CN106834279A

CN106834279A - 快速提取冬虫夏草菌基因组dna的方法

Info

Publication number: CN106834279A
Application number: CN201710228673.6A
Authority: CN
Inventors: 黄泽瑜; 赵楠
Original assignee: Chengdu Map Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Chengdu Map Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2017-04-10
Filing date: 2017-04-10
Publication date: 2017-06-13
Anticipated expiration: 2037-04-10
Also published as: CN106834279B

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法。针对现有提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法耗时长等问题，本发明提供一种快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，步骤如下：a、将冬虫夏草菌菌种接种于培养基中，培养10～20d后，过滤，收集菌丝沉淀；b、取菌丝沉淀0.5～1g,加入蒸馏水2～10ml，分散器打碎菌体，离心后弃上清；加入磷酸氢二钾溶液，离心弃上清；再加入磷酸氢二钾震荡成均匀悬浮的菌液，加入混合酶液,震荡混匀、煮沸，再于冰上放置5～30min,离心，即得。本发明方法专用于冬虫夏草菌，在提取时可排除其他杂菌的干扰，DNA纯度高；并且，本发明耗时短，现有的CTAB法耗时4‑6h，本发明耗时仅为1.5h左右。

Description

快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法。

背景技术

冬虫夏草Ophiocordyceps sinensis是我国一种传统的名贵中药材，是一种昆虫与真菌的结合体。是我国一种传统的珍贵中药材。野生冬虫夏草仅分布于青藏高原及周边地区海拔3000m以上、雪线以下的地区，在我国的分布包括西藏、青海、四川、云南、甘肃5省区的高寒草甸草原。《中华人民共和国药典》自1963年版直到目前的2015年版都对冬虫夏草进行了收录，2015年版药典记载其“甘，平。归肺、肾经。补肾益肺，止血化痰。用于肾虚精亏，阳痿遗精，腰膝酸痛，久咳虚喘，劳嗽咯血”。

迄今为止，有关冬虫夏草菌的研究越来越侧重于人工培育的方法，借助于分子生物学手段的实验也越来越多。在研究其交配型基因的表达或产物时首先需要获得冬虫夏草菌的基因组DNA，才能进行下一步实验。

现有技术提取冬虫夏草菌的基因组DNA的方法主要为CTAB法，该方法提取的DNA可用于基因扩增、全基因组测序或其他对基因组DNA要求较高的分子生物学试验中。但CTAB法耗时长，需要的仪器设备多，设备要求高，提取成本较高。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法耗时长、设备要求高、生产成本高等问题。

本发明解决技术问题的技术方案为：提供一种快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法。该方法包括以下步骤：

a、冬虫夏草菌菌体培养与收集

将冬虫夏草菌菌种接种于培养基中，培养10～20d后，过滤，收集菌丝沉淀；

b、冬虫夏草菌基因组DNA的提取

取步骤a所得菌丝沉淀，加入蒸馏水，打碎菌体，离心后弃上清；加入磷酸氢二钾溶液，离心弃上清；再加入磷酸氢二钾震荡成均匀悬浮的菌液，加入混合酶液,混合酶液为蜗牛酶和纤维素酶的混合液,震荡混匀0.5～3h，煮沸5～30min，再于冰上放置5～30min，离心，上清即为冬虫夏草菌基因组DNA。

其中，上述快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法中，步骤a中所述的培养基组成为：每升培养基中含马铃薯80～300g，葡萄糖20～50g，蛋白胨5～20g,酵母提取物1～10g,磷酸氢二钾0.1～5g，硫酸镁0.1～5g，余量为水。

其中，上述快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法中，步骤a中所述培养的培养温度为10～25℃，培养时置于转速为100～250r/min震荡摇床中进行。

其中，上述快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法中，步骤b中所述的离心是指在6000～10000r/min离心5～10min。

其中，上述快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法中，步骤b中所述蒸馏水加入量为每0.5～1g菌丝沉淀中加入蒸馏水2～10ml。

其中，上述快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法中，步骤b中所述的磷酸氢二钾溶液浓度为0.01～0.1mol/L，加入量为每0.5～1g菌丝沉淀中加入2～10ml。

其中，上述快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法中，步骤b中所述每毫升混合酶液中含蜗牛酶1～10mg，含纤维素酶1～10mg。

其中，上述快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法中，步骤b中所述的混合酶液的加入量为每0.5～1g菌丝沉淀中加入1～10ml。

其中，上述快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法中，步骤b中所述震荡混匀时转速为100～250r/min，温度为25～37℃。

本发明的有益效果为：本发明提供了一种专门针对于冬虫夏草菌基因组DNA的提取方法，该方法专用于冬虫夏草菌，在提取时可排除其他杂菌的干扰，DNA纯度高；相比现有提取DNA的CTAB法，本发明耗时短，CTAB法耗时4-6h，本发明耗时仅为1.5h左右；CTAB法会使用到氯仿，苯酚等有毒试剂，污染环境且危害操作者健康，本发明提取DNA所用试剂少，生产成本低，并且试剂安全无毒，与环境更友好。

附图说明

图1所示为用不同方法提取的DNA进行PCR后的电泳图。M为TAKARA DL2000DNAMarker，1为实施例提取得到的冬虫夏草菌基因组DNA扩增得到的18S片段，2为对比例1提取得到的蛹虫草基因组DNA扩增得到的18S片段，3为对比例2提取得到的冬虫夏草菌基因组DNA扩增得到的18S片段，4为对比例2提取得到的冬虫夏草菌基因组DNA扩增得到的18S片段。

具体实施方式

本发明提供一种快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，包括以下步骤：

a、冬虫夏草菌菌体培养与收集

将冬虫夏草菌菌种接种于培养基中，在10～25℃、转速为100～250r/min的震荡摇床中培养10～20d后，过滤，收集菌丝沉淀；所述培养基组成为：每升培养基中含马铃薯80～300g，葡萄糖20～50g，蛋白胨5～20g,酵母提取物1～10g,磷酸氢二钾0.1～5g，硫酸镁0.1～5g，余量为水；

b、冬虫夏草菌基因组DNA的提取

取步骤a所得菌丝0.5～1g,加入蒸馏水2～10ml，分散器打碎菌体，6000～10000r/min离心5～10min后弃上清；加入磷酸氢二钾溶液，6000～10000r/min离心5～10min后弃上清；再加入磷酸氢二钾震荡成均匀悬浮的菌液，加入混合酶液,100～250r/min于25～37℃震荡混匀0.5～3h，煮沸5～30min，再于冰上放置5～30min,6000～10000r/min离心5～10min，上清即为冬虫夏草菌基因组DNA。

为了调整pH为冬虫夏草菌生长的最适温度，步骤b中所述的磷酸氢二钾溶液浓度为0.01～0.1mol/L，每0.5～1g菌丝中加入2～10ml磷酸氢二钾溶液。

为了使冬虫夏草菌细胞壁充分裂解，使基因组DNA暴露出来，步骤b中所述的混合酶液为蜗牛酶和纤维素酶的混合液；进一步的，每毫升混合酶液中含蜗牛酶1～10mg，含纤维素酶1～10mg。其中，步骤b中所述的混合酶液的加入量为每0.5～1g菌丝中加入混合酶液1～10ml。

下面通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。

实施例用本发明方法提取冬虫夏草菌基因组DNA

具体操作步骤如下：

a、取冬虫夏草菌菌种0.5g，加入含有70ml培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物1g/L,磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L)的250ml三角瓶中，放入转速为150r/min震荡摇床中于18℃培养14d，过滤培养液，收集菌丝沉淀；

b、取1g步骤a得到的菌丝，加入4ml蒸馏水，用分散器打碎菌体，7000r/min离心5min，弃上清；加入0.01mol/L的磷酸氢二钾溶液4ml，充分震荡混匀后7000r/min离心5min，弃上清；再加入0.01mol/L的磷酸氢二钾溶液4ml，充分震荡混匀成均匀悬浮的菌液，加入2ml混合酶液(每1000μl混合酶液中包含25mg/ml蜗牛酶200μl，10mg/ml纤维素酶500μl，菌液300μl)，200r/min于37℃震荡混匀1h，再在沸水浴中煮沸5-10min，转入冰上放置5min，7000r/min离心5min，取上清，上清液存于-20℃备用。

对比例1用CTAB法提取冬虫夏草菌菌基因组DNA

具体操作步骤如下：

a、取冬虫夏草菌菌种0.5g，接种于含有70ml液体培养基(马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母提取物1g/L,磷酸氢二钾1g/L，硫酸镁0.5g/L)的250ml三角瓶中，放入转速为150r/min震荡摇床中于18℃培养14d；

b、过滤培养液，收集菌丝沉淀于2ml离心管中；

c、收集的菌体用无菌水冲洗3次，8000r/min离心去上清液；

d、将步骤c得到的菌丝样品放入盛有10～20ml液氮的碾钵中，在液氮挥发完之前将菌丝碾磨成粉末，移入2ml离心管中；

e、加入700μl含有1％β-巯基乙醇的CTAB缓冲液，混匀，于65℃水浴锅温育60min.然后12000rpm 4℃离心15min，上清转移到新的2ml离心管中；

f、加入700μl的饱和苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1的混合液，充分混匀，12000rpm4℃离心15min。将上清液移入到新的2ml离心管中，加入700μl的氯仿：异戊醇＝24：1的混合液，充分混匀，经12000rpm 4℃离心15min，上清转移到新的2ml离心管中；

g、加入1400μl保存于-20℃的无水乙醇以及70μl 3M NaAc(pH＝5.2),于-20℃放置30min，经12000rpm 4℃离心15min；去上清；

h、加入500μl体积分数为70％的酒精洗沉淀，去掉上清后置于滤纸上干燥，直到酒精挥发完毕，加入20μl无菌水溶解DNA，保存于-20℃。

对比例2用本发明方法提取蛹虫草菌基因组DNA

具体操作过程如下：

除步骤a中将冬虫夏草菌菌种换成等量的蛹虫草菌菌种外，其余操作同实施例。

对比例3用本发明方法提取蝙蝠蛾拟青霉基因组DNA

具体操作过程如下：

除步骤a中将冬虫夏草菌菌种换成等量的蝙蝠蛾拟青霉菌种外，其余操作同实施例。

效果验证

将实施例和对比例提取的DNA采用PCR进行扩增，PCR体系包括：

PCR扩增条件为：

94℃3min，25个循环：94℃30s，56℃30s，72℃x s(根据扩增的DNA片段长度确定，每1kb长度DNA需延伸60s)，72℃10min。

PCR引物为：核苷酸序列为Seq ID No.1的18s-F和核苷酸序列为Seq ID No.2的18s-R。

对实施例和对比例1、2、3所得的DNA进行PCR扩增后，得到如下图1所示的结果。

对实施例提取的DNA进行PCR扩增后,得到序列号为Seq ID No.3核苷酸序列；对对比例1提取的DNA进行PCR扩增后,得到序列号为Seq ID No.4核苷酸序列。

由实验结果可看出，本发明提供的DNA提取方法具有特异性，专用于提取冬虫夏草菌基因组DNA，而对其他物种无效；本发明方法提取的基因组DNA用于PCR时可以和CTAB法提取的基因组DNA达到同样效果，却比CTAB法简便快捷，减少有害试剂苯酚、氯仿的使用，节约成本，与环境更友好。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都图径生物科技有限公司

<120> 快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法

<130> A170180K

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 上游引物18s-F的核苷酸序列

<400> 1

tcctctaaat gaccaagttt g 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 下游引物18s-R的核苷酸序列

<400> 2

ggaagggrtg tatttattag 20

<210> 3

<211> 958

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 实施例提取的冬虫夏草菌DNA的核苷酸序列

<400> 3

atactctggg ctcctggtga ttcctgataa ctcctcgaat cgcacggcct tgcgccggcg 60

atggttcatt caaatttctt ccctatcaac tttcgatgtt tgggtagtgg ccaaacatgg 120

ttgcaacggg taacggaggg ttagggctcg accccggaga aggagcctga gaaacggcta 180

ctacatccaa ggaaggcagc aggcgcgcaa attacccaat cccgacacgg ggaggtagtg 240

acaataaata ctgatacagg gctcttttgg gtcttgtaat tggaatgagt acaatttaaa 300

tcccttaacg aggaacaatt ggagggcaag tctggtgcca gcagccgcgg taattccagc 360

tccaatagcg tatattaaag ttgttgtggt taaaaagctc gtagttgaac cttgggcctg 420

gctggccggt ccgcctcacc gcgtgtactg gtccggccgg gcctttccct ctgtggaacc 480

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ctccaggcag gcctatgctc gaatacatta gcatggaata atgaaatagg acgcgcggtt 600

ctattttgtt ggtttctagg accgccgtaa tgattaatag ggacagtcgg gggcatcagt 660

attcaatggt cagaggtgaa attcttggat ccattgaaga ctaactactg cgaaagcatt 720

tgtcaaggat gttttcatta atcaggaacg aaagttaggg gatcgaagac gatcagatac 780

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<223> 对比例1提取的冬虫夏草菌DNA的核苷酸序列

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gactgggtgt agttgcccac ctccctgggc cagtccggac gcctcactga gccattcaat 60

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cgacggagtt taacaagatt acccgggcct ttcggccaag gaagtactcg ctggctccgt 240

cagtgtagcg cgcgtgcggc ccagaacatc taagggcatc acagacctgt tattgcctca 300

aacttccatc ggcttgagcc gatagtccct ctaagaagcc ggcgtactgc caaagcaata 360

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accaactaag aacggccatg caccaccacc cacaaaatca agaaagagct ctcaatctgt 480

caatcctcat tgtgtctgga cctggtgagt ttccccgtgt tgagtcaaat taagccgcag 540

gctccacccc tggtggtgcc cttccgtcaa tttctttaag tttcagcctt gcgaccatac 600

tccccctgga gcccaagcac tttgatttct cgtaaggtgc cgaacgcgtc aaaaaataac 660

atcgtccgat ccctagtcgg catagtttat ggttaagact acgacggtat ctgatcgtct 720

tcgatcccct aactttcgtt cctgattaat gaaaacatcc ttggcaaatg ctttcgcagt 780

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tttcattatt ccatgctaat gtattcgagc ataggcctgc ctggagcact ctaattttt 959

Claims

1.快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、冬虫夏草菌菌体培养与收集

b、冬虫夏草菌基因组DNA的提取

2.根据权利要求1所述的快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，其特征在于：步骤a中所述的培养基组成为：每升培养基中含马铃薯80～300g，葡萄糖20～50g，蛋白胨5～20g,酵母提取物1～10g,磷酸氢二钾0.1～5g，硫酸镁0.1～5g，余量为水。

3.根据权利要求1所述的快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，其特征在于：步骤a中所述培养的培养温度为10～25℃，培养时置于转速为100～250r/min震荡摇床中进行。

4.根据权利要求1所述的快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，其特征在于：步骤b中所述的离心是指在6000～10000r/min离心5～10min。

5.根据权利要求1所述的快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，其特征在于：步骤b中所述蒸馏水加入量为每0.5～1g菌丝沉淀中加入蒸馏水2～10ml。

6.根据权利要求1所述的快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，其特征在于：步骤b中所述的磷酸氢二钾溶液浓度为0.01～0.1mol/L，加入量为每0.5～1g菌丝沉淀中加入2～10ml。

7.根据权利要求1所述的快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，其特征在于：步骤b中所述的混合酶液中每毫升含蜗牛酶1～10mg，含纤维素酶1～10mg。

8.根据权利要求1所述的快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，其特征在于：步骤b中所述的混合酶液的加入量为每0.5～1g菌丝沉淀中加入1～10ml。

9.根据权利要求1所述的快速提取冬虫夏草菌基因组DNA的方法，其特征在于：步骤b中所述震荡混匀时转速为100～250r/min，温度为25～37℃。