CN101914525B - 一种提取连翘叶片dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及提取连翘叶片DNA的方法，有效克服连翘DNA含有蛋白、条带弥散，A260/280＝1.38，消除连翘叶片内的酚类、鞣质等杂质的问题，方法是，连翘叶片在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，将粉末转入离心管中，加提取缓冲液，混匀，冰浴，离心，弃去上清液，加入2×CTAB和β-巯基乙醇，混匀，水浴，离心，上清液置离心管中，加入氯仿和异戊醇的混合溶液，轻轻颠倒离心管，混匀，离心，重复此操作，至上清液液面无白色沉淀为止；把上清液置入离心管中，加入异丙醇，静置过夜；离心，收集沉淀，用乙醇漂洗沉淀，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；风干物用缓冲液溶解，加入RNase，混匀，温浴，即得，本发明有效用于提取连翘叶片DNA，纯度高，效率高。
Description
一、技术领域
本发明涉及医药，特别是一种提取连翘叶片DNA的方法。
二、背景技术
连翘(Forsythia suspensa(Thunb.)Vah1)为木犀科(Oleaceae)连翘属(Forsythia)多年生落叶灌木，果实初熟尚带绿色时采收称为青翘，果实熟透颜色发黄时采收称为老翘，具有清热解毒、消肿散结之功效。
随着分子生物学的发展，目前DNA标记技术已经渗透到中药的各个领域，而DNA提取技术是分子标记技术的关键。连翘叶片内含有较多的酚类、鞣质类物质，这些次生代谢物的存在严重影响了DNA的纯度，进而影响到其后续的DNA扩增工作。因而连翘DNA的提取是分子标记技术应用其研究中的重中之重。
电泳检测表明经典的CTAB法提取出来的DNA含有少量的蛋白，并且DNA条带弥散，A260/280＝1.38，所提取DNA中因纯度低，连翘叶片内含有过多的酚类、鞣质等杂质，对其后续分子标记技术的研究造成很大的影响，因此很有必要对连翘DNA提取方法进行改进。
三、发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一种提取连翘叶片DNA的方法，可有效克服连翘DNA的含有少量的蛋白，并且DNA条带弥散，A260/280＝1.38，并消除连翘叶片内过多的酚类、鞣质等杂质对连翘DNA影响造成的纯度低问题。
本发明解决的技术方案是，以连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末(必要时，在加液氮之前，可先在研钵中加入0.05gPVP)，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入0-4℃预冷的提取缓冲液I，提取缓冲液I加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6-10倍，(所说的重量体积为连翘幼嫩叶片以重量g计，提取缓冲液I以体积ml计，以下同)，连翘幼嫩叶片加液氮迅速研磨成的粉末与提取缓冲液I混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，得离心后的沉淀物，沉淀物中加入提取缓冲液II，提取缓冲液II加入量为原连翘幼嫩叶片重量体积的6倍，沉淀物与提取缓冲液II混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，立即加入预热的2×CTAB和β-巯基乙醇，2×CTAB加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6-10倍，β-巯基乙醇加入量为每0.5g连翘幼嫩叶片原材料加入60-120μL，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次；水浴后，4℃下离心10min；取上清液置灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇的混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24∶1，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下离心10min，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置过夜(8-12小时)；4℃下离心5min，收集沉淀，弃去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀2-3次，每次用量为连翘幼嫩叶片原材料重量体积的2倍，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；每0.5g连翘幼嫩叶片原材料制得的风干物用50-60μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL 5-10mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA；
所说的提取缓冲液I是由0.25mol/L Tris-HCl、50mmol/L EDTA、0.25mol/LNaCl和余量为水混合均匀制成；所说的提取缓冲液II是由100mmol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.025mol/L Na2B4O7和余量为水混合均匀制成。
本发明有效用于提取连翘叶片DNA，提出物纯度高，效率高，有效克服了电泳检测表明经典的CTAB法提取出来的DNA含有少量的蛋白，并且DNA条带弥散，A260/280＝1.38，所提取DNA纯度较低的问题，有效保证了对其后续分子标记技术的研究创造了良好的技术条件，是提取连翘叶片DNA的方法的一大创造。
四、具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
实施例1
本发明在实施中，具体可由以下步骤实现：
取0.5g连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入0-4℃预冷的提取缓冲液I 3-5mL，混匀，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min离心10min，弃去上清液，再加入提取缓冲液II 3ml，混匀，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min离心10min，弃去上清液，立即加入3-5mL 65℃预热的2×CTAB和60-120μL β-巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次；温浴后，4℃下10000r/min离心10min；取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24∶1，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下12000r/min离心10min，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置(8-12小时)过夜；4℃下8000r/min离心5min，弃去上清液，收集沉淀物，沉淀物用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀物2次或3次，每次1mL，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；风干物用50-60μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL5-10mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA。
实施例2
①称取0.5g连翘嫩叶片，在研钵中加入液氮迅速研磨成粉末(必要时，在加液氮之前，可先在研钵中加入0.05gPVP)；
②将粉末材料转入5mL的灭菌离心管中，加入4℃遇冷的提取缓冲液I(0.25mol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl)3-5mL，混匀，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min离心10min，倾去上清液，再加入提取缓冲液II(100mmol/L Tris-HCl，20mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.025mol/L Na2B4O7)3ml，混匀，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min离心10min，倾去上清液，立即加入3mL 65℃预热的2×CTAB和60μL β-巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次)。
③温浴后，4℃下10000r/min离心10min。
④取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇V/V＝(24/1)，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下12000r/min离心10min，重复此操作，至两液面无白色沉淀为止。
⑤把上清液转移到5mL的灭菌离心管中，加入2/3倍体积并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置过夜。
⑥4℃下8000r/min离心5min，收集沉淀。倾去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀3次每次1mL，将离心管倒置在吸水纸上，风干。
⑦沉淀用50μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL 10mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴30min，-20℃中保存备用。
实施例3
①称取0.5g连翘嫩叶片，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末。
②将粉末材料转入5mL的灭菌离心管中，加入4mL 65℃预热的2×CTAB和60μL β-巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次。
③温浴后，4℃下10000r/min离心10min。
④取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇V/V＝(24/1)，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下12000r/min离心10min，重复此操作，至两液面无白色沉淀为止。
⑤把上清液转移到5mL的灭菌离心管中，加入2/3倍体积并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置过夜。
⑥4℃下8000r/min离心5min，收集沉淀。倾去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀2次每次1mL，将离心管倒置在吸水纸上，风干。
⑦沉淀用60μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL5mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴20min，-20℃中保存备用。
实施例4
①称取0.5g连翘嫩叶片，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末。
②将粉末材料转入5mL的灭菌离心管中，加入0℃遇冷的提取缓冲液4mL，混匀，冰浴10min，4℃下10000r/min离心10min，倾去上清液，立即加入5mL 65℃预热的2×CTAB和80μL β-巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次。
③温浴后，4℃下10000r/min离心10min。
④取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇V/V＝(24/1)，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下12000r/min离心10min，重复此操作，至两液面无白色沉淀为止。
⑤把上清液转移到5mL的灭菌离心管中，加入2/3倍体积并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置过夜。
⑥4℃下8000r/min离心5min，收集沉淀。倾去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀2次每次1mL，将离心管倒置在吸水纸上，风干。
⑦沉淀用55μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL6mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴20min，-20℃中保存备用。
本发明方法稳定可靠，提取的连翘总DNA纯度高，经先后10次试验，均取得了相同和相似的结果，并经检测，本发明提出的连翘总DNA与经典CTAB法提出来的DNA相比基本上没有蛋白，A260/280＝1.81，而经典CTAB法提取出来的DNA含有少量的蛋白，并且DNA条带弥散，A260/280＝1.38，说明本发明方法提取出来的DNA纯度较高，有效解决了长期以来科研人员未能解决的制备连翘DNA纯度低的技术难题，经济和社会效益巨大。
Claims (2)
1.一种提取连翘叶片DNA的方法，其特征在于：以连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入0-4℃预冷的提取缓冲液I，提取缓冲液I加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6-10倍，连翘幼嫩叶片加液氮迅速研磨成的粉末与提取缓冲液I混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，得离心后的沉淀物，沉淀物中加入提取缓冲液II，提取缓冲液II加入量为原连翘幼嫩叶片重量体积的6倍，沉淀物与提取缓冲液II混匀，冰浴10min，4℃下离心10min，弃去上清液，立即加入预热的2×CTAB和β-巯基乙醇，2×CTAB加入量为连翘幼嫩叶片重量体积的6-10倍，β-巯基乙醇加入量为每0.5g连翘幼嫩叶片原材料加入60-120μL，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次；温浴后，4℃下离心10min；取上清液置灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24∶1，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下离心10min，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置过夜；4℃下离心5min，收集沉淀，弃去上清液，用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀2-3次，每次用量为连翘幼嫩叶片原材料重量体积的2倍，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；每0.5g连翘幼嫩叶片原材料制得的风干物用50-60μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL5-10mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA；
所说的提取缓冲液I是由0.25mol/L Tris-HCl、50mmol/L EDTA、0.25mol/LNaCl和余量为水混合均匀制成；所说的提取缓冲液II是由100mmol/LTris-HCl，20mmol/L EDTA，0.25mol/L NaCl，0.025mol/L Na2B4O7和余量为水混合均匀制成。
2.根据权利要求1所述的提取连翘叶片DNA的方法，其特征在于：取0.5g连翘幼嫩叶片为材料，在研钵中加液氮迅速研磨成粉末，之后将粉末转入灭菌离心管中，加入0-4℃预冷的提取缓冲液I 3-5mL，混匀，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min离心10min，弃去上清液，再加入提取缓冲液II 3ml，混匀，冰浴10min，4℃下6000-10000r/min离心10min，弃去上清液，立即加入3-5mL65℃预热的2×CTAB和60-120μL β-巯基乙醇，充分混匀，在65℃水浴中保温4h期间每隔0.5h轻轻摇动离心管一次；温浴后，4℃下10000r/min离心10min；取上清液至5mL的灭菌离心管中，加入与上清液等体积的氯仿和异戊醇混合溶液，其混合溶液的配比是氯仿和异戊醇体积比24∶1，轻轻颠倒离心管，混匀，4℃下12000r/min离心10min，重复此操作，至上清液与氯仿和异戊醇混合溶液的液面无白色沉淀为止；把上清液转移到灭菌离心管中，加入2/3倍量上清液体积、并于-20℃预冷的异丙醇，轻轻晃动，于-20℃静置8-12小时过夜；4℃下8000r/min离心5min，弃去上清液，收集沉淀物，沉淀物用75％(V/V)的乙醇漂洗沉淀物2次或3次，每次1mL，将离心管倒置在吸水纸上，风干，得风干物；风干物用50-60μLTE缓冲液溶解，并加入0.5μL 5-10mg/mLRNase，轻轻混匀，于37℃水浴中温浴30min，即得到高质量的可直接用于PCR扩增的连翘叶片基因组DNA。
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