CN107099515B - 一种苹果多酚氧化酶活性促进剂及其应用 - Google Patents

一种苹果多酚氧化酶活性促进剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及酶活性技术领域，特别涉及一种苹果多酚氧化酶活性促进剂及其应用。本发明的苹果多酚氧化酶活性促进剂，包括十二烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基溴化铵与Gemini表面活性剂以重量比为10～2000:1～4比例混合的混合物，所述Gemini表面活性剂为二溴化‑双(二甲基十二烷基)戊二铵或二溴化‑双(二甲基十六烷基)戊二铵。本发明还包括应用上述促进剂提高苹果多酚氧化酶活性的应用，能够将苹果多酚氧化酶的活性提高至240％，且促进剂的用量水平低。

Description

一种苹果多酚氧化酶活性促进剂及其应用
技术领域
本发明属于酶活性技术领域，具体涉及一种苹果多酚氧化酶活性促进剂及其应用。
背景技术
多酚氧化酶是自然界中分布极广的一种金属蛋白酶，普遍存在于植物中，能够将酚或多酚氧化成对应的醌。其在食品、医药及环保行业有着广泛应用，研究其活性可以更好地解决食物储存、植物抵抗病原体及病毒侵害、含酚类有机物工业废水的生物降解等问题。
目前，研究人员多数研究提纯后的多酚氧化酶(PPO)，包括探究酶的最佳活性条件，表面活性剂(十二烷基硫酸钠(SDS))对酶活性的激发等，以达到最大可能提高酶活性的目的。PPO大量存在于植物中，其中苹果中含量丰富，我国苹果种植面积和产量均占世界总量的40％以上，但从苹果中提取的PPO活性较低。
专利CN 105734025 A利用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)提高苹果中PPO粗酶的活性。十六烷基三甲基溴化铵和十二烷基三甲基溴化铵是由一个亲水基和一个疏水基通过化学键连接构成的单链表面活性剂，属于传统的表面活性剂。当CTAB浓度为0.3-1.0mM时，粗酶活性可提高最大为75％左右。当DTAB浓度为15mM时，粗酶活性提高最大为50％。从以上数据可知，传统表面活性剂的用量较多，且对酶活性的调控作用也不够明显。
发明内容
本发明将Gemini表面活性剂与传统单链表面活性剂进行复配，探究了表面活性剂复配体系对多酚氧化酶活性的影响，以期寻找协同效应较好的复配体系，以降低表面活性剂的用量，拓展其应用范围。
本发明的目的在于提供一种能够更大程度提高苹果多酚氧化酶活性的促进剂，及利用该促进剂提高苹果多酚氧化酶活性的应用。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种苹果多酚氧化酶活性促进剂，包括十二烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基溴化铵与Gemini表面活性剂以重量比为10～2000:1～4比例混合的混合物，所述Gemini表面活性剂为二溴化-双(二甲基十二烷基)戊二铵或二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二铵。
优选的，所述苹果多酚氧化酶活性促进剂，包括十二烷基三甲基溴化铵与Gemini表面活性剂以重量比为200～2000:1～4比例混合的混合物，所述Gemini表面活性剂为二溴化-双(二甲基十二烷基)戊二铵或二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二铵。
优选的，所述苹果多酚氧化酶活性促进剂，包括十六烷基三甲基溴化铵与Gemini表面活性剂以重量比为10～100:1～4比例混合的混合物，所述Gemini表面活性剂为二溴化-双(二甲基十二烷基)戊二铵或二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二铵。
本发明还包括采用上述促进剂提高苹果多酚氧化酶活性的应用，提取苹果多酚氧化酶粗酶液，在所述促进剂存在的条件下，以多酚氧化酶为催化剂进行催化反应。
优选的，在所述催化反应体系中，所述促进剂在所述催化反应体系中的浓度分别为：十二烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基溴化铵0.1～20mM，Gemini表面活性剂5～45μM。
优选的，所述催化反应体系中，还包括底物邻苯二酚和溶解所述底物的磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.0～8.0。
优选的，所述催化反应的温度为30℃～50℃。
优选的，所述苹果多酚氧化酶粗酶液提取步骤包括：将冷冻后的苹果在浓度为0.1～0.3M pH为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液中打浆，料液比为1.5～2.0mL/g，将得到的浆液过滤、离心，得到的上清液为苹果多酚氧化酶粗酶液。
优选的，所述磷酸盐缓冲液中还含有体积分数为0.1～0.3％的Triton X-100和质量分数为1～3％的PVPP。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明的苹果多酚氧化酶活性促进剂包括Gemini表面活性剂与传统单链表面活性剂进行复配的混合表面活性剂。Gemini表面活性剂有着优良的物理化学性质：低的临界胶束浓度、超低界面张力、低Krafft点、良好的增溶性等。本发明中的Gemini表面活性剂为二溴化-双(二甲基十二烷基)戊二铵或二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二铵，传统单链表面活性剂为十二烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基溴化铵，将传统单链表面活性剂与Gemini表面活性剂以一定比例复配，得到的促进剂能够将苹果多酚氧化酶的活性提高至240％，且促进剂的用量少，大大提高了表面活性剂的应用范围。
附图说明
图1为DTAB存在下不同浓度的16-5-16对PPO酶活性的影响；
图2为DTAB存在下不同浓度的12-5-12对PPO酶活性的影响；
图3为16-5-16存在下不同浓度的DTAB对PPO酶活性的影响；
图4为12-5-12存在下不同浓度的DTAB对PPO酶活性的影响；
图5为CTAB存在下不同浓度的16-5-16对PPO酶活性的影响；
图6为CTAB存在下不同浓度的12-5-12对PPO酶活性的影响。
具体实施方式
本发明将Gemini表面活性剂与传统单链表面活性剂进行复配，探究了表面活性剂复配体系对多酚氧化酶(PPO)活性的影响，从而得到了一种能够提高苹果多酚氧化酶活性的促进剂。该促进剂为包括十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)或十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)与Gemini表面活性剂以重量比为10～2000:1～4比例混合的混合物，其中，Gemini表面活性剂为二溴化-双(二甲基十二烷基)戊二铵(12-5-12)或二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二铵(16-5-16)。
本发明中，十二烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基溴化铵与Gemini表面活性剂的重量比优选为30～1800:1～4。
本发明中，当十二烷基三甲基溴化铵与本发明的Gemini表面活性剂二溴化-双(二甲基十二烷基)戊二铵或二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二铵复配时，优选十二烷基三甲基溴化铵与Gemini表面活性剂的复配比例，按重量比计，优选为200:1～4，更优选为200:1～3，最优选为200:1～2。
本发明中，当十六烷基三甲基溴化铵与本发明的Gemini表面活性剂二溴化-双(二甲基十二烷基)戊二铵或二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二铵复配时，优选十六烷基三甲基溴化铵与Gemini表面活性剂的复配比例，按重量比计，优选为30:1～4，更优选为30:1～3，最优选为30:1～2。
本发明研究了在30℃、pH为7.0条件下，DTAB存在下0～50μM浓度的16-5-16对PPO酶活性的影响(将表面活性剂浓度为0时的酶活性定义为100％)。由图1可知，当加入15mMDTAB后，随着16-5-16浓度的提高，PPO酶活性提高，16-5-16在体系中的浓度为30μM时活性达到最大，能够将酶活性提高80％。而加入2mM DTAB时，16-5-16浓度于10μM处即能将酶活性提高140％左右，而对于两种组分单独作用于PPO酶，DTAB为15mM时能使酶活性最高提高50％，16-5-16为30μM时可使酶活性最高提升45％，显示出本发明复配体系的优越性。
图2为在30℃、pH为7.0条件下，DTAB存在下0～50μM浓度的12-5-12对PPO酶活性的影响(将表面活性剂浓度为0时的酶活性定义为100％)。由图2可知，当加入2mM DTAB后，12-5-12浓度为20μM时能将酶活性提升75％，而当这两种组分单独存在时，DTAB为15mM时能将酶活性最高提高50％，12-5-12为20μM时能将酶活性最高提高35％，说明DTAB与12-5-12复配之后的优越性。
为了进一步验证该结论，选取特定浓度的Gemini表面活性剂，改变DTAB的浓度，探究两种组分共同作用对PPO酶活性的调控作用，结果如图3和4所示。
图3和4所示为在30℃、pH为7.0条件下，Gemini表面活性剂存在下，0～20mM浓度的DTAB对PPO酶活性的影响(将表面活性剂浓度为0时的酶活性定义为100％)。加入Gemini表面活性剂，在DTAB浓度于2mM时能够大幅度提高酶活性，当加入10μM 16-5-16后酶活性提高了140％；相比于不加Gemini表面活性剂，DTAB最多能够将酶活性提高50％，所需浓度达15mM；相比于不加DTAB，16-5-16最多能够将酶活性提高45％，所需浓度为30μM。对比之下，复配体系将酶活性提高了100％左右。
本发明研究了在30℃、pH为7.0条件下，CTAB存在下0～50μM浓度的16-5-16对PPO酶活性的影响(将表面活性剂浓度为0时的酶活性定义为100％)。由图5可知当分别加入0.3、0.8mM CTAB后，16-5-16提高PPO酶活性的能力得以提高，浓度为10～30μM时酶活性达到最大，将酶活性提升100％，而当这两种组分单独存在时，CTAB为0.3mM时能将酶活性最高提高75％，16-5-16为30μM时能将酶活性最高提高45％，同样也表明本发明复配体系相比于单一组分更具有优越性。
图6所示为在30℃、pH为7.0条件下，CTAB存在下0～50μM浓度的12-5-12对粗酶活性的影响(将表面活性剂浓度为0时的酶活性定义为100％)。当分别加入0.3、0.8mM CTAB后，12-5-12浓度为5μM时活性达到最大，酶活性提升了80％左右，而当这两种组分单独存在时，CTAB为0.3mM时能将酶活性最高提高75％，12-5-12为20μM时能将酶活性最高提高35％。可以发现，CTAB与12-5-12复配后，对PPO酶活性提升作用不明显。
从图5和图6可知，Gemini表面活性剂与CTAB复配体系作用于PPO酶而使酶活性提升程度大小为：16-5-16>12-5-12。为了进一步验证该结论，选取特定浓度的Gemini表面活性剂，改变CTAB的浓度，探究两种组分共同作用对PPO酶活性的调控作用，发现与不加入Gemini表面活性剂相比，CTAB浓度小于0.3mM时加入Gemini表面活性剂能小幅度提高PPO酶活性；然而当CTAB浓度大于0.3mM后，加入16-5-16，酶活性保持稳定；加入12-5-12，酶活性稍有下降。
综上所述，对于PPO粗酶，加入单一的表面活性剂将酶活性提升程度最大如下：DTAB为15mM时可将酶活性提高50％，CTAB为0.3mM时可酶活性提高75％，16-5-16为30μM时可将酶活性提高45％，12-5-12为20μM时可将酶活性提高35％。DTAB(2mM)/16-5-16(10μM)和DTAB(2mM)/12-5-12(20μM)复配体系能将PPO酶活性分别提高140％和75％左右，CTAB(0.3mM)/16-5-16(10μM)和CTAB(0.3mM)/12-5-12(5μM)复配体系分别能将PPO酶活性提高100％和80％左右。
本发明还包括利用上述促进剂提高苹果多酚氧化酶活性的应用。该应用的具体步骤包括：提取苹果多酚氧化酶粗酶液，在所述促进剂存在的条件下，以多酚氧化酶为催化剂进行催化反应。
本发明中，提取苹果多酚氧化酶粗酶液的方法没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的粗酶提取方法即可。在本发明具体实施例中，优选将苹果冷冻后，在磷酸盐缓冲液中匀浆、过滤、离心后得到的上清液为苹果多酚氧化酶粗酶液。
本发明中，优选将苹果切片后进行匀浆。
本发明中，磷酸盐缓冲液的浓度优选为0.1～0.3M，进一步优选为0.2～0.25M。磷酸盐缓冲液的pH值优选为6.0～8.0，进一步优选为7.0。
本发明中，优选磷酸盐缓冲液中还包括TritonX-100和PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)，作为酶活性的稳定剂。
本发明中，优选Triton X-100的体积分数为0.1～0.3％，更优选为0.2～0.25％。
本发明中，优选PVPP的质量分数为1～3％，更优选为2～2.5％。
本发明中，匀浆时的料液比为1.5～2.0mL/g，更优选为1.7～1.8mL/g。
将匀浆后的浆液过滤。本发明对过滤的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的过滤方式即可。在本发明具体实施例中，优选用四层纱布挤压过滤。
将过滤后的滤液进行离心。本发明对离心的方式没有特殊限定，采用本领域技术人员所熟知的离心方式即可。本发明中，优选在4℃下进行离心，离心转速优选为8000～12000rpm，更优选为10000rpm，离心时间优选为20～30min，更优选为25min。离心后得到的上清液即为本发明的苹果多酚氧化酶粗酶液。
本发明的促进剂在对多酚氧化酶进行催化时，促进剂在催化反应体系中的浓度分别为：十二烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基溴化铵0.1～20mM，Gemini表面活性剂5～45μM，更优选为：十二烷基三甲基溴化铵或十六烷基三甲基溴化铵0.3～15mM，Gemini表面活性剂10～40μM。
本发明中，多酚氧化酶催化的底物优选为邻苯二酚，但并非是对本发明的限制。磷酸盐缓冲液用于溶解底物邻苯二酚。优选磷酸盐缓冲液的pH值为6.0～8.0，更优选为7.0。
本发明中，多酚氧化酶的催化温度优选为30～50℃，更优选为30～40℃。
通过加入促进剂，使苹果多酚氧化酶的活性最大提高至240％。
下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、预处理
将山东烟台红富士苹果在清水中洗净，沥干，放置于-20℃冰柜中冷冻12h。
2、粗酶液的提取
将冷冻过的苹果削成片状，称取58.82g，加入100mL磷酸盐缓冲溶液(0.2M，pH＝6.5，含0.25％(v/v)(250μL)TritonX-100和2％(w/w)(3.38g)PVPP)，液料比为1.7mL/g，混合打浆1min，用四层冰纱布过滤，分离出滤液，将得到的滤液在4℃下10000rpm离心10min，取上清液，于-20℃冰柜中储存备用。
3、多酚氧化酶活性的测定
以邻苯二酚为底物，将PPO粗提液稀释25倍加入促进剂进行PPO酶活性的测试。测试体系中，邻苯二酚的浓度为150mM。促进剂为DTAB和16-5-16的复配，其在测试体系中的浓度分别为：DTAB为2.0mM，16-5-16为10μM。测试波长为420nm。
相对于未加促进剂而言，添加促进剂后PPO的酶活力提高140％。
实施例2
促进剂为DTAB和12-5-12的复配，其在测试体系中的浓度分别为：DTAB为2.0mM，12-5-12为20μM。其余与实施例1相同。
相对于未加促进剂而言，添加促进剂后PPO的酶活力提高75％。
实施例3
促进剂为CTAB和16-5-16的复配，其在测试体系中的浓度分别为：CTAB为0.3mM，16-5-16为10μM。其余与实施例1相同。
相对于未加促进剂而言，添加促进剂后PPO的酶活力提高100％。
实施例4
促进剂为CTAB和12-5-12的复配，其在测试体系中的浓度分别为：CTAB为0.3mM，12-5-12为5μM。其余与实施例1相同。
相对于未加促进剂而言，添加促进剂后PPO的酶活力提高80％。
对比例1
促进剂为DTAB，其在测试体系中的浓度为15mM，其余与实施例1相同。
相对于未加促进剂而言，添加促进剂后PPO的酶活力提高50％。
对比例2
促进剂为CTAB，其在测试体系中的浓度为0.3mM。其余与实施例1相同。
相对于未加促进剂而言，添加促进剂后PPO的酶活力提高75％。
对比例3
促进剂为16-5-16，其在测试体系中的浓度为10μM。其余与实施例1相同。
相对于未加促进剂而言，添加促进剂后PPO的酶活力提高20％。
对比例4
促进剂为12-5-12，其在测试体系中的浓度为20μM。其余与实施例1相同。
相对于未加促进剂而言，添加促进剂后PPO的酶活力提高35％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种苹果多酚氧化酶活性促进剂，其特征在于，由以下组分构成：
2mM十二烷基三甲基溴化铵，5μM～25μM二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二铵；
或15mM十二烷基三甲基溴化铵，35μM～45μM二溴化-双(二甲基十六烷基)戊二铵；
或2mM十二烷基三甲基溴化铵，20μM二溴化-双(二甲基十二烷基)戊二铵。
2.采用权利要求1所述促进剂提高苹果多酚氧化酶活性的应用，其特征在于，包括以下步骤：提取苹果多酚氧化酶粗酶液，在所述促进剂存在的条件下，以多酚氧化酶为催化剂进行催化反应。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述催化反应体系中，还包括底物邻苯二酚和溶解所述底物的磷酸盐缓冲溶液，所述磷酸盐缓冲溶液的pH值为6.0～8.0。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述催化反应的温度为30℃～50℃。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述苹果多酚氧化酶粗酶液提取步骤包括：将冷冻后的苹果在浓度为0.1～0.3MpH为6.0～8.0的磷酸盐缓冲液中打浆，料液比为1.5～2.0mL/g，将得到的浆液过滤、离心，得到的上清液为苹果多酚氧化酶粗酶液。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液中还含有体积分数为0.1～0.3％的TritonX-100和质量分数为1～3％的交联聚乙烯吡咯烷酮。
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