목분을 제조하는 것이 바람직하다.

2-2: 분리한 목재 DNA를 이용한 중합효소연쇄반응

일반적인 식물세포와 달리 목재에서 분리한 DNA의 경우 DNA의 양이 매주 적고, 그 길이가 매우 짧기 때문에 전기영동과 같은 방법으로는 DNA가 분리되었는지 확인하기 어려운 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2). 따라서 PCR을 이용하여 DNA 분리 여부를 확인하게 되며, 본 실시예에서는 상기 실시예 2-1에서 수득한 목재 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다.

프라이머는 'Development and analysis on microsatellite sequence of chloroplast DNA of Pinus koraiensis.'(The 5th International Conference on Bioinformatics and Biomedical Engineering, 2011)에 개시된 Cp-1 및 Cp-4 프라이머를 이용하였으며, 장비는 Thermal cycler (GenePro Thermal Cycler-TC-E-48D)를 사용하였다.

(서열번호 1) Cp-1 (forward primer): GCTTACACGAGCCCATATCC

(서열번호 2) Cp-1 (reverse primer): GGGATTTACAGAATCGTGGTG

(서열번호 3) Cp-4 (forward primer): CATTCAACCATACCCGCATT

(서열번호 4) Cp-4 (reverse primer): TTTACTTCAGGCCCAAGGAG

증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로스 젤(agarose gel)에 전기영동하여 PCR 결과를 확인하였다. 하기 표 1에 PCR 반응 조건을 기재하였다.

도 6은 증류수로 수화시킨 목분에서 분리한 DNA를 이용하여 Cp-1 프라이머로 PCR을 수행한 것으로, 수화시간 또는 목분을 제조한 사포의 그릿 사이즈에 따라 PCR 성공 횟수에 차이가 있는 것을 확인할 수 있다. 1일보다 2일 동안 이상 수화시킨 목분에서 PCR 성공 횟수가 2배 증가하는 것을 알 수 있으며, 4일 이상 수화시킨 목분은 PCR 성공 횟수가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 그래프의 가로축에 표시된 'PCR 성공 횟수'는 목재 DNA를 분리한 후 이를 주형으로 PCR을 수행하였을 때 PCR 산물이 확인된 횟수를 의미한다. 도 6A는 수화시간 대비 PCR 성공횟수를 보여주는 것이고, 도 6B는 목분을 제조한 사포의 그릿 사이즈에 따른 PCR 성공횟수를 보여주는 것이다.

도 7은 Ap1 버퍼로 수화시킨 목분에서 분리한 DNA를 이용하여 Cp-1 프라이머로 PCR을 수행한 결과를 보여주는 그래프로, 도 7A는 수화시간 대비 PCR 성공횟수를 보여주는 것이고, 도 7B는 목분을 제조한 사포의 그릿 사이즈에 따른 PCR 성공횟수를 보여주는 것이다.

도 8은 증류수로 수화시킨 목분에서 분리한 DNA를 이용하여 Cp-4 프라이머로 PCR을 수행한 결과를 보여주는 그래프로, 3일 또는 4일 동안 수화시킨 목분의 PCR 성공 횟수가 높은 것을 알 수 있다. 도 8A는 수화시간 대비 PCR 성공횟수를 보여주는 것이고, 도 8B는 목분을 제조한 사포의 그릿 사이즈에 따른 PCR 성공횟수를 보여주는 것이다.

도 9는 Ap1 버퍼로 수화시킨 목분에서 분리한 DNA를 이용하여 Cp-4 프라이머로 PCR을 수행한 결과를 보여주는 그래프로, 상기 도 8의 결과와 유사하게 3일 또는 4일 동안 수화시킨 목분의 PCR 성공 횟수가 높은 것을 알 수 있다. 도 9A는 수화시간 대비 PCR 성공횟수를 보여주는 것이고, 도 9B는 목분을 제조한 사포의 그릿 사이즈에 따른 PCR 성공횟수를 보여주는 것이다.

도 10은 수화 시간(도 10A) 및 사포 그릿 사이즈(도 10B)에 따른 PCR 성공 횟수를 보여주는 그래프로, 2 내지 4일 동안 수화시킨 목분이 PCR 성공 횟수가 높고, 5일이 되면서 점차적으로 PCR 성공 횟수가 감소하는 것을 확인할 수 있다. 따라서, 목분의 수화 기간은 DNA의 안정성 및 시간의 효율성을 고려할 때 2일로 하는 것이 바람직하다. 또한, 같은 프라이머로 PCR을 수행한 도 6A 및 7A를 비교할 때 수화 용매로 증류수를 이용한 경우 PCR 성공 횟수가 높기 때문에 수화 용매로는 증류수를 사용하는 것이 유리함을 알 수 있다.

2-3: 목재 DNA 분리 방법의 표준화

상기 실시예 2-1 및 2-2의 결과를 바탕으로 표준화된 목재 DNA 분리 방법을 확립하였으며, 사포 및 증류수 이외의 버퍼 및 컬럼은 DNeasy Plant Mini kit(Qiagen)에 포함된 것을 이용하였다.

<시료 준비(전처리) 방법>

멸균한 사포를 이용하여 멸균된 목재 시편의 여섯 면에서 표면을 두께 약 0.1 ㎝ 정도 제거하고, 사용한 사포 및 시료를 모두 버린다. 이후 70% 에탄올을 이용하여 실험대의 불순물을 제거하고, 멸균된 새로운 사포로 목재 시편을 횡단면 방향으로 갈아 목분을 제조한다. 제조한 목분은 1.5 ㎖ 에펜 튜브에 20 ㎎씩 소분하고, 수화를 위해 멸균된 3차 증류수 200 ㎕를 첨가하여 볼텍싱한다. 에펜 튜브를 4℃ 냉장고에 2일 동안 방치하여 목분을 수화시키고, 목분과 증류수가 충분히 혼합될 수 있도록 24시간 주기로 볼텍싱한다.

<DNA 분리 방법>

수화 단계가 끝나면 목분에 Ap1 버퍼 600 ㎕ 및 RNase A 6 ㎕(100 ㎎/㎖)를 첨가하고, 목분과 버퍼가 충분히 섞일 수 있도록 강하게 볼텍싱한다. 65℃에서 10분 동안 목분을 용해시키면서 2분 간격으로 에펜 튜브를 꺼내 상하로 뒤집으며 목분과 버퍼를 섞어준다. 10분 후에 P3 버퍼 260 ㎕를 첨가하고, 에펜 튜브를 상하로 뒤집어 충분히 섞어준 후, 5분 동안 얼음에 방치한다. 5분 후 13,500 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 끝을 자른 팁을 이용하여 상층액만 취하여 QIAspin 컬럼에 옮겨 담은 후 13,500 rpm에서 2분 동안 다시 원심분리한다. 원심분리 후 컬렉션 튜브(collection tube)에 모인 용액은 새로운 에펜 튜브(#1)에 옮겨 담고, 상기 과정을 반복하여 컬렉션 튜브에 모인 용액은 다른 새로운 에펜 튜브(#2)에 옮겨 담는다. 수득한 용액의 1.5배 부피의 AW1 버퍼를 각각의 에펜 튜브(#1 및 #2)에 첨가하여 끝이 잘린 팁으로 바로 피펫팅(pipetting)을 하고, 650 ㎕를 취하여 DNeasy 미니 스핀 컬럼(Mini spin column)에 옮겨 담아 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한다. 흘러 내려온 용액은 버리고, 에펜 튜브에 남아 있는 나머지 용액을 컬럼에 넣은 후 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한다. 에펜 튜브 #1 및 #2에 들어 있는 모든 용액을 하나의 DNeasy 미니 스핀 컬럼에 옮겨 담은 후 원심분리하는 과정을 반복한다. 미니 스핀 컬럼에 새로운 컬렉션 튜브(collection tube)를 장착한 후 미니 스핀 컬럼에 AW2 버퍼 500 ㎕를 넣어 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리한다. 흘러 내려온 용액은 버리고 컬렉션 튜브를 다시 장착한 후, AW2 버퍼 500 ㎕를 다시 넣어 13,500 rpm에서 2분 동안 원심분리한다. 흘러 내려온 용액과 컬렉션 튜브는 버리고, 새로운 에펜 튜브를 장착한 후 킴테크를 덮은 상태로 상온에서 미니 스핀 컬럼을 40분 동안 건조시킨다. 40분 후에 AE 버퍼 50 ㎕를 컬럼 중앙에 직접적으로 분지하여 5분 동안 방치하고, 8,000 rpm에서 1분 동안 원심분리하여 DNA를 용출(elution)시킨다. 수득한 DNA는 -20℃에서 냉동보관한다.

실시예 3: 목재 DNA를 이용한 수종 판별 가능성 확인

상기 실시예 2-3에서 표준화한 방법을 이용하여 소나무, 구주적송 및 해송(한국임업진흥원에서 제공받음)으로부터 DNA를 분리하고, 유전자 분석으로 수종을 구분할 수 있는지 확인하기 위하여 상기 분리한 DNA를 주형으로 PCR을 실시한 후 서열분석(sequencing)을 수행하였다. PCR 프라이머는 대한민국 공개특허 제10-2014-0057707호에 개시된 pdest-cp1 프라이머를 이용하였으며, PCR 산물의 예상 크기는 285 bp이다.

(서열번호 5) pdest-cp1 (forward primer): GACTCTCGCCGTATGAAAGC

(서열번호 6) pdest-cp1 (reverse primer): AACGAGGTGCTCTACCTTGC

PCR 조건은 하기 표 2에 기재하였다.

도 11은 미국 국립 생물공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 데이터베이스에 등록되어 있는 소나무, 구주적송 및 해송의 DNA에서 pdest-cp1 유전자 서열을 비교한 결과이다. 소나무와 구주적송은 84번째 염기에 차이가 있어 구별이 가능하지만, 소나무와 해송은 염기가 동일하여 구분이 불가능할 것으로 예상된다.

도 12는 pdest-cp1 프라이머를 이용한 PCR 산물을 전기영동으로 확인한 것으로, 약 28 0bp 크기의 PCR 밴드(band)를 확인하여 목재 DNA가 증폭된 것을 알 수 있다. 해송 DNA의 경우 어닐링(annealing) 온도 60℃에서 증폭이 이루어지지 않아 어닐링 온도를 59℃로 낮추어 다시 PCR을 수행하였다.

도 13은 해송 DNA를 주형으로 하여 어닐링 온도 59℃에서 PCR 후 전기영동으로 확인한 결과로 약 280 bp 크기의 PCR 밴드를 확인할 수 있다.

상기 PCR 산물들에 대하여 ㈜바이오팩트(대전, 대한민국)에 서열분석을 의뢰하였고, 분석 결과 나온 서열을 NCBI에서 검색하였다.

소나무 PCR 산물에 대한 서열분석의 경우 표 3에 나타난 것과 같이 Pinus densiflora (소나무)와 Query cover 99% 및 identity 100%의 결과를 확인할 수 있었다. 또한, NCBI에 등록되어 있는 소나무와 본 발명의 소나무에 대하여 DNA 염기서열을 비교(alignment)한 결과 모든 염기서열이 일치하는 것을 알 수 있었다.

구주적송 PCR 산물에 대한 서열분석의 경우 표 4에 나타난 것과 같이 Pinus sylvestris(구주적송)과 Query cover 99% 및 identity 99%의 결과를 확인할 수 있었다.

해송 PCR 산물에 대한 서열분석의 경우 표 5에 나타난 것과 같이 Pinus thunbergii(해송)과 Query cover 100% 및 identity 100%의 결과를 확인할 수 있었다.

도 14는 PCR 산물의 서열분석 결과를 서로 비교한 것으로, 예상한 것과 같이 소나무와 해송의 서열은 100% 일치하지만 소나무와 구주적송은 84번째 염기에 차이가 있는 것을 알 수 있다.

실시예 3의 PCR 및 서열분석 결과를 통하여 본 발명의 일 실시예에 개시된 DNA 분리 방법을 이용하면 목재 DNA를 분리할 수 있고, 분리된 DNA는 PCR 증폭이 용이하여 목재 수종 감정에 유용하게 이용될 수 있음을 알 수 있다. 또한, 목재의 일부분을 목분으로 제조하기 때문에 하나의 목재에서 독립적으로 2회 이상 DNA를 분리하고, 수종 감정을 수행할 수 있는 장점이 있음을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> KOOKMIN UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION REPUBLIC OF KOREA (KOREA FORESTRY PROMOTION INSTITUTE) <120> Method for Isolating Genomic DNA from Wood Flour using Sandpaper <130> PN170084 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 1 gcttacacga gcccatatcc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 2 gggatttaca gaatcgtggt g 21 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 3 cattcaacca tacccgcatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 4 tttacttcag gcccaaggag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 5 gactctcgcc gtatgaaagc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic polynucleotide <400> 6 aacgaggtgc tctaccttgc 20

Claims (5)

1. 목재 DNA 분리 방법에 있어서,
   (a) 목재를 사포로 갈아내어 목분을 수득하는 단계;
   (b) 상기 목분을 용매에 수화시키는 단계; 및
   (c) 수화시킨 목분에서 DNA를 분리하는 단계
   를 포함하고,
   상기 사포는 220 그릿(grit)이고,
   상기 용매는 증류수이고,
   상기 DNA는 목재 수종 감정에 사용되는 것이고,
   상기 목재는 소나무과의 목재이고,
   상기 소나무과의 목재는 소나무, 구주적송 및 해송이고,
   상기 수화시키는 단계는 4℃에서 48시간 동안 수행되는 것인
   목재 DNA 분리 방법.
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