CN101372703A

CN101372703A - 植物叶际微生物基因组dna提取方法

Info

Publication number: CN101372703A
Application number: CNA2007101205117A
Authority: CN
Inventors: 张洪勋; 张保国; 杜方舟; 唐玲; 谷立坤; 白志辉
Original assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Current assignee: Research Center for Eco Environmental Sciences of CAS
Priority date: 2007-08-21
Filing date: 2007-08-21
Publication date: 2009-02-25

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种可用于PCR扩增的植物叶际微生物基因组DNA提取方法。将叶子样品浸泡在灭菌的磷酸盐缓冲液中，经恒温摇床震荡和超声波处理使叶际微生物与植物叶子分离，收集好的菌体用0.1％的焦磷酸钠和洗涤缓冲液分别洗涤，然后依次用适量的溶菌酶、蛋白酶K和SDS处理，裂解细胞使DNA释放出来，最后经氯仿抽提蛋白，异丙醇沉淀即得到高质量的可直接用于PCR扩增的植物叶际基因组DNA。

Description

植物叶际微生物基因组DNA提取方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及植物叶际微生物基因组DNA提取方法。

背景技术

植物地上部分(包括叶、茎、花、果等)的表面和内部存在有大量的各种类型的微生物。这些在叶际生存的微生物称为叶际微生物。这些叶际微生物既有阻碍植物生长、发育的病原微生物，又有拮抗病原物的生防微生物，还有固氮作用和对叶面农药残留有降解作用的微生物，而更多的是尚不明确其生态功能的微生物，因此研究叶际微生物的群落既可以了解叶际微生物的生态功能，又可能筛选出环境友好的微生物资源，为绿色农业的发展和环境保护提供依据，具有重要的理论意义和实际意义。

过去对叶际微生物的研究主要采用传统的培养方法。而基于纯培养的传统方法得到的微生物只占到环境中总微生物数量的0.1-10％，只能获得一小部分微生物群落的信息。最近，一些研究人员利用PCR-DGGE，基因克隆文库技术等分子生物学方法研究不同生境的微生物群落的特征。这些技术都是建立在获得高质量基因组DNA之上的。目前用于提取其它环境中(如土壤、活性污泥、植物根际、水体)基因组DNA方法较多，但是由于利用分子生物学方法对植物叶际微生物的研究在国内外才刚刚起步，因此关于叶际微生物DNA提取的方法还不成熟。叶际微生物基因组DNA的提取是研究叶际微生物的前提和基础，这就需要我们寻找一种快速、有效、经济适用的叶际微生物基因组DNA提取的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对植物叶际微生物这一类特殊样品，提供一种新的、高效、快速，可用于直接PCR扩增的植物叶际微生物基因组DNA提取方法，满足对不同植物叶际微生物群落结构研究的需要。

所述的植物叶际微生物基因组DNA的提取方法，其包括以下步骤：

1、叶际微生物与植物叶片的分离：将植物叶片样品置于三角瓶中，浸泡在灭菌的磷酸盐缓冲液中，缓冲液中加有少量表面活性剂，摇床震荡处理10—30分钟，然后用超声波处理2—8min，使叶片上附生的微生物与叶片分离。

2、菌体收集：从三角瓶中取出植物叶子(无菌操作)，将菌悬液装入无菌的离心管，8000×g离心10分钟收集菌体，弃上清。

3、菌体洗涤：将收集好的菌体用0.1％的焦磷酸钠溶液和洗涤缓冲液分别洗涤两次，最后8000×g离心10分钟收集菌体。

4、菌体裂解释放DNA：将菌体沉淀重悬于裂解缓冲液中，加入溶菌酶至终浓度10mg/mL，37℃水浴处理30分钟，每隔10分钟上下颠倒混匀液体。再加入蛋白酶K至终浓度5mg/mL，37℃水浴处理30分钟，每隔10分钟上下颠倒混匀液体；最后加SDS至终浓度3％，60℃水浴处理2小时，每隔10分钟上下颠倒混匀液体。

5、抽提蛋白：将裂解后的溶液9000×g离心10分钟，取上清，加等体积的氯仿抽提至蛋白层消失，取上层水相。

6、沉淀基因组DNA：向上层水相中加入0.6倍体积异丙醇，—20℃放置2小时或室温过夜，12000×g离心30分钟，收集DNA沉淀。

7、溶解DNA沉淀：DNA沉淀用75％的乙醇洗涤一次，自然干燥，然后用50mL TE缓冲液溶解，并加入1μL浓度为1μg/mL的RNase，即得到高质量、可直接用于PCR扩增的叶际微生物基因组DNA。

所述的植物叶际微生物基因组DNA的提取方法中，其所述第1步中磷酸盐缓冲液的成分为：100mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液，其pH值为7.0；

所述的植物叶际微生物基因组DNA的提取方法中，其所述第1步中超声波的工作频率为40KHz；

所述的植物叶际微生物基因组DNA的提取方法中，其所述第3步中洗涤缓冲液的成分为：0.33mol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，100mmol/NaCl，20mg/mL PVP(聚乙烯吡咯烷酮；

所述的植物叶际微生物基因组DNA的提取方法中，其所述第4步中裂解缓冲液的成分为：100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，1.5mol/L NaCl，1％ CTAB，pH8.0；

所述的植物叶际微生物基因组DNA的提取方法中，其所述第7步中TE缓冲液的成分为：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0；

采用本发明的方法可以得到高质量片断大小大于21kb的植物叶际微生物基因组DNA样品。不需要用试剂盒纯化可直接用于PCR扩增，用作DGGE、SSCP以及基因文库构建等分子生态学研究。

附图说明

附图1是DNA的琼脂糖电泳图谱，其中的Marker是λ噬菌体DNA经HindIII限制型内切酶酶切后的电泳图谱；1-5泳道分别为下面两个实施例的基因组DNA提取实施例的效果图。

附图2是提取的叶际微生物基因组DNA经PCR扩增后实施例的效果图。M为DL2000标准分子量图谱。1-5泳道分别为菠菜叶际DNA、芹菜叶际DNA、黄瓜叶经氯氰菊脂处理后2天、6天和12天的叶际DNA经PCR扩增后电泳图。

以下通过具体实施例详细说明发明的实施，目的在于帮助读者更好地理解本发明的实质，但不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1：

在北京某蔬菜基地分别采集菠菜叶和芹菜叶样品，提取其叶际微生物基因组DNA。分别取10克叶子放入200ml灭菌的磷酸盐缓冲液中，经震荡培养和超声波处理后收集菌体，0.1％焦磷酸钠溶液和洗涤缓冲液洗涤菌体，然后分别经溶菌酶、蛋白酶和SDS裂解，其基因组DNA的提取结果见附图1第1-2泳道。

实施例2：

在北京某蔬菜基地用氯氰菊脂喷洒黄瓜叶子表面，分别取施药后第2天、6天和12天的黄瓜叶子，提取经氯氰菊脂处理后的黄瓜叶子微生物基因组DNA。分别取10克叶子放入200mL灭菌的磷酸盐缓冲液中，经震荡培养和超声波处理后收集菌体，焦磷酸钠和洗涤缓冲液洗涤菌体，然后分别经溶菌酶、蛋白酶和SDS裂解，其基因组DNA的提取结果见附图1第3-5泳道。

通过PCR扩增来验证叶际微生物基因组DNA提取的效果。将提取的总基因组DNA用TE溶解后直接用于16S rDNA V3区的PCR扩增取得了很好的效果，具体实施方案如下：

以提取的基因组DNA为模板，引物为338f(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)与518r(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)扩增16S rDNA V3区的片断。

50μl的PCR反应体系组成如下：模板10ng、每种引物30pmol、dNTPs 1μl(每种10mmol/L)、10×PCR buffer 5μl、MgCl₂ 2mmol/L、Taq DNA聚合酶3U，适量的双蒸水补足至50μl。PCR反应条件为：预变性条件为92℃ 3min，92℃变性1min，55℃退火1min和72℃延伸1min，共30个循环，最后在72℃下延伸10min。PCR反应的产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图2。图2中可以看出扩增的特异性很强，没有杂带，所有提取的DNA都能成功的扩增出目的片断。

Claims

1.一种可直接用于PCR扩增的植物叶际微生物基因组DNA的提取方法，其特征在于，提取步骤包括：将植物叶片样品浸泡在灭菌的磷酸盐缓冲液中，摇床震荡处理10—30min，然后用超声波处理2—8min，使叶片上附生的微生物与叶片分离；离心收集菌体，用0.1％的焦磷酸钠和洗涤缓冲液分别洗涤两次；裂解液中分别加入溶菌酶、蛋白酶K和十二烷基硫酸钠处理，使菌体裂解释放出DNA；然后经氯仿抽提蛋白，异丙醇沉淀即得到高质量的可直接用于PCR扩增的植物叶际基因组DNA。

2.权利要求1所述的植物叶际微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，磷酸盐缓冲液的成分为100mmol/L NaH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液，其pH值为7.0。

3.权利要求1所述的植物叶际微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，洗涤缓冲液的成分为0.33mol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，100mmol/NaCl，20mg/mL聚乙烯吡咯烷酮，其pH值为8.0。

4.权利要求1所述的植物叶际微生物基因组DNA提取方法，其特征在于，分别用溶菌酶和蛋白酶K处理菌悬液各30分钟，溶菌酶和蛋白酶K的终浓度分别为10mg/mL和5mg/mL。