CN108866041A - 一种番石榴叶际微生物基因组dna的提取方法 - Google Patents

一种番石榴叶际微生物基因组dna的提取方法 Download PDF

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Abstract

一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠，震荡后超声处理，离心得到含叶际微生物的混合液；(2)向含叶际微生物的混合液再加TENP溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；(3)向上清液a中加入氯仿与异戊醇，离心得到沉淀b与上清液b；(4)向上清液b中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；(5)将沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。本发明方法简单、提取率高，具有广阔的市场应用前景。

Description

一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种植物叶际微生物基因组DNA的提取方法。
背景技术
植物地上部分(包括叶、茎、花、果等)作为一个独立的微环境，其表面和内部通常栖息着大量的各种类型的微生物。这种植物的地上部分称为叶际(phyllosphere)，这些在叶际上生存并可以定居和增殖的微生物群体称为叶际微生物(epiphytes)。长期以来，对植物叶际微生物的研究主要是集中在植物病原微生物的行为和控制方面，很多植物病原菌已经得到纯培养，也有许多专性寄生的病原菌在活体植物上得到了保存。但是对植物叶际微生物的研究远远落后于植物根际微生物，对那些尚未培养的微生物以及非病原叶际微生物的特性了解甚少。近年来的研究表明，叶际微生物中不仅有阻碍植物生长、发育的病原微生物，还有相当一部分的非病源微生物，它们起着重要的生态功能。如：促进植物的生长发育、抵御病害微生物、改变植物表面特性、生物固氮、降解有机污染物等。发挥这些重要作用的基础是这些叶际微生物产生的丰富多样的次生代谢产物，它们具有多种生物活性，在农业、环保和医药业中具有重要的应用潜力。鉴于此，有关植物叶际微生物的研究引起了世界上许多国家的重视。
高质量的DNA是分子生物学关键的一步，是进行分子标记、基因组文库构建、亲缘关系分析等分子生物学研究的基础。植物叶际微生物DNA提取的方法多种多样，针对不同植物材料的特点，高质量DNA提取的方法也不尽相同。
番石榴属桃金娘科番石榴属植物。番石榴果形状有球形、椭圆、卵圆形及洋梨形，果皮普通为绿色、红色、黄色，果肉有白色、红色、黄色等，其肉质非常柔软，肉汁丰富，味道甜美，可溶性固形物含量为8％-11％，富含大量的钾、铁、胡萝卜素等物质，营养极其丰富，是养颜美容、减肥的最佳水果。其果实不但可以鲜食，还可以加工为果汁、果酱、果脯，同时还可制作成盆景，具有广阔的市场前景，是目前港澳台和东南亚地区最畅销的水果之一。另外，番石榴叶片和幼果切片晒干泡茶喝，可辅助治疗糖尿病。
因此，提供一种简单、有效的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，对番石榴叶际微生物分子生物学方面的研究具有非常大的帮助。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供简单、提取高的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠(粒径为1-4mm)，在可调漩涡混匀器上震荡，高强度漩涡震荡后进行超声处理后，离心去除番石榴叶片后得到含叶际微生物的混合液；
(2)向步骤(1)中得到的含叶际微生物的混合液再加TENP溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；SDS缓冲液的作用在于破坏蛋白质与DNA的结合，使DNA释放出来；
(3)在步骤(2)中得到的上清液a中加入氯仿与异戊醇的混合溶液，静置后离心得到沉淀b与上清液b；氯仿与异戊醇的混合溶液的作用在于去除蛋白质等物质；
(4)在步骤(3)中得到的上清液b中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；PEG8000沉淀剂可与DNA发生共沉淀作用，可以得到纯化DNA；冷冻保存更利于沉淀c与上清液c的分离；
(5)将步骤(4)中得到的沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA；乙醇用于对DNA进行漂洗，使残留杂质溶于乙醇，以进一步净化DNA。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，将步骤(2)中得到的沉淀a代替步骤(2)中的含叶际微生物的混合液再重复步骤(2)至少一次。重复步骤(2)至少一次有利于更多的溶出更多的叶际微生物的DNA。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述磷酸缓冲液的成分包括：137mmoL/LNaCl，10mmoL/LNa2HPO4，2mmoL/L KH2PO4，所述磷酸缓冲液的pH为7.4；所述磷酸缓冲液的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入磷酸缓冲液9-10mL。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述步骤(1)中，番石榴叶片、石英砂、玻璃珠的质量比为4-5：0.5-1：0.4-0.6。采用上述比例的番石榴叶、石英砂与无菌玻璃珠更加有利于将叶片表面的叶际微生物震荡洗脱下来。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述TENP溶液的成分包括：50mM Tris，20mM EDTA，100mMNaCl，0.01g/mLPVP，所述TENP溶液的pH为10；所述TENP溶液的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入TENP溶液250-360uL(更优选的为300uL)。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述冻融处理的条件为：于-20℃下处理18min，再于45℃下处理5min，所述冻融处理的次数不少于3次。反复冻融处理利于叶际微生物破壁，叶际微生物DNA的提取率更高。上述冻融处理的工艺参数利于叶际微生物的充分破壁，可提升最终叶际微生物提取量。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述溶菌酶和蛋白酶K的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入8-12uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/L Tris，100mmoL/L EDTA-2Na，200mmoL/LNaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，所述SDS缓冲液的pH为8。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述氯仿与异戊醇的混合溶液中氯仿与异戊醇的体积比为23-25：1，所述氯仿与异戊醇的混合溶液的加入量为所述上清液a体积的0.8-1.2倍。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述PEG8000沉淀剂的成分包括：体积分数为13％PEG8000，1.6moL/LNaCl，所述PEG8000沉淀剂的加入量为所述上清液b体积的0.8-1.2倍。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述冷冻保存的温度为-80℃，时间为28-33min。
本发明中采用微珠法+超声法+反复冻融法+化学法(破壁酶)相结合的方法，对番石榴叶片的叶际微生物进行洗脱与破壁，上述各步骤之间相互协同作用，可以最大限度的将叶际微生物洗脱下来，并充分破壁，可以大大提升最终叶际微生物基因组DNA的提取量。
上述番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法中，优选的，所述番石榴叶际微生物基因组DNA的浓度检测方法包括以下步骤：将DNA样品稀释后，用紫外分光光度计测定OD260和OD280值，按照1个OD260值相当于50ng/μL和稀释倍数来计算DNA的浓度。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
1、本发明在将番石榴叶片上的叶际微生物分离时，采用石英砂与无菌玻璃珠的联用更加有利于将叶片表面的叶际微生物震荡洗脱下来，并采用冻融处理与酶法处理二者联合对叶际微生物进行破壁处理，最终得到的叶际微生物的DNA的提取率高。
2、本发明的提取方法操作步骤简单、高效，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)将2g番石榴叶片加入4mL磷酸缓冲液，再加0.3g石英砂和0.2g1mm玻璃珠在可调漩涡混匀器上震荡20min，高强度漩涡震荡后超声(20min、300W)处理，离心去除番石榴叶片后得到含叶际微生物的混合液；
(2)再向含叶际微生物的混合液加150uL TENP溶液，-20℃、18min，45℃5min，反复冻融3次后，再加入5uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K，37℃下水浴40min，上下颠倒离心管4次，再加入0.5mL SDS缓冲液，68℃水浴40min，上下颠倒离心管4次，于15℃下，1000rpm离心10min后得到沉淀a与上清液a；用沉淀a代替含叶际微生物的混合液再重复上述步骤一次；其中，TENP溶液的成分包括：50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mLPVP，TENP溶液的pH为10；SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/LTris，100mmoL/L EDTA-2Na，200mmoL/L NaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，SDS缓冲液的pH为8；
(3)在步骤(2)中得到的上清液a中加入与上清液a等体积的氯仿与异戊醇的混合溶液，静置10min后得到沉淀b与上清液b；其中，氯仿与异戊醇的混合溶液中氯仿与异戊醇的体积比为24：1；
(4)在步骤(3)中得到的上清液b中加入与上清液b等体积的PEG8000沉淀剂，-80℃冻存30min后于15℃下，1000rpm离心15min得到沉淀c与上清液c；其中，PEG8000沉淀剂的成分包括：体积分数为13％PEG8000，1.6moL/LNaCl；
(5)将步骤(4)中得到的沉淀c用70％乙醇洗涤1次，冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。
本实施例中，将冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA溶于30uL TE缓冲液中，再于-20℃下保存。
实施例2：
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)与实施例1步骤(1)相同；
(2)再向含叶际微生物的混合液加150uL TENP溶液，-20℃、18min，45℃5min，反复冻融3次后，再加入5uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K，37℃下水浴40min，上下颠倒离心管4次，再加入0.5mL SDS缓冲液，68℃水浴40min，上下颠倒离心管4次，于15℃下，1000rpm离心10min后得到沉淀a与上清液a；用沉淀a代替含叶际微生物的混合液再重复上述步骤两次；其中，TENP溶液的成分包括：50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mLPVP，TENP溶液的pH为10；SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/LTris，100mmoL/L EDTA-2Na，200mmoL/L NaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，SDS缓冲液的pH为8；
(3)与实施例1步骤(3)相同；
(4)与实施例1步骤(4)相同；
(5)与实施例1步骤(5)相同。
本实施例中，将冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA溶于30uL TE缓冲液中，再于-20℃下保存。
实施例3：
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)与实施例1步骤(1)相同；
(2)再向含叶际微生物的混合液加150uL TENP溶液，-20℃、18min，45℃5min，反复冻融4次后，再加入5uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K，37℃下水浴40min，上下颠倒离心管4次，再加入0.5mL SDS缓冲液，68℃水浴40min，上下颠倒离心管4次，于15℃下，1000rpm离心10min后得到沉淀a与上清液a；用沉淀a代替含叶际微生物的混合液再重复上述步骤一次；其中，TENP溶液的成分包括：50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mLPVP，TENP溶液的pH为10；SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/LTris，100mmoL/L EDTA-2Na，200mmoL/L NaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，SDS缓冲液的pH为8；
(3)与实施例1步骤(3)相同；
(4)与实施例1步骤(4)相同；
(5)与实施例1步骤(5)相同。
本实施例中，将冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA溶于30uL TE缓冲液中，再于-20℃下保存。
实施例4：
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)与实施例1步骤(1)相同；
(2)再向含叶际微生物的混合液加150uL TENP溶液，-20℃、18min，45℃5min，反复冻融4次后，再加入5uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K，37℃下水浴40min，上下颠倒离心管4次，再加入0.5mL SDS缓冲液，68℃水浴40min，上下颠倒离心管4次，于15℃下，1000rpm离心10min后得到沉淀a与上清液a；用沉淀a代替含叶际微生物的混合液再重复上述步骤两次；其中，TENP溶液的成分包括：50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mLPVP，TENP溶液的pH为10；SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/LTris，100mmoL/L EDTA-2Na，200mmoL/L NaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，SDS缓冲液的pH为8；
(3)与实施例1步骤(3)相同；
(4)与实施例1步骤(4)相同；
(5)与实施例1步骤(5)相同。
本实施例中，将冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA溶于30uL TE缓冲液中，再于-20℃下保存。
实施例5：
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)与实施例1步骤(1)相同；
(2)再向含叶际微生物的混合液加150uL TENP溶液，-20℃、18min，45℃5min，反复冻融4次后，再加入5uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K，37℃下水浴40min，上下颠倒离心管4次，再加入0.5mL SDS缓冲液，68℃水浴40min，上下颠倒离心管4次，于15℃下，1000rpm离心10min后得到沉淀a与上清液a；其中，TENP溶液的成分包括：50mM Tris，20mM EDTA，100mMNaCl，0.01g/mLPVP，TENP溶液的pH为10；SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/LTris，100mmoL/LEDTA-2Na，200mmoL/LNaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，SDS缓冲液的pH为8；
(3)与实施例1步骤(3)相同；
(4)与实施例1步骤(4)相同；
(5)与实施例1步骤(5)相同。
本实施例中，将冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA溶于30uL TE缓冲液中，再于-20℃下保存。
对比例1：
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)与实施例1步骤(1)相同；
(2)再向含叶际微生物的混合液加150uL TENP溶液，-20℃、18min，45℃5min，反复冻融1次后，再加入5uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K，37℃下水浴40min，上下颠倒离心管4次，再加入0.5mL SDS缓冲液，68℃水浴40min，上下颠倒离心管4次，于15℃下，1000rpm离心10min后得到沉淀a与上清液a；用沉淀a代替含叶际微生物的混合液再重复上述步骤两次；其中，TENP溶液的成分包括：50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mLPVP，TENP溶液的pH为10；SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/LTris，100mmoL/L EDTA-2Na，200mmoL/L NaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，SDS缓冲液的pH为8；
(3)与实施例1步骤(3)相同；
(4)与实施例1步骤(4)相同；
(5)与实施例1步骤(5)相同。
本对比例中，将冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA溶于30uL TE缓冲液中，再于-20℃下保存。
对比例2：
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)与实施例1步骤(1)相同；
(2)再将含叶际微生物的混合液经-20℃、18min，45℃5min，反复冻融4次后，再加入5uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K，37℃下水浴40min，上下颠倒离心管4次，再加入0.5mLSDS缓冲液，68℃水浴40min，上下颠倒离心管4次，于15℃下，1000rpm离心10min后得到沉淀a与上清液a；用沉淀a代替含叶际微生物的混合液再重复上述步骤两次；其中，SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/L Tris，100mmoL/L EDTA-2Na，200mmoL/LNaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，SDS缓冲液的pH为8；
(3)与实施例1步骤(3)相同；
(4)与实施例1步骤(4)相同；
(5)与实施例1步骤(5)相同。
本对比例中，将冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA溶于30uL TE缓冲液中，再于-20℃下保存。
对比例3：
一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，包括以下步骤：
(1)与实施例1步骤(1)相同；
(2)再向含叶际微生物的混合液中加150uL TENP溶液，再加入5uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K，37℃下水浴40min，上下颠倒离心管4次，再加入0.5mL SDS缓冲液，68℃水浴40min，上下颠倒离心管4次，于15℃下，1000rpm离心10min后得到沉淀a与上清液a；用沉淀a代替含叶际微生物的混合液再重复上述步骤两次；其中，TENP溶液的成分包括：50mMTris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mLPVP，TENP溶液的pH为10；SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/L Tris，100mmoL/L EDTA-2Na，200mmoL/L NaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，SDS缓冲液的pH为8；
(3)与实施例1步骤(3)相同；
(4)与实施例1步骤(4)相同；
(5)与实施例1步骤(5)相同。
本对比例中，将冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA溶于30uL TE缓冲液中，再于-20℃下保存。
实施例1-5与对比例1-3中得到的番石榴叶际微生物基因组DNA的浓度的检测方法如下：将DNA样品稀释后，用紫外分光光度计测定OD260和OD280值，按照1个OD260值相当于50ng/μL和稀释倍数来计算DNA的浓度。经测定，实施例1-5与对比例1-3中提取得到叶际微生物DNA的浓度及产量如下表1所示。
表1：实施例1-5与对比例1-3中提取得到叶际微生物DNA的浓度及产量
DNA浓度(ug/uL) DNA产量(ug/g)
实施例1 0.049 5.939
实施例2 0.052 6.31
实施例3 0.053 6.40
实施例4 0.055 6.70
实施例5 0.050 6.09
对比例1 0.047 5.68
对比例2 0.054 6.5
对比例3 0.045 5.52

Claims (10)

1.一种番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将液氮中保存的番石榴叶片加入磷酸缓冲液中，再加无菌石英砂和玻璃珠，在可调漩涡混匀器上震荡，高强度漩涡震荡后进行超声处理后，离心去除番石榴叶片后得到含叶际微生物的混合液；
(2)向步骤(1)中得到的含叶际微生物的混合液再加TENP溶液，反复冻融处理后，加入溶菌酶和蛋白酶K，水浴，再加入SDS缓冲液，水浴，离心处理后得到沉淀a与上清液a；
(3)在步骤(2)中得到的上清液a中加入氯仿与异戊醇的混合溶液，静置后离心得到沉淀b与上清液b；
(4)在步骤(3)中得到的上清液b中加入PEG8000沉淀剂，冷冻保存后离心得到沉淀c与上清液c；
(5)将步骤(4)中得到的沉淀c用乙醇洗涤，离心冷冻干燥后即得到番石榴叶际微生物基因组DNA。
2.根据权利要求1所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，将步骤(2)中得到的沉淀a代替步骤(2)中的含叶际微生物的混合液再重复步骤(2)至少一次。
3.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述磷酸缓冲液的成分包括：137mmoL/L NaCl，10mmoL/LNa2HPO4，2mmoL/L KH2PO4，所述磷酸缓冲液的pH为7.4；所述磷酸缓冲液的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入磷酸缓冲液9-10mL。
4.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中，番石榴叶片、石英砂、玻璃珠的质量比为4-5：0.5-1：0.4-0.6。
5.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述TENP溶液的成分包括：50mM Tris，20mM EDTA，100mM NaCl，0.01g/mLPVP，所述TENP溶液的pH为10；所述TENP溶液的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入TENP溶液250-360uL。
6.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述冻融处理的条件为：于-20℃下处理18min，再于45℃下处理5min，所述冻融处理的次数不少于3次。
7.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述溶菌酶和蛋白酶K的加入量控制为每4-5g番石榴叶片加入8-12uL 100mg/mL的溶菌酶和蛋白酶K。
8.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述SDS缓冲液的成分包括：100mmoL/L Tris，100mmoL/L EDTA-2Na，200mmoL/L NaCl，体积分数为2％PVP，体积分数为2％CTAB，所述SDS缓冲液的pH为8。
9.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述氯仿与异戊醇的混合溶液中氯仿与异戊醇的体积比为23-25：1，所述氯仿与异戊醇的混合溶液的加入量为所述上清液a体积的0.8-1.2倍。
10.根据权利要求1或2所述的番石榴叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，所述PEG8000沉淀剂的成分包括：体积分数为13％PEG8000，1.6moL/L NaCl，所述PEG8000沉淀剂的加入量为所述上清液b体积的0.8-1.2倍。
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