PT102306B

PT102306B - Meio de cultura para a deteccao e identificacao de leveduras dos generos dekkera e brettanomyces

Info

Publication number: PT102306B
Application number: PT102306A
Authority: PT
Inventors: Nuno Miguel Sousa Fa Rodrigues; Maria Da Graca Alves Goncalves; Virgilio Borges Loureiro
Original assignee: Stab Tratamento De Aguas E Bio; Inst Superior Agronomia
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2002-01-30
Also published as: NZ515656A; EP1185686A1; DE60022035D1; EP1185686B1; AU777883B2; CN1367843A; AU5116400A; WO2000073495A1; CA2377144A1; PT102306A; BR0011117A; JP2003501048A; ZA200109750B; ATE302284T1

Description

Descrição:

Meio de cultura para a detecção e identificação de leveduras dos géneros Dekkera e Brettanomyces

A presente invenção refere-se a um meio de cultura parcialmente selectivo e totalmente diferencial para a detecção de leveduras dos géneros Dekkera e Brettanomyces em cerca de 5 a 10 dias, que constitui uma alternativa às laboriosas técnicas clássicas de identificação. Normalmente, o estudo e caracterização da microflora de leveduras presentes nos mais diversos habitats (e.g. bebidas, alimentos, natureza) envolve uma primeira fase de isolamento das estirpes através de meios de cultura genéricos, para leveduras em geral, e uma segunda fase de identificação das estirpes isoladas através da utilização de métodos convencionais e/ou baseados na biologia molecular. O crescimento lento das leveduras dos géneros Dekkera e Brettanomyces toma extremamente difícil o seu isolamento em meios genéricos e, por conseguinte, a sua posterior identificação. Esta é feita através dos métodos clássicos que se baseiam numa série de características morfológicas e sexuais e incluem uma vasta gama de testes fisiológicos e bioquímicos. Trata-se de um trabalho muito exigente que não dá resultados em menos de uma a duas semanas e requer muita experiência para uma conecta interpretação dos resultados. Os métodos de identificação baseados na biologia molecular são mais rápidos que os clássicos mas também exigem experiência do operador, equipamentos e reagentes dispendiosos e as sondas ou iniciadores moleculares necessários à identificação.

O meio de cultura a que se refere a invenção obvia grande parte dos problemas verificados nos meios genéricos de uso conente, nomeadamente a competição de espécies de leveduras de crescimento mais rápido, como as dos géneros Kloeckera, Hanseniaspora, Pichia e das espécies Schizosaccharomyces pombe e Torulaspora delbrueckii. Porém, permite o crescimento de outras espécies de leveduras, como por exemplo Saccharomyces unisporus, Zygosaccharomyces fermentati, Candida tropicalis, Lodderomyces elongisporus, Debaryomyces hansenii, Debaryomyces polimorphus, Kluyveromyces marxianus, Yarriowia lipolytica, Zygosaccharomyces florentinus e Zygosaccharomyces microellipsoides, embora sem a produção do cheiro a 4-etil-fenol e, nalguns casos, sem a mudança de cor do indicador. O meio assegura resultados num prazo compreendido entre os 5 e 10 dias após a inoculação, e é constituído por “Yeast Nitrogen Base”, cicloheximida, ácido p-cumárico, verde de bromocresol, etanol e agar.

Este meio não é autoclavável na totalidade, devendo a sua esterilização ser realizada do seguinte modo: cerca de 4/5 do volume total de água é esterilizado em autoclave, a 121°C durante 20 minutos, juntamente com o agar, tendo sido ajustado previamente o pH a 5,4 ±0,05 com um ácido forte. No volume restante de água são dissolvidos os outros componentes do meio e acertado o pH a 5,4 ±0,05 com um ácido forte. Esta solução é esterilizada por filtração. As duas soluções são misturadas só após o arrefecimento da solução de agar até cerca de 50°C.

De acordo com a invenção. As células são inoculadas neste meio e incubadas, preferencialmente, a 25°C. Ao fim de 5 a 10 dias, de acordo com o estado fisiológico das células, surgem as colónias e verifica-se a mudança de cor do meio de cultura de azul a amarelo. No caso das leveduras pertencerem aos género Dekkera e Brettanomyces será reconhecível o aroma fenolado do 4-etil-fenol, que é uma característica destes géneros. A mudança de cor das colónias de creme para verde é também uma característica destes géneros no meio em causa, observação que não se verifica para as restantes espécies.

A presente invenção pode ser aplicada directamente a suspensões mistas de leveduras, dando indicações sobre a presença destes géneros, sempre que se verifique o aroma fenolado no meio de cultura. Pode ainda ser aplicada a estirpes previamente isoladas e purificadas, não havendo, neste caso, necessidade do meio de cultura conter etanol e cicloheximida. A mudança de cor e a produção do cheiro fenolado surgirão, então, mais precocemente.

O processo de acordo com a presente invenção será ilustrado, seguidamente, através de exemplos:

Exemplo 1

O meio de cultura contendo 6,7 g/L de “Yeast Nitrogen Base”, 0,01 g/L de cicloheximida, 0,1 g/L de ácido p-cumárico, 0,022g/L de verde de bromocresol, 48g/L de etanol e 20g/L de agar, devendo o pH do meio ser acertado a 5,40± 0,05 com um ácido forte. O meio é esterilizado do seguinte modo: cerca de 4/5 do volume total de água é esterilizado em autoclave, a 121°C durante 20 minutos, juntamente com o agar, tendo sido ajustado previamente o pH a 5,4 ±0,05 com um ácido forte. No volume restante de água são dissolvidos os outros componentes do meio e acertado o pH a 5,4 ±0,05 com um ácido forte. Esta solução é esterilizada por filtração. As duas soluções são misturadas só após o arrefecimento da solução de agar até cerca de 50°C. O meio homogeneizado é distribuído por placas de Petri. As estirpes de leveduras a identificar, previamente purificadas, são inoculadas neste meio, sob a forma de riscado ou de uma simples risca, e incubadas a 25°C. Todas as estirpes em que, no máximo após 10 dias de incubação, o meio muda de cor para amarelo e possui o cheiro fenolado, pertencem aos géneros Dekkera e Brettanomyces. A cor creme das colónias de leveduras destes géneros evolui para verde.

Exemplo 2

Como o anterior, mas aplicado a suspensões mistas de células de leveduras. Neste caso, para inocular, espalha-se uma alíquota da suspensão sobre o agar. Os resultados são similares aos descritos no exemplo 1, permitindo detectar a presença de leveduras dos géneros Dekkera e Brettanomyces.

Exemplo 3

Como o anterior, mas sem a adição de agar. Neste caso o meio é totalmente esterilizado por filtração e aplica-se a técnica do Número Mais Provável, utilizando-se em amostras onde seja previsível a presença de fungos filamentosos. Nesta situação verifica-se a mudança de cor azul do meio líquido a amarelo e a produção do aroma fenolado.

Exemplo 4

Como o exemplo 1, mas aplicado a suspensões mistas de bactérias e de leveduras. Os procedimentos e os resultados são idênticos aos do exemplo 1, mas o meio de cultura necessita de cloranfenicol e/ou oxitetraciclina para inibir o crescimento das bactérias.

Exemplo 5

Como o exemplo 3, mas aplicado a suspensões mistas de bactérias e de leveduras. Os procedimentos e os resultados são idênticos aos do exemplo 3, mas o meio de cultura necessita de cloranfenicol e/ou oxitetraciclina para inibir o crescimento das bactérias.

Exemplo 6

Como o exemplo 1, mas em que, ao invés de se inocular células de meio sólido se inoculam suspensões de células de uma estirpe. Os procedimentos para a inoculação é idêntico ao descrito no exemplo 2 e os resultados são idênticos aos descritos no exemplo 1.

Lisboa, 26 de Maio de 1999

Os requerentes

Claims

I^a

Meio de cultura selectivo e diferencial, caracterizado pelo formulário seguinte: 6,7 g/L de “Yeast Nitrogen Base”, 0,01g/L de cicloheximida, O,lg/L de ácido p-cumárico, 0,022g/L de verde de bromocresol, 48g/L de etanol e 20g/L de agar, devendo o pH do meio ser acertado a 5,40+ 0,05 com um ácido forte.
2^a

Meio de cultura selectivo e diferencial de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto das leveduras dos géneros Dekkera e Brettanomyces, quando crescidas neste meio, mudarem a cor do meio de azul a amarelo e produzirem compostos voláteis de aroma fenolado e sui-generis ao fim de 5 a 10 dias, constituindo um método para o despiste expedito de leveduras destes géneros.
3^a

Meio de cultura selectivo e diferencial de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um método para a identificação expedita de leveduras dos géneros Dekkera e Brettanomyces, pelo facto das leveduras destes géneros produzirem ácido acético, que muda a cor do meio de azul para amarelo, e 4-etil-fenol, que tem um aroma fenolado e sui-generis, facilmente reconhecível pelo olfacto.
4^a

Meio de cultura selectivo e diferencial de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter 0.1 g/L de cloranfenicol e/ou 0,1 g/L de oxitetraciclina, para detectar e identifcar leveduras dos géneros Dekkera e Brettanomyces em bebidas, alimentos ou outros produtos contendo populações mistas de leveduras e bactérias.
5^a

Meio de cultura selectivo e diferencial de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por conter todos os componentes à excepção do agar, para detectar e identificar leveduras dos géneros Dekkera e Brettanomyces em bebidas, alimentos ou outros produtos contendo populações mistas de leveduras, bactérias e fungos.
6^a

Meio de cultura de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado pelo facto de poder vir a integrar uma galeria de identificação, juntamente com outros testes para identificação de leveduras.