CN104447966B - 辣椒疫霉细胞分裂蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/30—Microbial fungi; Substances produced thereby or obtained therefrom

Abstract

本发明公开了一种辣椒疫霉细胞分裂蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质为如下a)或b)：a)由序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的蛋白在辣椒疫霉自身生长发育过程中起作用，进一步获得的沉默转化子的生长发育较野生型有明显变化；通过游动孢子接种离体的辣椒叶片后发现沉默转化子接种的病斑面积明显小于野生型，利用苯胺蓝染色技术研究了侵染过程孢子的发育，也证明了沉默转化子的孢子萌发较晚，且芽管较短。以上结论均为辣椒疫霉的发育过程和分子致病机制的研究提供了一定的帮助。

Description

辣椒疫霉细胞分裂蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种辣椒疫霉细胞分裂蛋白及其编码基因与应用。
背景技术
辣椒疫病是一种世界性分布的毁灭性的的土传病害，是由植物病原卵菌辣椒疫霉引发的，该病原菌是一种兼性寄生菌。它的寄主除了辣椒等茄科植物外，还可以侵染黄瓜、南瓜等葫芦科作物。辣椒疫病最先发现于美国新墨西哥州，此后陆续在其他国家发现，对世界范围内的蔬菜生产造成了巨大的经济损失。随着辣椒疫霉在世界范围内地传播我国蔬菜种植区辣椒疫病自80年代以来日趋严重，已经成为危害我国蔬菜产品质量和产量的重要病害之一。因此辣椒疫病的防治对保障我国农业生产具有重要意义。如何控制辣椒疫病的广泛传播和普遍发生，减少病害带来的各种损失成为植保工作者的首要任务。目前，在抗病育种进展缓慢的情况下，主要依赖化学药剂进行防治，但这也导致了一定程度的负面影响，土壤污染，农药残留等问题日益凸显。在此，寻找辣椒疫霉致病基因并通过合理有效的生物学手段抑制阻碍其致病过程成为近些年卵菌工作者的工作重点。
随着分子生物学和卵菌分子遗传学的向前发展，许多效率更高效果更好的基因功能分析技术得到不断改进。因此，综合运用不同的分析手段，对于全面分析卵菌基因的遗传学功能，无疑会促进卵菌分子遗传学的发展，加深人们对卵菌病害的认识。
发明内容
本发明的目的是提供一种辣椒疫霉细胞分裂蛋白及其编码基因与应用。
本发明所提供的蛋白质，名称为PcCDP，来源于辣椒疫霉(PhytophthoracapsiciLeonian)，是如下(a)或(b)：
(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗盐相关的由序列1衍生的蛋白质。
其中，序列表中序列1由472个氨基酸残基组成。
为了便于PcCDP蛋白的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。
表：标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述(b)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
编码所述PcCDP蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
在本发明的一个实施例中，所述核酸分子具体为编码所述PcCDP蛋白的基因(命名为PcCDP)；所述PcCDP基因是如下1)至3)中任一所述的DNA分子：
1)序列表中序列2所示的DNA分子；
2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；
3)与1)或2)限定的DNA分子具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。
上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。
其中，序列2由1419个核苷酸组成，整个序列2即为ORF，编码序列表中序列1所示的蛋白质。
含有上述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
在本发明中，所述重组表达载体具体为在pHAM34载体的酶切位点Sma I处正向插入序列表中序列2所示DNA片段后得到的重组质粒。
在本发明中，所述重组菌具体为向目的辣椒疫霉中导入了序列表中序列2所示DNA片段后得到的重组辣椒疫霉。其中，序列表中序列2所示DNA片段是以重组载体的形式导入的；所述重组载体具体为在pHAM34载体的酶切位点Sma I处正向插入序列表中序列2所示DNA片段后得到的重组质粒。所述目的辣椒疫霉具体为辣椒疫霉菌株SD33。
所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒，在促进辣椒疫霉生长发育和/或制备促进辣椒疫霉生长发育的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
在本发明中，所述促进辣椒疫霉生长发育具体体现在如下中的至少一种：
(a1)维持辣椒疫霉菌丝生长速率；
(a2)减少辣椒疫霉菌丝分枝；
(a3)维持辣椒疫霉孢子囊数量和/或形态；
(a4)维持辣椒疫霉的致病力；
(a5)维持辣椒疫霉孢子侵染结构的形态。
本发明的另一个目的是提供一种核酸分子。
本发明所提供的核酸分子，为序列表中序列2的反向互补序列所示的DNA分子。
含有所述核酸分子(序列2的反向互补序列所示的DNA分子)的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。
含有所述核酸分子(序列2的反向互补序列所示的DNA分子)的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。
所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
在本发明中，所述重组表达载体具体为在pHAM34载体的酶切位点Sma I处反向插入序列表中序列2所示DNA片段后得到的重组质粒。
在本发明中，所述重组菌具体为向目的辣椒疫霉中导入了序列表中序列2的反向互补序列所示DNA片段后得到的重组辣椒疫霉。其中，序列表中序列2的反向互补序列所示DNA片段是以重组载体的形式导入的；所述重组载体具体为在pHAM34载体的酶切位点Sma I处反向插入序列表中序列2所示DNA片段后得到的重组质粒。所述目的辣椒疫霉具体为辣椒疫霉菌株SD33。
所述核酸分子(序列2的反向互补序列所示的DNA分子)或所述重组载体或所述表达盒在如下a1)或a2)中的应用也属于本发明的保护范围：
a1)抑制辣椒疫霉生长发育或制备抑制辣椒疫霉生长发育的产品；
a2)预防和/或治疗辣椒疫病或制备预防和/或治疗辣椒疫病的产品。
在本发明中，所述抑制辣椒疫霉生长发育具体体现在如下中的至少一种：
(b1)降低辣椒疫霉菌丝生长速率；
(b2)增加辣椒疫霉菌丝分枝；
(b3)减少辣椒疫霉孢子囊数量和/或改变孢子囊形态；
(b4)降低辣椒疫霉的致病力；
(b5)改变辣椒疫霉孢子侵染结构的形态(如芽管变短)。
本发明的又一个目的是提供一种抑制辣椒疫霉生长发育的方法。
本发明所提供的抑制辣椒疫霉生长发育的方法，具体可包括对目的辣椒疫霉的所述PcCDP蛋白进行表达抑制的步骤。
在所述方法中，对所述目的辣椒疫霉的所述PcCDP蛋白进行表达抑制可为任何可对PcCDP蛋白进行表达抑制的方法。在本发明中，具体是通过向所述辣椒疫霉中导入序列表中序列2的反向互补序列所示的DNA分子实现对辣椒疫霉中所述PcCDP蛋白进行抑制表达的。所述目的辣椒疫霉具体可为辣椒疫霉菌株SD33。
实验证明，本发明所提供的来源于辣椒疫霉的PcCDP蛋白及其编码基因在辣椒疫霉的自身生长发育过程中起作用，利用CaCl2-PEG介导的原生质体转化技术获得的沉默转化子的生长发育较野生型来说，有着较为明显的变化；通过游动孢子接种离体的辣椒叶片后发现沉默转化子接种的病斑面积明显小于野生型，利用苯胺蓝染色技术研究了侵染过程孢子的发育，也证明了沉默转化子的孢子萌发较晚，且芽管较短。以上结论均为辣椒疫霉的发育过程和分子致病机制的研究提供了一定的帮助。
附图说明
图1为辣椒疫霉PcCDP基因的cDNA的PCR鉴定结果。M：DNA分子量标准；1和2为辣椒疫霉PcCDP基因的cDNA的两个重复。
图2为PcCDP基因在辣椒疫霉不同发育阶段的表达模式分析结果。
图3为RT-PCR分析沉默转化子中PcCDP基因的表达情况(电泳结果)。其中，SPN为作为对照的转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33。
图4为RT-PCR分析沉默转化子中PcCDP基因的表达情况(表达量统计结果)。其中，CK为作为对照的转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33；WT为作为对照的野生型辣椒疫霉菌株SD33。
图5为RT-PCR分析过表达转化子中PcCDP基因的表达情况。。
图6为RT-PCR分析过表达转化子中PcCDP基因的表达情况(表达量统计结果)。其中，CK为作为对照的转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33；WT为作为对照的野生型辣椒疫霉菌株SD33。
图7为相同培养时间和培养温度下培养4天的各菌株的菌落生长状态。
图8为相同培养时间和培养温度下培养4天的各菌株的菌落大小统计结果。
图9为在不同温度相同时间培养6d的各菌株的菌落生长状态。图中A1-D5的标注中，1为15℃黑暗培养，2为20℃黑暗培养，3为25℃黑暗培养，4为30℃黑暗培养，5为35℃黑暗培养；A为对照野生型SD33(WT)，B为SNP对照质粒转化子，C为沉默转化子；D为过表达转化子。
图10为在不同温度相同时间培养6d的各菌株的菌落大小统计结果。A为对照野生型SD33(WT)，B为SNP对照质粒转化子，C为沉默转化子；D为过表达转化子。
图11为沉默及过表达转化子菌丝分枝的扫描电镜结果。a：对照野生型SD33；b：SPN对照转化子；c：沉默转化子；d：过表达转化子。
图12为沉默及过表达转化子中孢子囊产生数量及形态观察结果。A：培养24h孢子囊数量直观图；B：培养36h孢子囊数量直观图；C：培养36h后孢子囊的形态差异直观图；a：对照野生型SD33(WT)；b：SNP对照质粒转化子；c：沉默转化子；d:过表达转化子。
图13为PcCDP过量表达转化子致病性测定和接种发病面积测定结果。A：PcCDP沉默及过表达转化子致病性测定；B：PcCDP沉默及过表达转化子游动孢子接种发病面积测定。a：中叶片右侧为野生型菌株SD33接种；b：中叶片右侧为只转入pHSPN标记质粒的转化子接种；c：为沉默转化子接种；d：过表达转化子接种。
图14为利用苯胺蓝染色对侵染结构的显微观察结果。A为WT，野生型菌株SD33；B为只转入pHSPN标记质粒的转化子；C为沉默转化子，D为过表达转化子。图中所有的标尺均为20μm。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
辣椒疫霉菌株SD33：存放于山东农业大学植物保护学院真菌资源与利用研究室，记载于“冯宝珍.辣椒疫霉(Phytophthora capsici)诱导坏死蛋白基因克隆及功能研究.2011年，山东农业大学.硕士论文”一文，公众可从山东农业大学获得。
pHAM34载体：南京农业大学王源超实验室惠赠，记载于“冯宝珍.辣椒疫霉(Phytophthora capsici)诱导坏死蛋白基因克隆及功能研究.2011年，山东农业大学.硕士论文”一文，公众可从山东农业大学获得。
pHSPN标记质粒：南京农业大学王源超实验室惠赠，记载于“Aining Li,MengZhang,Yonglin Wang,et al.PsMPK1,an SLT2-type mitogen-activated proteinkinase,is required for hyphal growth,zoosporogenesis,cell wall integrity,andpathogenicity in Phytophthora sojae.Fugal Genetics and Biology.65(2014)14-24”一文，公众可从山东农业大学获得。。
实施例1、辣椒疫霉PcCDP基因的克隆
一、辣椒疫霉总RNA的提取
收集辣椒疫霉菌株SD33的菌丝，放研钵内加液氮研磨至粉末状。然后使用试剂盒(QIAGEN RNA Kit)进行RNA提取，具体步骤如下：
(1)称取菌丝样品100mg，液氮速冻。
(2)在预冷的研钵中研磨成细粉，转移到2ml离心管中。注意研磨不彻底则会造成严重产量降低。
(3)待液氮挥发(但不能解冻)后，加入450ml提取缓冲液RLT，涡旋混匀，并在56℃温育1～3min。注意：最好在RLT临用前加入1/100体积的14.5Mβ-巯基乙醇，加后保存时间不超过1个月，RLT溶液应在1个月内使用。对于高淀粉含量的材料，可将温度提高到60℃以上防止淀粉结块。
(4)将裂解液加到离心柱(淡紫色柱)上，下接一个2ml收集管，最大转速(10000g)离心2min。如果将裂解液粘稠，可切去吸头顶端，用大口吸头吸取。裂解液通过柱子时被均质化，大部分组织碎片都被截留在柱子表面，只有少部分通过柱子形成沉淀，因此，应小心吸取上清液，转移到另一新离心管，不要吸细胞碎片残渣沉淀。
(5)加入0.5倍体积(225μL)96～100％乙醇，吹打混合均匀。如果裂解液有损失，则相应减少乙醇用量。加入乙醇后，可能会出现沉淀，但对提取无影响。
(6)将混合液全部(包括沉淀675μL)转移到吸附RNA的离心柱(粉红色柱)，下接一个2ml收集管，大于8000g或10000r/min离心15sec。如果混合液体积超过700μL，每次只加700μL到离心柱上，按上述条件离心。弃去管内液体，重复使用收集管。
(7)加入700μL洗脱液，大于8000g或10000r/min离心25sec，弃去收集管。
(8)将离心柱转移到一新的2ml收集管上，加入500μL RPE液，大于8000g或10000r/min离心15sec。弃去管内液体，重复使用收集管。注意：试剂盒提供浓缩的PRE洗脱液，所心使用前必须加入4倍体积的96～100％乙醇，成为工作液。
(9)加入500μL RPE液到离心柱上，最大转速离心2min，干燥离心柱，弃去收集管。残留乙醇会干扰随后的反应，这次离心要保证无乙醇残留。若有乙醇残留，以最大转速离心1min。注意：小心移去离心柱，不要接触管到液体，以防止携带乙醇。
(10)把离心柱连接到一新的1.5ml收集管上，加入20～30μL无RNase水，大于8000g或10000r/min离心1min，洗脱RNA。若RNA产量在20μg以上，用30～50μL无RNase水再洗脱一次。RNA样品存于-20℃或-80℃冰箱。
取出1.5μL RNA样品，于紫外分光光度计检测A260、A280、A230的相对吸收值。纯度较高的RNA的A260/A280应在1.7-2.0之间，A260/A230应在1.8-2.2之间。取出2.0μL RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。首先制备凝胶(1.2％)。称取1.2g琼脂糖，加72ml DEPC处理的水，加热溶化。至胶体凝固后，将RNA样品与5×上样缓冲液按4:1比例混匀备用上样。待溴酚蓝迁移至凝胶长度的2/3～4/5处结束电泳。紫外灯下观察结果。
二、反转录cDNA第一链的合成
取2μg总RNA，按以下体系配置混合液：10×RT Mix 2μL，超纯dNTP(2.5mM each)2μl，Oligo-dT15(10μM)2μL，Quant Reverse Transcriptase 1μL，RNA 2μg，RNase-free ddH2O至20μL。彻底混匀，简短离心，并置于冰上。其中，10×RT Mix、dNTP、Oligo-dT15、QuantReverse Transcriptase和RNase Free ddH2O均为天根生化科技有限公司生产的试剂盒(产品目录号为KR103-04)中的产品。
将反应液混合后，37℃温育60min。加入180μL DEPC处理的ddH2O，稀释至200μL，混匀，稍微离心，保存于-20℃。
三、辣椒疫霉PcCDP基因的克隆
以步骤二获得的辣椒疫霉基因组cDNA为模板，按照下列步骤进行PCR反应。反应体系：5.0μL 10×PCR buffer(Mg2+plus)，4.0μL dNTP(each 2.5mM)，1.0μL正向引物CDP-F(10μM)，1.0μL反向引物CDP-R(10μM)，2.0μL cDNA模板，0.5μL Taq聚合酶，36.5μL ddH2O，共50μL体系；反应程序为：94℃/10min；94℃/1min，58℃/30s，72℃/90s，共35个循环；最后72℃总延伸5min。
正向引物CDP-F：5’-ATGGCTTCTCGTTGTGCTTC-3’(序列2的第1-20位)；
反向引物CDP-R：5’-TTAAAGCGAGAAAAAGCGGC-3’(序列2的第1400-1419位的反向互补序列)。
反应产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳(图1)，可见所得PCR产物大小约为1400bp。回收含有目的条带的条块，将回收产物克隆到pEASY-T3载体上，送北京华大基因公司测序。测序结果显示，所得PCR产物的序列为序列表中序列2所示，将序列2所示基因命名为PcCDP基因，整个序列2即为ORF，编码序列表中序列1所示的蛋白质。
实施例2、PcCDP基因在辣椒疫霉不同发育阶段的表达模式分析
将不同发育阶段(菌丝(MY)、孢子囊(SP)、游动孢子(ZO)、休止孢(C)、萌发的休止孢(CG))的辣椒疫霉菌株SD33的总RNA(提取方法参见实施例1)反转录合成的cDNA为模板，对PcCDP基因进行荧光定量PCR检测。以辣椒疫霉β-Actin、β-Tublin、Ubc基因为内参。具体如下：
反应体系：2.5×realMasterMix 8μL；20×SYBR solution 1μL；正向引物(10μM)0.5μL；反向引物(10μM)0.5μL；cDNA模板2μL；RNase-free dd H2O补足至20μL。其中，2.5×realMasterMix、20×SYBR solution和RNase-free dd H2O为天根生化科技有限公司生产的SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒(产品目录号为FP205)中的产品。
反应程序：95℃预变性2min，然后进行以下循环；94℃变性15sec，58℃退火15sec，72℃延伸30sec，共进行45个循环；最后65-95℃制备溶解曲线。
荧光定量PCR引物如表1所示：
表1 荧光定量PCR引物
每个样品做三个重复，用2-△△Ct法对样本基因进行表达差异相对定量分析。所得结果取经过三个内参基因综合分析得到的结果。
结果如图2所示，目的基因PcCDP在辣椒疫霉菌丝(MY)和孢子囊(SP)阶段的表达量较高，因此将这两个生长发育阶段作为研究重点。
实施例3、辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子和过表达转化子的获得
一、辣椒疫霉PcCDP基因的沉默表达载体和过表达载体的构建
以辣椒疫霉菌株SD33的基因组cDNA为模板，采用引物CDP-SmaI-F和CDP-SmaI-R进行PCR扩增。
CDP-SmaI-F：5’-TCCCCCGGGATGGCTTCTCGTTGTGCTTC-3’(下划线部分为SmaI的识别位点，其后的序列为序列2的第1-20位)；
CDP-SmaI-R：5’-TCCCCCGGGTTAAAGCGAGAAAAAGCGGC-3’(下划线部分为SmaI的识别位点，其后的序列为序列2的第1400-1419位的反向互补序列)。
反应产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，回收含有目的条带的条块，将回收产物克隆到pEASY-T3载体上，送北京华大基因公司测序。测序结果显示，所得PCR产物的序列为“TCCCCCGGG+序列2+CCCGGGGGA”。
采用限制性内切酶SmaI单酶切以上所得PCR产物，胶回收后与经过同样酶切的pHAM34载体相连，送北京华大基因公司测序。
经测序，在pHAM34载体的酶切位点SmaI处正向插入序列表中序列2所示DNA片段的重组质粒即为辣椒疫霉PcCDP基因的过表达载体。
在pHAM34载体的酶切位点SmaI处反向插入序列表中序列2所示DNA片段(即正向插入序列表中序列2的反向互补序列)的重组质粒即为辣椒疫霉PcCDP基因的沉默表达载体。
二、辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子和过表达转化子的获得
采用PEG介导的原生质体转化法制备辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子和过表达转化子。具体步骤如下：
第一步，辣椒疫霉菌株SD33的培养，如下：
(1)将辣椒疫霉菌株SD33在V8固体培养基平板上于25℃黑暗培养4d，从菌落边缘切取直径约5mm的菌丝块10块重新转移到NPB固体培养基上继续在同样条件下培养4d；
(2)从菌落边缘切取10×10mm的菌丝块，与装有50mL液体NPB培养基250mL三角瓶中，每瓶10块菌丝块，共培养三瓶，在25℃、黑暗培养3d。
V8培养基：160ml V8蔬菜汁，1.6g碳酸钙，混匀，4000rpm/min离心10min，取上清，双蒸水定容至1L，分装，高压灭菌20min备用。若制备固体培养基，1L加入15g琼脂粉即可。
NPB培养基：取120g甜青豆与1000ml去离子水中，高压灭菌后用4层纱布过滤，去渣。分别加入K2HPO41g，KH2PO41g，KNO33g，MgSO40.5g，CaCl20.1g，CaCO32g，D-山梨醇5g，D-甘露醇5g，葡萄糖5g，Vitamin stock 2ml以及Trace elements 2ml，加去离子水至1L，充分混匀后用250ml三角瓶分装高压灭菌备用。若制备固体培养基，1L加入15g琼脂粉即可。
第二步，辣椒疫霉的原生质体转化，如下：
转化前配制40％的PEG溶液(配方见表2)，待完全溶解后用0.22μm的细菌过滤器过滤除菌后，放于冰上备用。
表2 40％PEG溶液的配方
(1)用包有双层纱布的烧杯过滤收集菌丝，收集好的菌丝用20mL 0.8M的甘露醇漂洗一次后转移到灭菌的50mL离心管中，再加入35mL 0.8M的甘露醇，在室温下漂洗10min；
(2)配制酶解液，在高温灭菌的烧杯中溶解备用；酶解液的配方如表3。
表3 辣椒疫霉裂解液配方
(3)将漂洗干净的菌丝重新收集加到酶解液中，在室温下酶解40-50min，吸取少量酶解液镜检以观察酶解效果；
(4)用包有两层micra-cloth的50mL烧杯过滤收集原生质体，滤出液倒入50mL灭菌离心管中，4℃1500rpm离心3min，弃上清液；
(5)加入6mL的W5处理液轻轻重悬原生质体，再加入W5处理液至35mL，4℃1500rpm离心4min，弃上清液；
(6)加入6mL的W5处理液重悬原生质体，将原生质体的浓度调至2×106/mL，在冰上放置30min后于4℃，1500rpm离心4min，弃上清液；
(7)加入等体积的MMg处理液重悬原生质体，室温放置10min；
(8)根据原生质体的量取若干只50mL离心管，做好标记，向管中分别加入10μgpHSPN标记质粒和30μg重组质粒(步骤一获得的辣椒疫霉PcCDP基因的沉默表达载体或过表达载体)；
(9)向每只离心管中加1mL原生质体，置于冰上孵育5-10min；
(10)向每只管中分别加入三次580μL的PEG溶液(表2中的40％PEG溶液)，共1.74mL，在加入的过程中轻弹离心管壁，使原生质体和PEG溶液(表2中的40％PEG溶液)混匀，在冰上静置20min；
(11)向每个灭菌的培养皿中加10mL PM培养基，再加入20μL的Amp溶液(浓度为50mg/ml)；
(12)向每个离心管中分别加入2mL PM培养基，轻柔的颠倒混匀，冰上静置2min，再向管中加入8mL PM培养基，轻柔混匀，冰上静置2min；
(13)将离心管中的液体倒入对应的培养皿中，25℃静置培养12-14h；
(14)从培养皿中取一定量液体在显微镜下观察原生质体的重生情况，并将所有液体吸到50mL离心管中，2000rpm离心5min；
(15)弃上清液，使管内培养基剩余5mL左右，加入15mL含有20μg/mL G418的PM固体培养基，倒入培养皿中，在25℃下黑暗培养；
(16)大约在2-3天后，会看到培养基表面有菌丝生长，将菌丝转移到含有相同浓度的V8固体培养基上继续培养；
(17)经过3-4天的培养，菌落初步形成，保存得到的菌丝用于下游的鉴定和分析实验。
实验同时设置向辣椒疫霉菌株SD33中仅转入pHSPN标记质粒的对照。
裂解酶、纤维素酶、甘露醇均购自Sigma-Aldrich公司，货号分别为：L1412、C8546、M1902；
W5处理液：KCl 0.093g，CaCl24.6g，NaCl 2.25g，葡萄糖7.8g加水至250ml，高压灭菌，4℃保存。
MMg处理液：甘露醇18.22g，MgCl2·6H2O 0.76g，0.5M MES(pH5.7)2ml，加水至250ml，然后高压灭菌，4℃保存。
PM培养基：甜青豆120g加入1000ml去离子水中，高压灭菌后用4层纱布过滤，去渣。加入2g CaCO3，加去离子水至1L，充分溶解后用250ml三角瓶分装高压灭菌备用。若制备固体培养基，1L加入15g琼脂粉即可。
三、辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子和过表达转化子的鉴定
将步骤二生长出的转化子经含G418抗性V8固体培养基平板25℃培养再次筛选，之后挑取10-15块转入液体V8培养基中25℃静置培养4d，收集菌丝，参照前文方法提取转化子样品的总RNA。经反转录合成第一链之后，进行荧光定量PCR验证。以辣椒疫霉β-Actin、β-Tublin、Ubc基因为内参，以野生型辣椒疫霉菌株SD33及转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33为对照。具体操作参见实施例2。
每个样品做三个重复，用2-△△Ct法对样本基因进行表达差异相对定量分析。所得结果取经过三个内参基因综合分析得到的结果。
辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子的鉴定结果显示，作为对照的野生型辣椒疫霉菌株SD33及转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33均扩增出目的条带，而辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子几乎见不到目的条带。从辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子中随机选取两个分别记为S14和S61。辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子S14和S61的具体鉴定结果如图3和图4所示，PcCDP沉默转化子的沉默效率约为85.72％。
辣椒疫霉PcCDP基因的过表达转化子的鉴定结果显示，作为对照的野生型辣椒疫霉菌株SD33及转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33均扩增出目的条带，而辣椒疫霉PcCDP基因的过表达转化子扩增所得的目的条带更加清晰，信号更强。从辣椒疫霉PcCDP基因的过表达转化子中随机选取两个分别记为O14和O42。辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子O14和O42的具体鉴定结果如图5和图6所示，PcCDP过表达转化子的过表达效率约为野生型的4.21倍。
实施例4、辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子和过表达转化子的生物学性状分析
一、菌丝生长速率检测
(1)相同培养时间和培养温度
用5×5mm的打孔器打取已经活化好的野生型辣椒疫霉菌株SD33(记为WT)、转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33(记为SPN对照)或实施例3得到的转化子(辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子S61或辣椒疫霉PcCDP基因的过表达转化子O42)菌株1块，置于加有15mL V8固体培养基的9cm培养皿中央，置于25℃黑暗培养4天同一条件下，4天后用尺子测量菌落的延伸直径，每个菌落测量三次取平均值，每个处理重复三次，该实验重复三次。由此得到菌丝生长速率。
结果显示，沉默转化子的菌落直径与对照野生型菌株(WT)、SPN对照转化子相比减小，气生菌丝的长度变短，扩展能力减弱；而过表达转化子的菌落扩展直径肉眼观察并无明显变化，如图7和图8所示。
(2)相同培养时间不同培养温度
用5×5mm的打孔器打取已经活化好的野生型辣椒疫霉菌株SD33(记为WT)、转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33(记为SPN对照)或实施例3得到的转化子(辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子S61或辣椒疫霉PcCDP基因的过表达转化子O42)菌株1块，置于加有15mL V8固体培养基的9cm培养皿中央，置于15℃、20℃、25℃、30℃和35℃黑暗条件下培养6天，6天后用尺子测量菌落的延伸直径，每个菌落测量三次取平均值，每个处理重复三次，该实验重复三次。由此得到菌丝生长速率。
结果显示，在不同培养温度经过相同培养时间6d后，如图9和图10所示，在15℃时，过表达转化子的菌落直径大于对照野生型菌株(WT)、SPN对照转化子；而沉默转化子与对照野生型菌株(WT)、SPN对照转化子相比则无明显变化。而后，随着培养温度的递升，过表达转化子的生长速率与对照野生型菌株(WT)、SPN对照转化子趋于相同，相反沉默转化子的生长速率减缓。
二、菌丝形态的扫描电镜观察
5×5mm的打孔器打取已经活化好的野生型辣椒疫霉菌株SD33(记为WT)、转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33(记为SPN对照)或实施例3得到的转化子(辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子S61或辣椒疫霉PcCDP基因的过表达转化子O42)菌株1块，置于加有15mL V8固体培养基的9cm培养皿中央，置于25℃黑暗培养4天。4天后，切取边缘菌丝，用2.5％(体积分数)戊二醛4℃固定过夜。后用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)漂洗3次，10min/次；之后依次用30％、50％、70％、85％、95％(体积分数)的乙醇梯度洗脱，15min/次；完成梯度洗脱后用100％(体积分数)乙醇脱水3次，15min/次；后进行二氧化碳临界点干燥；干燥后用离子溅射仪喷金；最后进行扫描电镜观察。
结果如图11所示，发现沉默转化子菌丝的分枝较多较短且随着其长短的增加而变细，菌丝顶端变尖；而过表达转化子菌丝的分枝明显少于对照野生型菌株和对照转化子。
三、不同诱导时间孢子囊产生的数量及形态
以野生型辣椒疫霉菌株SD33(记为WT)、转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33(记为SPN对照)和实施例3得到的转化子(辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子S61或辣椒疫霉PcCDP基因的过表达转化子O42)为供试材料。先将在V8固体培养基上培养的各供试材料的菌丝块用V8液体培养基25℃黑暗静置培养5天，用灭菌自来水反复冲洗菌丝3次后，将菌丝浸没于灭菌自来水中，之后与12h、24h、36h和48h显微镜观察。
结果显示，在诱导24h后，野生型菌株(WT)、SPN对照转化子和过表达转化子已经开始产生少量的孢子囊，而沉默转化子无孢子囊产生(图12中A)；再经过12h即共诱导36h后再次观察，发现野生型菌株(WT)、SPN对照转化子和过表达转化子已经产生大量孢子囊，并且有一定数量的游动孢子释放，但是沉默转化子的孢子囊产生数量很少大多呈球形且无游动孢子释放(图12中B)。这说明PcCDP基因的表达量降低会影响辣椒疫霉孢子囊的正常发育和数量，使得其生长阶段发育向后推迟。基于这一点，也能从一定程度上说明沉默转化子侵染寄主的能力减弱了。
另外，在第36h时，野生型菌株(WT)、SPN对照转化子和过表达转化子已经产生大量孢子囊都能产生正常形态的孢子囊，且过表达转化子的孢子囊略大于野生型(WT)和SPN对照转化子；而沉默转化子产生孢子囊大部分呈球形，没有明显的乳突产生，并且数量明显少于野生型(WT)、SPN对照转化子和过表达转化子(图12中C)。
四、致病性的检测
(1)游动孢子悬浮液制备
以野生型辣椒疫霉菌株SD33(记为WT)、转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33(记为SPN对照)和实施例3得到的转化子(辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子S61或辣椒疫霉PcCDP基因的过表达转化子O42)为供试材料，按照如下方法制备各供试材料的游动孢子悬浮液：
营养菌丝阶段样品的获得：将各供试的辣椒疫霉首先移植于15ml V8固体培养基平板上，在25℃生化培养箱内培养4天后，再取15块直径为4mm的菌块移植于盛有20mL V8液体培养基的培养皿中，于25℃黑暗静置培养5天，过滤菌丝，保存于液氮中备用。
产孢子囊菌丝阶段样品的获得：先将营养生长的菌丝块用V8液体培养基25℃黑暗静置培养5天，用灭菌自来水反复冲洗菌丝3-5次后，将菌丝浸没于灭菌自来水中大约3-4h后直至产生大量孢子囊，用镊子将大量产孢子囊的菌丝夹出，用滤纸过滤，保存于液氮中备用。
游动孢子样品的获得：将按照上述方法获得的产孢子囊的菌丝浸没于灭菌自来水中(以刚好浸没菌丝为宜)，每隔1d换水直到产生游动孢子；收集游动孢子调节游动孢子浓度至1×105个/mL。
(2)接种辣椒叶片
选用自交系品种的辣椒(5-6叶期)叶片，选取同龄辣椒植株上的同一叶位辣椒复叶作为试验载体，取新鲜的辣椒复叶，先用0.1％(体积分数)的升汞处理5min，再用75％(体积分数)的酒精冲洗30s，最后用灭菌水冲洗3次，晾干备用。将辣椒叶片置于水琼脂培养皿中，每个叶片接种10μL步骤(1)制备好的游动孢子悬浮液。每个平板放3片叶片，做3次重复实验。每天观察症状并拍照记录。
(3)接种后病斑面积测定
根据廖林仙等(廖林仙,邵孝侯,陈晓峰.圆形与狭长形叶片叶面积计算方法.中国科技论文在线,2009,1-3)报道的圆形与狭长形叶片面积计算方法，采用等效直径近似圆法对接种72h后叶面积进行估算。结果显示，接种48h后具体症状见图13中A所示，接种叶片左侧均为诱导时所用灭菌后的自来水，a中叶片右侧为野生型菌株SD33接种；b中叶片右侧为只转入pHSPN标记质粒的转化子接种；c为沉默转化子接种；d过表达转化子接种。相对于野生型SD33和SPN对照转化子接种后的病斑面积，沉默转化子的发病面积显著减小且坏死程度较轻；过表达转化子的致病性从接种结果上并没有明显增强或减弱(图13中B)。以上结果说明PcCDP基因的表达量下降影响辣椒疫霉侵染结构的正常发育，从而间接降低了辣椒疫霉的致病性。本研究中只用野生型接种和转入pHSPN标记质粒的转化子接种相比较，没无差异，说明该pHSPN标记质粒转化菌体内后并不影响该菌株的致病性。
五、苯胺蓝染色侵染结构的观察
以野生型辣椒疫霉菌株SD33(记为WT)、转化pHSPN标记质粒的辣椒疫霉菌株SD33(记为SPN对照)和实施例3得到的转化子(辣椒疫霉PcCDP基因的沉默转化子S61或辣椒疫霉PcCDP基因的过表达转化子O42)为供试材料，按照步骤四的方法制备各供试材料的游动孢子悬浮液(1×105个/mL)。
选用自交系品种的辣椒(5-6叶期)叶片，选取同龄辣椒植株上的同一叶位辣椒复叶作为试验载体，取新鲜的辣椒复叶，先用0.1％(体积分数)的升汞处理5min，再用75％(体积分数)的酒精冲洗30s，最后用灭菌水冲洗3次，晾干备用。将辣椒叶片置于1.5ml离心管中，把诱导好的游动孢子悬浮液加入离心管中至刚好浸没叶片。浸泡接种2h、6h、10h、12h后，取出辣椒叶片，用0.1％(0.1g/100ml)的苯胺蓝染色，室温静置2h，2h后取出，用脱色液冲洗三次，放入50％(体积分数)甘油中封片，镜检。
结果如图14所示，当侵染进行2h时，将侵染叶片固定并观察，发现沉默转化子的游动孢子侵染结构较晚产生，随着时间的推移6h、10h和12h，其侵染速度一直小于对照野生型菌株(WT)和SPN对照转化子；过表达转化子产生游动孢子的侵染过程无明显加快或减慢现象发生。

Claims (11)

1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子是编码权利要求1所述蛋白质的基因；所述基因是序列表中序列2所示的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。
5.权利要求1所述的蛋白质，或权利要求2或3所述的核酸分子，或权利要求4所述的重组载体或表达盒在促进辣椒疫霉生长发育或制备促进辣椒疫霉生长发育的产品中的应用。
6.核酸分子，为序列表中序列2的反向互补序列所示的DNA分子。
7.含有权利要求6所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌。
8.权利要求6所述的核酸分子在如下a1）或a2）中的应用：
a1）抑制辣椒疫霉生长发育或制备抑制辣椒疫霉生长发育的产品；
a2）预防和/或治疗辣椒疫病或制备预防和/或治疗辣椒疫病的产品。
9.权利要求7所述的重组载体或表达盒在如下a1）或a2）中的应用：
a1）抑制辣椒疫霉生长发育或制备抑制辣椒疫霉生长发育的产品；
a2）预防和/或治疗辣椒疫病或制备预防和/或治疗辣椒疫病的产品。
10.一种抑制辣椒疫霉生长发育的方法，包括对目的辣椒疫霉中的权利要求1所述蛋白质进行表达抑制的步骤。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：对所述目的辣椒疫霉的权利要求1所述蛋白质进行表达抑制是通过向所述辣椒疫霉中导入权利要求6所述核酸分子实现的。
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