CN106754872A - 一种从杨树木材中提取微生物基因组dna的方法 - Google Patents

一种从杨树木材中提取微生物基因组dna的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，该方法将CTAB法和SDS法进行了结合，并优化各步骤技术参数，使得本方法提取得到的基因组DNA具有浓度高、无污染的优点，用分光光度计测定OD260/OD230、OD260/OD280值接近于标准值，完全能满足后期采用16S rDNA/ITS测序及宏基因组测序(Metagenomics)的要求，可直接应用于分子操作。

Description

一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，特别涉及应用于分子测序技术中的一种从杨树木材(分为湿心材和健康边材)中提取微生物基因组DNA的方法。
背景技术
杨树是我国重要的速生用材树种之一。第七次全国森林资源清查数据显示，我国杨树林总面积已达1010.26万hm2，其中人工林为757.23万hm2，占全国人工乔木林总面积的18.9％，栽培面积居世界首位。但湿心材现象发生十分严重，给杨木加工利用带来不利影响。据在湖北省嘉鱼县的调查，9个杨树品种的病株率都达100％，胸径处变色直径占胸径的31.38％～64.35％，变色面积达5.49％～42.31％，成年大树变色比率可达50％以上。湿心材(Wetwood)是一种世界性病害，其典型病状是活立木髓心及中央木质部呈水浸状，木材呈现褐色至红褐色，是树木生长中的一种反常现象。湿心材表现出含水率高、颜色深、抽提物多以及pH值偏酸或偏碱性，木材物理与化学性质(例如木材密度、弦向干缩系数、抗弯强度、抗弯弹性模量、离子含量等)发生变化等特点。由于湿心材干燥时易皱缩、开裂，刨削难，木材变色，且呈碱性的湿心材很难用脲醛树脂胶合，直接影响干燥、制材和胶合板质量，导致商品价值大幅下降。作为纸浆材时，还直接影响出浆率与印刷光泽度。因此，湿心材是木材加工利用中的一大难题，造成巨大的经济损失，但目前生产上缺乏有效的防治措施。
病原微生物在湿心材的形成过程中起着非常重要的作用，这是目前被普遍接受的一种观点。然而，这些病原微生物包括哪些种类，哪些微生物在其中起主导作用目前还不清楚。长期以来，由于研究手段的制约导致杨树湿心材研究进展相对缓慢。以往的研究几乎都是采用传统的组织分离培养法分离病原菌，而该方法本身存在一定不足。例如，湿心材中的气体以CH4、N2、CO2等为主，不含O2或极少O2，所以湿心材中主要应为兼性或专性厌氧微生物；分离和培养专性厌氧菌的方法不同于分离培养需氧菌、兼厌氧性菌及真菌的方法；有许多微生物的生长条件是不确定的，易受到培养基与培养条件选择性的限制，而且菌株之间存在相互竞争，部分微生物是存活的但不可培养，因而通过组织培养法对微生物进行分离培养，进而鉴定就有较大的局限性。
目前并没有从木材中直接提取微生物基因组DNA的方法。现有的提取微生物基因组DNA的样品主要包括土壤样品、植物组织样品、可培养的微生物样品等，方法主要有试剂盒法、酶解法、化学或者热裂解法、磁珠或超声波机械破壁，又或者是上述几种方法的结合。采用这些方法提取木材中微生物的基因组DNA，得到的DNA均浓度很低，且大多污染严重，不能满足后期采用16S rDNA/ITS测序及宏基因组(Metagenomics)测序的要求。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种从杨树木材(分为湿心材和健康边材)中提取微生物基因组DNA的方法，以满足16S rDNA/ITS测序及宏基因组(Metagenomics)测序等分子测序技术对于基因组DNA的高质量要求。
为了实现本发明目的，发明人通过大量试验研究并不懈探索，最终获得了如下技术方案：一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，该方法包含下述步骤：
(1)收集杨树湿心材或健康边材样本，经液氮研磨后加入活性炭及提取缓冲液，再加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠，混匀；所述的提取缓冲液包含下列组分：1％CTAB+2％PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE pH8.0+0.1M磷酸钠缓冲液pH8.0，蛋白酶K浓度为20mg/ml，十二烷基硫酸钠的质量浓度为10％；
(2)放入58～62℃水浴1.5～3h，期间颠倒混匀3～4次，然后进行第一次离心，转移第一次离心后的上层水相；
(3)向所述第一次离心后的水相中加入PEG6000，混匀静置后进行第二次离心，去掉第二次离心后的上层水相；
(4)向所述第二次离心后的沉淀中加入TE和醋酸钾，混匀静置后进行第三次离心，转移第三次离心后的上层水相；
(5)向所述第三次离心后的水相中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶液，混匀静置后进行第四次离心，转移第四次离心后的上层水相；苯酚-氯仿-异戊醇溶液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；
(6)向所述第四次离心后的上层水相中加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，混匀室温静置0.5-1.5h后进行第五次离心，收集沉淀；
(7)向所述第五次离心后收集到的沉淀先后采用75％酒精、无水酒精洗涤，然后进行第六次离心得到DNA沉淀，使用TE溶解DNA沉淀，再加入RNase A，水浴后得到所提取的微生物基因组DNA。
需要说明的是，步骤(3)中采用PEG6000在不同的盐溶液中可以结合形成孔径不同的网状结构，DNA和其他杂质分子在PEG6000中的沉降系数不同的原理，通过高速离心，使沉降系数较高的DNA沉淀下来，而其他杂质分子被网状结构阻隔，从而纯化DNA。步骤(5)中苯酚使蛋白质变性，同时抑制了DNase的降解作用；氯仿可加速有机相与液相的分层。在抽提DNA的过程中，为了混合均匀，通常进行剧烈震荡，此时会在混合液内产生大量气泡，而异戊醇的作用是降低分子表面张力，因而能在提取过程中减少气泡的产生。
优选地，如上所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其中步骤(2)中所述的第一次离心是在12000rpm、4℃下进行，离心时间为15～25min。
优选地，如上所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其中步骤(3)中向所述第一次离心后的水相中加入1/2体积的PEG6000。
优选地，如上所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其中步骤(3)中第二次离心是在12000rpm、4℃下进行，离心时间为4～6min。
优选地，如上所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其中步骤(4)中TE缓冲液包含下列组份：10mM Tris-HCl和1mM乙二胺四乙酸，醋酸钾的浓度为5M。钾离子置换SDS的钠离子，形成不溶于水的PDS，将大量蛋白同步沉淀下来。
优选地，如上所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其中步骤(4)中第三次离心和步骤(5)中第四次离心均是在12000rpm、4℃下进行，离心时间为12～18min。
优选地，如上所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其中步骤(6)中第五次离心和步骤(7)中第六次离心是在10000rpm、4℃下进行，离心时间为8～12min。
优选地，如上所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其中步骤(7)中是在37℃下水浴，时间为10～20min。
与现有技术相比，本发明涉及的从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法具有如下优点和进步性：
(1)将CTAB法和SDS法进行了结合，优点在于先使用提取缓冲液来裂解微生物细胞壁，再用活性炭来吸附多糖多酚类物质，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使糖类酚类物质容易去除。
(2)在将CTAB法和SDS法进行了结合的过程中，最大程度地裂解微生物细胞壁，释放核酸并且最低程度地减少对基因组DNA的降解和破坏，避免了DNA总量的损耗。对微生物细胞壁的裂解完全、对菌种类型没有特异性要求，使得本方法提取得到的基因组DNA具有浓度高、无污染的优点，用分光光度计测定OD260/OD230、OD260/OD280值接近于标准值，完全能满足后期采用16S rDNA/ITS测序及宏基因组测序(Metagenomics)的要求。
(3)适用于样本菌体为所有微生物种类的杨树木材。一般来说，革兰氏阳性菌或真菌较难破壁，革兰氏阴性菌的细胞壁厚约2～3nm，而革兰氏阳性菌细胞壁厚约20～80nm，真菌的细胞壁厚度高达100～250nm，因此革兰氏阳性菌和真菌的基因组提取在困难程度上较高，而本发明所提供的基因组DNA的提取方法，由于结合了SDS和CTAB法的优点，增大了提取过程中对细菌细胞壁的裂解能力和裂解程度，可成功地对革兰氏阳性菌或真菌完成基因组DNA提取，并获得高浓度、高质量的基因组。
(4)本发明有助于避开杨树湿心材研究中微生物的组织分离培养与鉴定，通过直接提取木材样品中微生物的基因组DNA，采用16S rDNA/ITS测序及宏基因组(Metagenomics)测序等分子测序技术开展研究。
附图说明
图1为实施例1和对比试验例1～例7提取到的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳的结果图。其中，M为λ/HindIII DNA Marker(23Kb)，泳道号中“1”指实施例1，“2”～“8”指对比例1～例7，“-1”、“-2”、“-3”指三个重复；(a)湿心材样品；(b)健康边材样品。
图2为实施例1和对比试验例1～例7提取到的基因组DNA经PCR后进行琼脂糖凝胶电泳的结果图。其中，M为Marker1(600bp)，泳道号中“1”指实施例1，“2”～“8”指对比例1～例7，“-1”、“-2”、“-3”指三个重复，H2O为阴性对照；(a)湿心材样品中微生物DNA的16S V3-V4区；(b)健康边材样品中微生物DNA的16S V3-V4区；(c)湿心材样品中微生物DNA的16S V4区；(d)健康边材样品中微生物DNA的16S V4区；(e)湿心材样品中微生物DNA的16S V4-V5区；(f)健康边材样品中微生物DNA的16S V4-V5区；(g)湿心材样品中微生物DNA的ITS1区；(h)健康边材样品中微生物DNA的ITS1区；(i)湿心材样品中微生物DNA的ITS2区；(j)健康边材样品中微生物DNA的ITS2区。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方案。
实施例1
以下采用本发明所提供的方法分别对杨树湿心材、健康边材样品提取微生物基因组DNA，每个处理3次重复。
实验操作：
1.提取缓冲液、TE缓冲液的制备：
提取缓冲液：1％CTAB+2％PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE pH8.0+0.1M磷酸钠缓冲液pH8.0，高压灭菌。
TE缓冲液：10mM Tris-HCl和1mM EDTA。
2.提取步骤
(1)用液氮研磨样品。
(2)取1g研磨后的湿心材或健康边材样品，加入0.6g活性炭，加入5mL提取缓冲液(1％CTAB+2％PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE pH8.0+0.1M磷酸钠缓冲液pH8.0)，加入75μL蛋白酶K(20mg/ml)，涡旋混匀，加入1000μL SDS(10％)，涡旋混匀。
(3)放入60℃水浴2小时，期间颠倒混匀3～4次。
(4)离心(12000rpm，20min，4℃)。
(5)取上清液于新的10ml离心管中，加入1/2体积PEG6000，室温放置1小时。
(6)离心(12000rpm，5min，4℃)。
(7)去上清，向沉淀中加入1ml TE(pH8.0)，再加入100μL醋酸钾(5M)，在4℃下放置15min。
(8)离心(10000rpm，15min，4℃)。
(9)取上清至新的2ml管中，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇25：24：1，颠倒混匀静置10min。
(10)离心(12000rpm，10min，4℃)
(11)取上清至新的1.5ml管中，加入0.7倍体积的异丙醇，室温静置1小时。
(12)离心(10000rmp，10min，4℃)。
(13)去上清，向沉淀中加入1ml 75％酒精，放置1min，离心(10000rpm，10min，4℃)。
(14)去上清，向沉淀中加入1ml无水酒精，放置10min,离心(10000rpm，10min，4℃)。
(15)去上清，待酒精完全挥发后，加入50μLTE溶解DNA，再加入2μL RNaseA(10mg/ml)。
(16)在37℃下水浴15min。
(17)置于-20℃保存。
表1本发明方法提取结果
以下采用的对比试验方法均为对杨树湿心材及健康边材部位的样品分别提取微生物基因组DNA，每个处理3次重复，除对比试验例1外(严格按照试剂盒说明操作)，样品量均为1g，最后均用50μL TE溶解DNA。
对比试验例1：Power of soil kit试剂盒法
1.用液氮研磨杨树湿心材、健康边材样品(与实施例1样品同一批次)。
2.加入0.25g样品到一个PowerBead Tubes中。
3.轻轻涡旋混匀。
4.检测Solution C1。若出现沉淀，60℃水浴至全溶解。
5.加入60μl Solution C1，上下颠倒数次混匀。
6.把PowerBead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速(3200rpm，若涡旋仪达不到此速度，可适当延长5～10min)涡旋连续振荡10min(使用24头适配器同时处理12个样品，涡旋时间延长5-10min)。
7.室温10000g离心30s。
8.转移上清液至一个干净的2ml Collection Tube(试剂盒提供)中。注意：大约可获得400-500μl上清液。
9.加入250μl Solution C2到上清中，涡旋混匀5s。4℃孵育5min。
10.室温10000g离心1min。
11.避开沉淀小珠，转移上清液≤600μl到一个新的收集管中。
12.加入200μl Solution C3到上清中，涡旋混匀，4℃孵育5min。
13.室温10000g离心1min。
14.避开沉淀小珠，转移上清液≤750μl到一个新的收集管中。
15.Solution C4使用前先摇匀。加入1200μl Solution C4到上清中，涡旋混匀5s。
16.加载约675μl上清到Spin Filter中，室温10000g离心1min。弃去滤液，继续加载675μl上清，室温10000g离心1min。重复直至过滤完所有上清。注意：每个样品共需加载3次。
17.加入500μl Solution C5到Spin Filter中，室温10000g离心30s。
18.弃去上清。
19.室温10000g离心1min。
20.小心转移Spin filter到2ml Collection Tube(试剂盒提供)中，尽量避免Solution C5污染。注意：极力避免酒精冲洗液污染。
21.加入100μl Solution C6到白色滤膜中心。注意：Solution C6要加到滤膜中心，并保证整个薄膜能充分润湿。可选：无菌DNA-Free PCR Grade water货号#17000-10也可适用于DNA洗脱。若担心DNA降解，可使用无菌TE缓冲液代替C6进行洗脱。
22.室温10000g离心30s。
23.弃去Spin Filter。此时收集管中的DNA可直接用于下游实验，无需进一步纯化建议DNA冷冻保存(-20℃～-80℃)。
对比试验例2：提取土壤微生物DNA方法1
方法来自于文献：Verma D,Satyanarayana T.An improved protocol for DNAextraction from alkaline soil and sediment samples for constructingmetagenomic libraries[J].Applied biochemistry and biotechnology,2011,165(2):454-464.
1.用液氮研磨杨树湿心材、健康边材样品(与实施例1样品同一批次)。
2.取1g研磨后的样品，加入0.4g活性炭，加入2mL提取缓冲液(1％CTAB+2％PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE PH8.0+0.1M磷酸钠缓冲液pH8.0)，加入100μL RNA酶，加入20μL蛋白酶K(10mg/ml)涡旋混匀，放在37℃的摇床上温浴15min(200rpm)。
3.加入200μL SDS(10％)，涡旋混匀。放入60℃水浴2小时，期间颠倒混匀3～4次。
4.离心(12000rpm，20min，4℃)。
5.取上清液于新的10ml离心管中，加入1mL PEG8000，室温放置1小时。
6.离心(8000g，5min，4℃)。
7.去上清，向沉淀中加入1ml TE(pH8.0)，再加入100μL醋酸钾(5M)，在4℃下放置15min。
8.离心(8000g，15min，4℃)。
9.取上清至新的2ml管中，加入等体积苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)。
10.离心(8000g，15min，4℃)。
11.取上清至新的1.5ml管中，加入0.7倍体积的异丙醇，室温静置1小时。
12.离心(8000g，20min，4℃)。
13.去上清液，向沉淀中加入1ml 70％酒精，放置1min，离心(8000g，10min，4℃)去上清液，待酒精完全挥发后，加入50μLTE溶解DNA，再加入2μL RNaseA(10mg/ml)。
14.置于-20℃保存。
对比试验例3：提取土壤微生物DNA方法2
方法来自于文献：Tsai Y L,Olson B H.Rapid method for direct extractionof DNA from soil and sediments[J].Applied and Environmental Microbiology,1991,57(4):1070-1074.
1.用液氮研磨杨树湿心材、健康边材样品(与实施例1样品同一批次)。
2.取1g样品加入2mL120mM磷酸钠缓冲液(pH 8)，在摇床上摇15min(150rpm)。
3.离心(6000g，10min)。
4.去上清液，重复步骤2-3。
5.在样品中加入2mL裂解液〔0.15M NaCl,0.1MNa2EDTA(PH8)〕，15mg/mL溶菌酶，37℃水浴2小时，每30分钟颠倒混匀。
6.离心，取上清，加入2mL 0.1M NaCl-0.5M Tris-HCl(pH8)-10％SDS，放在-70℃的干冰上冷冻，放在65℃的水浴锅里融化，冻融重复3次。
7.加入2mL 0.1M Tris-HCl(pH8)-饱和苯酚，颠倒混匀，离心(6000g，10min)。
8.收集3mL的上清液，加入1.5mL的苯酚和1.5mL氯仿混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)。
9.将2.5mL萃取的上清液再用相同体积的氯仿混合液萃取。
10.最后将萃取液用2mL的冰异丙醇沉淀，放在-20℃1小时或者一夜。
11.离心(10000g，10min)，DNA在23℃下干燥。
12.加入50μL TE溶解DNA，加入RNA酶(终浓度0.2ug/μL)，37℃水浴2小时。
13.将DNA置于-20℃保存。
对比试验例4：提取木材DNA方法
方法来自于文献：Verbylaite R,Beisys P,Rimas V,Kuusiene S.Comparison often DNA extraction protocols from wood of european aspen(PopμLus tremμLa L.)[J].Baltic Forestry,2010,16(1):35-42.
1.用液氮研磨杨树湿心材、健康边材样品(与实施例1样品同一批次)。
2.加热提取缓冲液到60℃。
3.取1g样品加入5mL提取缓冲液，混合均匀。
4.60℃水浴30～120min，期间颠倒混匀数次。
5.用5mL氯仿：异戊醇＝1：1混合液萃取，离心(12000g，30s，20～25℃)。
6.取上层清液到新的离心管中，加入0.5倍体积的5M NaCl，加入40％体积冰的异丙醇，混合均匀，沉淀核酸。如果没有看见明显的沉淀，可在-20℃放置20min或者更久。
7.离心(12000g，1min，20～25℃)。如果看不见沉淀，可在冰上放置20min再离心，最坏的情况下，离心(12000g，10min)。
8.尽可能倒掉上清液，加入0.5～1mL的清洗缓冲液(76％乙醇，10mM醋酸铵)，轻轻涡旋，放置15～20min。一般来说，核酸会在这一步变得更纯净。
9.离心(12000g，1min，20～25℃)。如果还不充分，就离心更久时间，倒掉缓冲液，放置2-4min，干燥核酸。
10.将DNA溶于50μLTE。
11.置于-20℃保存。
对比试验例5：提取植物组织中微生物DNA方法
方法来自于文献：Maropola M K,Ramond J B,Trindade M.Impact ofmetagenomic DNA extraction procedures on the identifiable endophyticbacterial diversity in Sorghum bicolor(L.Moench)[J].Journal ofmicrobiological methods,2015,112:104-117.
1.用液氮研磨杨树湿心材、健康边材样品(与实施例1样品同一批次)。
2.取1g样品，加入5mL溶菌酶缓冲液(25mM Ttis-HCl,50mM葡萄糖，10mM EDTA，25mg/mL溶菌酶)，RNA酶(终浓度50ug/mL)，涡旋混匀20s。
3.37℃水浴1小时，加入蛋白酶K(终浓度1mg/mL)，再水浴1小时。
4.加入SDS(终浓度1％)，颠倒混匀10次。
5.将混合物在65℃水浴30min，离心(14000rcf，2min)。
6.取上清，加入等体积苯酚，离心(10000rcf，1min)。
7.取上层清液，再用苯酚萃取一次。
8.加入等体积氯仿：异戊醇＝24：1，离心(10000rcf，10min)。
9.将离心管放在冰上，加入等体积冰的异丙醇，在4℃条件下放置20min，离心(10000rcf，5min)，倒掉液体。
10.将DNA沉淀放在通风橱干燥。
11.用250μL70％的乙醇洗涤，离心(10000rcf，5min)，洗涤2次。
12.用50μL TE溶解DNA。
13.将DNA置于-20℃保持。
对比试验例6提取培养的细菌DNA方法
方法来自于文献：Pindi P K,Srinath R R,Shanker A S.Novel approaches ofgenomic DNA isolation for identification of cμLtivable bacteria[J].Jundishapur Journal of Microbiology,2013,6(10):e8339.
1.用液氮研磨杨树湿心材、健康边材样品(与实施例1样品同一批次)。
2.取1g样品，加入5mL提取缓冲液(90％乙醇，30％过氧化氢，苯酚)，在37℃温育10小时。
3.将上清液转移到新的离心管中，离心(12000rpm，10min)，去上清液，沉淀中含有高分子量的DNA。
4.用50μLTE溶解DNA，保存在-20℃。
对比试验例7提取培养的真菌DNA方法
方法来自于文献：Mot’kováP,Vytrasova J.Comparison of methods forisolating fungal DNA[J].Czech Journal of Food Sciences,2011,29:S76-S85.
1.用液氮研磨杨树湿心材、健康边材样品(与实施例1样品同一批次)。
2.取1g样品，加入5mLTE缓冲液，离心(16500g，5min)。
3.去上清，加入5mL提取液(200mM Tris-HCl pH8.5，250mM EDTA，0.5％SDS)，再加入150μL醋酸钠(3M，pH5.2)，将离心管在-80℃放置10min，解冻之后离心(16500g，5min)。
4.将上清液转移到新的离心管中，加入等体积异丙醇，室温放置5min，离心(16500g，15min)。
5.去上清，加入300μL70％乙醇洗涤DNA沉淀，离心(16500g，15min)。
6.去上清，将DNA放在100℃处干燥。
7.加入500μLTE溶解DNA。
8.置于-20℃保存。
测定各试验例制备的微生物基因组DNA浓度，同时用分光光度计测定OD260/OD230、OD260/OD280值。
表2各试验例提取的DNA浓度和纯度(vol：50μL)(3个样品的平均值±标准误)
将本发明实施例1与对比例1～例7提取方法所得的基因组DNA在0.8％的琼脂糖凝胶电泳下检测其完整度，样本上样量均为8μL，M(λ/HindIII DNA Marker)上样量为5μL。结果显示，本发明方法所得DNA经琼脂糖凝胶电泳，得到明显的DNA条带(见图1)。
将本发明实施例1与对比例1～例7提取方法所得的样品微生物DNA溶液通过表3的5对引物(细菌、真菌)进行P CR扩增来检测所提DNA的质量，样本上样量均为10μL，M(Marker1)上样量为5μL。结果显示，本发明方法所得DNA经5对引物扩增后，分别得到与目的片段大小完全一致的DNA条带，而对比例1-例7只能部分得到或者得不到与目的片段大小完全一致的DNA条带(见图2)。这说明本发明方法所提取的DNA可直接应用于分子操作。
表3用于PCR扩增的引物序列

Claims (8)

1.一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，该方法包含下述步骤：
(1)收集杨树湿心材或健康边材样本，经液氮研磨后加入活性炭及提取缓冲液，再加入蛋白酶K和十二烷基硫酸钠，混匀；所述的提取缓冲液包含下列组分：1％CTAB+2％PVPP+1.5M NaCl+100mM EDTA+100mM TE pH8.0+0.1M磷酸钠缓冲液pH8.0，蛋白酶K浓度为20mg/ml，十二烷基硫酸钠的质量浓度为10％；
(2)放入58～62℃水浴1.5～3h，期间颠倒混匀3～4次，然后进行第一次离心，转移第一次离心后的上层水相；
(3)向所述第一次离心后的水相中加入PEG6000，混匀静置后进行第二次离心，去掉第二次离心后的上层水相；
(4)向所述第二次离心后的沉淀中加入TE和醋酸钾，混匀静置后进行第三次离心，转移第三次离心后的上层水相；
(5)向所述第三次离心后的水相中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶液，混匀静置后进行第四次离心，转移第四次离心后的上层水相；苯酚-氯仿-异戊醇溶液中苯酚、氯仿和异戊醇的体积比为25：24：1；
(6)向所述第四次离心后的上层水相中加入0.6-0.8倍体积的异丙醇，混匀室温静置0.5-1.5h后进行第五次离心，收集沉淀；
(7)向所述第五次离心后收集到的沉淀先后采用75％酒精、无水酒精洗涤，然后进行第六次离心得到DNA沉淀，使用TE溶解DNA沉淀，再加入RNase A，水浴后得到所提取的微生物基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的第一次离心是在12000rpm、4℃下进行，离心时间为15～25min。
3.根据权利要求1所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中向所述第一次离心后的水相中加入1/2体积的PEG6000。
4.根据权利要求1所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤(3)中第二次离心是在12000rpm、4℃下进行，离心时间为4～6min。
5.根据权利要求1所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤(4)中TE缓冲液包含下列组份：10mM Tris-HCl和1mM乙二胺四乙酸，醋酸钾的浓度为5M。
6.根据权利要求1所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤(4)中第三次离心和步骤(5)中第四次离心均是在12000rpm、4℃下进行，离心时间为12～18min。
7.根据权利要求1所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤(6)中第五次离心和步骤(7)中第六次离心是在10000rpm、4℃下进行，离心时间为8～12min。
8.根据权利要求1所述的一种从杨树木材中提取微生物基因组DNA的方法，其特征在于，步骤(7)中是在37℃下水浴，时间为10～20min。
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