CN105734166A - 一种多重pcr引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种多重PCR引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用。本发明提供的一种多重PCR引物，由嗜水气单胞菌特异性引物H、温和气单胞菌特异性引物S和舒伯特气单胞菌特异性引物Sc组成。采用该多重PCR引物在大菱鲆养殖过程中快速鉴定致病菌的方法如下：提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA；以所提取的DNA为模板，采用上述的多重PCR引物，进行PCR扩增；根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断。本发明经过一次PCR反应可以同时检测三种大菱鲆养殖过程中常见的致病菌，表现出很强的特异性和灵敏性。在大菱鲆养殖过程中，一旦有被这三种气单胞菌感染的风险，即能够做到快速鉴定致病源，为养殖户挽回大量损失。

Description

一种多重PCR引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用
技术领域
本发明属于病原微生物检测领域，具体涉及一种大菱鲆养殖过程中常见的3种致病菌：嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonassobria)和舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)的多重PCR检测方法。
背景技术
有“多宝鱼”之称的大菱鲆已被引进我国长达10年之久，凭借其优良的苗种，先进的创新模式和工业化养殖的潮流，逐渐成为全国引人注目的重要养鱼工业。这一全新产业的发展，对我国的水产经济拉动均有很大作用，并为我国北方沿海城市工业化养鱼的纵向发展奠定了雄厚的理论和实践基础。然而随着养殖规模的快速增长，养殖密度的增加，以及水体环境的恶化，一系列的疾病也随之而来。近年来在大菱鲆养殖过程中细菌性疾病的急剧爆发严重影响并制约了我国大菱鲆养殖产业的健康发展，给养殖户带来了巨大的经济损失。
发明内容
本发明的目的是提供一种对嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌具有特异性强且灵敏性高的多重特异性引物。
本发明的另一目的是提供一种在大菱鲆养殖过程中，可快速鉴定致病源，为养殖户挽回经济损失的大菱鲆养殖过程中快速鉴定致病菌的多重引物PCR检测方法。
本发明采用的技术方案是：一种多重PCR引物，由嗜水气单胞菌特异性引物H、温和气单胞菌特异性引物S和舒伯特气单胞菌特异性引物Sc组成。
所述的嗜水气单胞菌特异性引物H的DNA序列为：
上游引物F1的序列为：CGACGTGTTTGGCGATATTTTTG
下游引物R1的序列为：GTCTTGGTCTTCTGGTAGCGA
所述的温和气单胞菌特异性引物S的DNA序列为：
上游引物F2的序列为：GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA
下游引物R2的序列为：TACGTACAGATCCCCAGCCC
所述的舒伯特气单胞菌特异性引物Sc的DNA序列为：
上游引物F3的序列为：GGGCCCGTTATGACCAGTTT
下游引物R3的序列为：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC。
优选的，上述的多重PCR引物，所述的嗜水气单胞菌为Aeromonashydrophila，温和气单胞菌是Aeromonassobria，舒伯特气单胞菌为Aeromonasschubertii。
一种大菱鲆养殖过程中快速鉴定致病菌的多重PCR检测方法，方法如下：
1)提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA；
2)以所提取的DNA为模板，采用上述的多重PCR引物，进行PCR扩增；
3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断：如果琼脂糖凝胶呈现有354bp条带，则大菱鲆被嗜水气单胞菌感染，否则没有感染嗜水气单胞菌感染；如果琼脂糖凝胶呈现有486bp条带，则大菱鲆被温和气单胞菌感染，否则没有被温和气单胞菌感染；如果琼脂糖凝胶呈现有704bp条带，则大菱鲆被舒伯特气单胞菌感染，否则没有被舒伯特气单胞菌感染。
上述的一种大菱鲆养殖过程中快速鉴定致病菌的多重PCR检测方法，
PCR反应条件：第一阶段：95℃5min；
第二阶段：95℃30s，60℃90s，72℃60s；35循环；
第三阶段：72℃10min；
第四阶段：4℃保存。
本发明的有益效果是：
1.本发明，设计的多重引物PCR检测方法，经过一次PCR反应可以同时检测三种大菱鲆养殖过程中常见的致病菌，这三种致病菌分别为嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌。
2.本发明，设计的多重PCR特异性引物，能有效从各常见致病菌株中区分出嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌，表现出很强的特异性。
3.本发明，设计的多重PCR特异性引物，灵敏性高，可有效检出养殖过程中的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌，其最低检测浓度可达到0.01ng/ul。
4.本发明，所提供的在大菱鲆养殖过程中嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌的多重引物PCR检测方法，使得养殖过程中嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌的检测更为简便。在大菱鲆养殖过程中，一旦有被气单胞菌感染的风险，即能够做到快速鉴定致病源，为养殖户挽回大量损失。本发明的检测方法可有效检出大菱鲆养殖过程中的高危致病菌嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌，经验证此检测方法特异性强，灵敏度高。该检测方法的确立为今后大菱鲆养殖过程中高发致病菌的检测和分析提供了必要的理论依据和完善的方法体系，不仅为今后大菱鲆养殖产业的健康发展做出了贡献，同时为促进我国养殖产业的规模化健康发展奠定了基础。
附图说明
图1是多重引物PCR反应条件优化；
其中，M:MarkerDL2000，1-6:退火温度分别为55，56，57，58，59，60℃。
图2是嗜水气单胞菌特异性引物H的特异性验证；
其中，1.Aeromonasbivalvium；2.Aeromonascaviae；3-4.Aeromonashydrophila；
5.Aeromonasjandaei；6.Aeromonassalmonicida；7.Aeromonasschubertii；
8.Aeromonassobria；9.Aeromonasveronii；10.Pseudomonasaeruginosa；
11.Pseudomonasfragi；12.Pseudomonasgessardii；
13.Pseudomonashelmanticensis；14.Pseudomonaskilonensis；
15.Pseudomonasmarginalis；16.Vibrioalginolyticus；17.Vibriocyclitrophicus；
18.Vibriogigantis；M:MarkerDL2000。
图3是温和气单胞菌特异性引物S的特异性验证；
其中，1.Aeromonasbivalvium；2.Aeromonascaviae；3-4.Aeromonashydrophila；
5.Aeromonasjandaei；6.Aeromonassalmonicida；7.Aeromonasschubertii；
8.Aeromonassobria；9.Aeromonasveronii；10.Pseudomonasaeruginosa；
11.Pseudomonasfragi；12.Pseudomonasgessardii；
13.Pseudomonashelmanticensis；14.Pseudomonaskilonensis；
15.Pseudomonasmarginalis；16.Vibrioalginolyticus；17.Vibriocyclitrophicus；
18.Vibriogigantis；M:MarkerDL2000。
图4是舒伯特气单胞菌特异性引物Sc的特异性验证；
其中，1.Aeromonasbivalvium；2.Aeromonascaviae；3-4.Aeromonashydrophila；
5.Aeromonasjandaei；6.Aeromonassalmonicida；7.Aeromonasschubertii；
8.Aeromonassobria；9.Aeromonasveronii；10.Pseudomonasaeruginosa；
11.Pseudomonasfragi；12.Pseudomonasgessardii；
13.Pseudomonashelmanticensis；14.Pseudomonaskilonensis；
15.Pseudomonasmarginalis；16.Vibrioalginolyticus；17.Vibriocyclitrophicus；
18.Vibriogigantis；M:MarkerDL2000。
图5是多重引物PCR反应灵敏性验证。
其中，M:MarkerDL2000，1-6:模板浓度分别为10、100、10-1、10-2、10-3、10-4ng/ul。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1一种多重PCR引物
(一)多重PCR引物的设计
本实施例针对菌种嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila、温和气单胞菌Aeromonassobria和舒伯特气单胞菌Aeromonasschubertii的dnaJ基因，利用MEGA6软件，设计出对嗜水气单胞菌Aeromonashydrophila、温和气单胞菌Aeromonassobria和舒伯特气单胞菌Aeromonasschubertii具有特异性强且灵敏性高的三对特异性引物嗜水气单胞菌特异性引物H、温和气单胞菌特异性引物S和舒伯特气单胞菌特异性引物Sc，该多重特异性引物的具体信息如表1所示。
表1
(二)多重PCR引物最佳PCR反应条件的探索
1、待试菌株DNA的提取
使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，分别提取嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonassobria)和舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)的DNA，具体步骤如下：
1.1)分别取1ml过夜培养的含有嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonassobria)和舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)的菌液，加入1.5ml离心管中，室温8000rmp离心1min，弃上清，收集菌体，加入180ulBufferDigestion，再加入20ulProteinaseK溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，促进细胞裂解。
1.2)加入200ulBufferBD，充分颠倒混匀。加入BufferBD后，如有沉淀产生，可70℃水浴10分钟。
1.3)加入200ul的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能产生半透明纤维状悬浮物，不影响DNA的提取和应用。
1.4)将吸附柱放入收集管中，用移液器将步骤1.3)获得的溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，在12000rmp室温离心1min，倒掉收集管中的废液。
1.5)将吸附柱重新放回收集管，加入500ulPWSolution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。
1.6)将吸附柱重新放回收集管，加入500ulWashSolution，10000rmp离心30s，倒掉滤液。
1.7)将吸附柱重新放回收集管中，于12000rmp室温离心2min，弃去残留的WashSolution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的WashSolution，WashSolution的残留会影响基因组DNA的产量和后续的实验。
1.8)取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50-100ulCEBuffer静置3min，12000rmp室温离心2min，分别收集DNA溶液，分别得到嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、温和气单胞菌(Aeromonassobria)和舒伯特气单胞菌(Aeromonasschubertii)的DNA。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
2、多重特异性引物最佳退火温度的探索
分别以嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌的DNA为模板做PCR扩增，并将目的引物的退火温度范围分别设置为55-60℃，PCR扩增产物在2％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录，根据PCR后的凝胶电泳结果确定各引物最佳退火温度。具体PCR反应条件和体系如表2所示，结果如图1。
表2目的引物最佳PCR反应探索条件
由图1可见，当退火温度为55-60℃时，随着温度的升高，越有利于该多重PCR特异性引物特异性扩增，故确定最佳退火温度为60℃。
(三)多重引物PCR的特异性探索
1、待试菌株DNA的提取
使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，分别提取如表3所示的不同菌种的DNA，具体步骤如上述(二)中步骤1。
2、特异性探索
分别以表3中，不同菌种的DNA为模板，分别以嗜水气单胞菌特异性引物H、温和气单胞菌特异性引物S和舒伯特气单胞菌特异性引物Sc做PCR扩增，具体PCR反应条件和体系如表4所示，PCR后的凝胶电泳结果如图2-图4所示。
表3待试菌株如下：
表4目的引物最佳PCR反应条件
图2是以嗜水气单胞菌特异性引物H为引物对表3中不同菌种的DNA做PCR扩增，PCR后的凝胶电泳结果图，由图2可见，该特异性引物在气单胞菌属内，以及假单胞菌和弧菌属内均表现出很强的特异性，只能和目的菌株嗜水气单胞菌产生特异性扩增，而未和非目的菌株产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。
图3是以温和气单胞菌特异性引物S为引物对表3中不同菌种的DNA做PCR扩增，PCR后的凝胶电泳结果图，由图3可见，该特异性引物在气单胞菌属内，以及假单胞菌和弧菌属内均表现出很强的特异性，只能和目的菌株温和气单胞菌Aeromonassobria产生特异性扩增，而未和非目的菌株产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。
图4是以舒伯特气单胞菌特异性引物Sc为引物对表3中不同菌种的DNA做PCR扩增，PCR后的凝胶电泳结果图，由图4可见，该特异性引物在气单胞菌属内，以及假单胞菌和弧菌属内均表现出很强的特异性，只能和目的菌株舒伯特气单胞菌产生特异性扩增，而未和非目的菌株产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。
由图2-图4可见，本发明的多重PCR引物在气单胞菌属内，以及假单胞菌和弧菌属内均表现出很强的特异性，只能和各自的目的菌株产生特异性扩增，而未和非目的菌株产生特异性扩增。故可见其表现出很强的特异性。
实施例2一种大菱鲆养殖过程中致病菌的多重PCR检测方法
模型：制作感染嗜水气单胞菌的大菱鲆模型。
方法如下：
1、提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA；
将其病灶处组织用1ml无菌水反复冲洗，至少三次，然后收集液体，使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA，具体步骤如上述实例1中(二)的步骤1。
2、以提取的DNA为模板，采用实施例1所述的多重PCR引物，利用PCR方法扩增，得
到PCR产物；
上游引物F1的序列为：CGACGTGTTTGGCGATATTTTTG
下游引物R1的序列为：GTCTTGGTCTTCTGGTAGCGA
上游引物F2的序列为：GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA
下游引物R2的序列为：TACGTACAGATCCCCAGCCC
上游引物F3的序列为：GGGCCCGTTATGACCAGTTT
下游引物R3的序列为：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC
PCR反应条件：第一阶段：95℃5min；
第二阶段：95℃30s，60℃90s，72℃60s；35循环；
第三阶段：72℃10min；
第四阶段：4℃保存。
3、PCR扩增产物在2％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录。
4、结果：对23尾感染了嗜水气单胞菌的大菱鲆检测，琼脂糖凝胶只呈现有354bp条带。
实施例3一种大菱鲆养殖过程中致病菌的多重PCR检测方法
模型：制作感染温和气单胞菌的大菱鲆模型。
方法同实施例2。
结果：对26尾感染了温和气单胞菌的大菱鲆检测，琼脂糖凝胶只呈现有486bp条带。
实施例4一种大菱鲆养殖过程中致病菌的多重PCR检测方法
模型：制作感染舒伯特气单胞菌的大菱鲆模型。
方法同实施例2
结果：对30尾感染了舒伯特气单胞菌的大菱鲆检测，琼脂糖凝胶只呈现有704bp条带。
实施例5一种大菱鲆养殖过程中致病菌的多重PCR检测方法
取某池塘的感染致病菌的大菱鲆
1、提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA；
将其病灶处组织用1ml无菌水反复冲洗，至少三次，然后收集液体，使用Ezup柱氏基因组DNA抽提试剂盒(细菌)，提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA，具体步骤如上述实例1中(二)的步骤1。
2、以提取的DNA为模板，采用实施例1所述的多重PCR引物，利用PCR方法扩增，得到PCR产物；
上游引物F1的序列为：CGACGTGTTTGGCGATATTTTTG
下游引物R1的序列为：GTCTTGGTCTTCTGGTAGCGA
上游引物F2的序列为：GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA
下游引物R2的序列为：TACGTACAGATCCCCAGCCC
上游引物F3的序列为：GGGCCCGTTATGACCAGTTT
下游引物R3的序列为：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC
PCR反应条件：第一阶段：95℃5min；
第二阶段：95℃30s，60℃90s，72℃60s；35循环；
第三阶段：72℃10min；
第四阶段：4℃保存。
3、PCR扩增产物在2％琼脂糖1×TAE缓冲系统中电泳，每孔加样5ul，用凝胶成像系统观察并摄影记录。
4、结果：经检测，琼脂糖凝胶中出现了354bp条带，说明此鱼感染了嗜水气单胞菌。这样水产监测机构和养殖户则可以根据检测结果有针对的进行预防和治疗。

Claims (5)

1.一种多重PCR引物，其特征在于：所述的多重PCR引物由嗜水气单胞菌特异性引物H、温和气单胞菌特异性引物S和舒伯特气单胞菌特异性引物Sc组成。
2.根据权利要求1所述的一种多重PCR引物，其特征在于：
所述的嗜水气单胞菌特异性引物H的DNA序列为：
上游引物F1的序列为：CGACGTGTTTGGCGATATTTTTG
下游引物R1的序列为：GTCTTGGTCTTCTGGTAGCGA
所述的温和气单胞菌特异性引物S的DNA序列为：
上游引物F2的序列为：GCTGATTTTGGTGATGCGTTCA
下游引物R2的序列为：TACGTACAGATCCCCAGCCC
所述的舒伯特气单胞菌特异性引物Sc的DNA序列为：
上游引物F3的序列为：GGGCCCGTTATGACCAGTTT
下游引物R3的序列为：AGGAGTGATCTTGAGCTTGACC。
3.权利要求1或2所述的多重PCR引物在大菱鲆养殖过程中，鉴定感染嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和舒伯特气单胞菌中的应用。
4.一种大菱鲆养殖过程中快速鉴定致病菌的多重PCR检测方法，其特征在于方法如下：
1)提取大菱鲆病灶部位细菌的总DNA；
2)以所提取的DNA为模板，采用权利要求1或2所述的多重PCR引物，进行PCR扩增；
3)根据PCR扩增产物的琼脂糖凝胶呈像结果判断：如果琼脂糖凝胶呈现有354bp条带，则大菱鲆被嗜水气单胞菌感染，否则没有感染嗜水气单胞菌感染；如果琼脂糖凝胶呈现有486bp条带，则大菱鲆被温和气单胞菌感染，否则没有被温和气单胞菌感染；如果琼脂糖凝胶呈现有704bp条带，则大菱鲆被舒伯特气单胞菌感染，否则没有被舒伯特气单胞菌感染。
5.根据权利要求4所述的一种大菱鲆养殖过程中快速鉴定致病菌的多重PCR检测方法，其
PCR反应条件：第一阶段：95℃5min；
第二阶段：95℃30s，60℃90s，72℃60s；35循环；
第三阶段：72℃10min；
第四阶段：4℃保存。
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