JP2003501048A - デケラ及びブレタノミセス検出用培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、デケラ属及びブレタノミセス属に属するイーストの検出及び計数のためのジェネリックな培地及び前記培地を使用する前記イーストの検出及び計数方法を提供する。本発明によれば、該方法は、基礎となるイースト培地に、非発酵性エネルギー源、特にエタノール、前記イースト属によってもっぱら産生される芳香族化合物促進サブストラクトとしてp-クマル酸、酸-塩基指示薬、特にブロモクレゾールグリーン、イースト増殖抑制剤抗生物質、特にシクロヘキシミド、及び細菌増殖抑制抗生物質、特にクロラムフェニコール及び／又はオキシテトラサイクリンを添加することを含む。デケラ属及びブレタノミセス属のイーストが前記培地で培養される場合、発生した群体は特有の色を示し、培地の色はｐＨの減少による再現性のあるパターンに従って変化し、特有のフェノールのような芳香が発生し、数日間のインキュベーション後の香りによって容易に検出され、その検出及び計数を可能にする。本発明は、食品及び飲料産業においてデケラ属及びブレタノミセス属に属するイーストの検出及び計数に有用であり、イースト識別ギャラリー内のその包含を許容する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 説明 発明の目的 本発明は、その調製品中にエタノール及びp-クマル酸を含む、デケラ（Dekker
a）属及びブレタノミセス属の食品及び飲料混入物イーストの差別検出及び計数
（enumeration）のための培地に関する。また、本発明の目的はデケラ属及びブ
レタノミセス属のイーストの差別検出及び計数のための前記培地を使用する方法
である。本発明の別の目的はイースト識別ギャラリー（yeast identification g
allery）における前記培地の使用である。 本発明の目的は食品及び飲料産業に単離及び差別検出が可能である培地及び培
地とそこに発育した群体の色変化、及びフェノールのような特徴的な芳香の発生
によって、前記培地及びデケラ属及びブレタノミセス属の多くのイーストを使用
する方法を提供することにある。

【０００２】 技術の状況 多くの異なる環境（例えば、飲料、食品、天然サブストラクト（substracts）
）に存在するイーストミクロフローラの研究及び特徴付けは、通常、ジェネリッ
クなイースト培地（generic yeast culture media）における第一菌株（first s
train）の単離及び精製段階を含み、その培地は古典的な分類学的方法又は分子
生物学ベースの方法によって第二識別（second identification）段階を伴う。
これらのイーストが共存するより速く発育するものと遭遇するために、デケラ属
及びブレタノミセス属のイーストの遅い発育は、共通して使用される培地におけ
るその単離を非常に困難にしている。この事実は、その検出及び計数、同様に食
物及び飲料におけるそれらのより遅いものの識別を、むしろ困難にし、このこと
は、通常、非常に遅く、集中的な作業及び古典的技術を要求する専門的技術の使
用、又は市場において常に迅速に入手可能であるとは限らない高価な反応物、分
子プローブ又はプライマー、及び熟練した技術者の使用を含む分子生物学的方法
を通して達成される。

【０００３】 これらのイーストがワイン-“ウマの汗（horse sweat）”-特にオーク樽で熟
成されるものにおいて重大な官能検査の異常の生成に関わることをどの疑いを超
えても証明することは可能であった（Chatonnetら 1992, J. Sc. Food Agric., 60 , 165-178）。それ以来、ワインにおけるそれらの検出及び計数が必要となり
、その影響についての迅速な方法の開発の必要性が生じた。この分野の文献は、
シクロヘキシミドに対するこの種の抵抗及びそれらの酸性化能力に基づいて、デ
ケラ属及びブレタノミセス属のイーストの検出及び計数のための好適な方法を開
示する（Chatonnetら 1992, J. Sc. Food Agaric., 60, 165-178; Fugelsang, K
.ら 1993. Ed. Barry H. Gump. ACS Symposium series 536, American Chemical
Society, Washington. Cap. 7, 110-119; Alguacil, M.ら 1998. Aliment. Equ
ipos Tecnol, 10, 81-85）。しかし、開示された培地は早く発育する種の成長を
防止するのに十分に選択的でなく、また完全に差別的ではないために、それらは
完全に満足できるものではなかった。 従って、デケラ属及びブレタノミセス属のイーストの簡易迅速な識別のための
培地及び方法の現実の、かつ有効な必要性、すなわち、デケラ属及びブレタノミ
セス属のイーストの単離、差別検出及び計数のための迅速な方法を食品及び飲料
産業に提供することが存在する。

【０００４】 発明の記載 驚いたことに、デケラ属及びブレタノミセス属のイーストの増殖のためにエタ
ノール及びp-クマル酸を含む培地を用いる場合、これらが、5〜12日間のインキ
ュベーション後、その他のイーストと比較して、特有の限られた形態で4-エチル
フェノール及び酢酸を生成することがわかった。さらに、通常、デケラ属及びブ
レタノミセス属のイーストと共存し、はるかに速い発育がそれらの検出を許さな
いその他のイースト種が選択的に抑制される。 本発明によれば、培地が開発され、その培地はデケラ属及びブレタノミセス属
のイーストについて部分的に選択的であり、かつ、完全に差別的であり、その特
有の芳香による4-エチルフェノールの検出、及びエタノール及びp-クマル酸含有
培地で発育させた場合、それらのイーストによって生成される酢酸の適切な酸-
塩基の色変化による検出に基づく。

【０００５】 従って、本発明は、デケラ属及びブレタノミセス属の食品及び飲料混入物イー
ストの差別検出及び計数のための培地に関する。該培地は、栄養基礎培地（nutr
ient base）、非発酵性エネルギー源として及びその他のイースト種を抑制する
エタノール、該イースト種によって生成される芳香族化合物促進サブストラクト
としてp-クマル酸、その転換点が酸性領域にある酸-塩基指示薬（特にブロモク
レゾールグリーン）、多くのイースト種を抑制する抗生物質（特にシクロヘキシ
ミド）、及び培地が固体形状での使用を目的とする場合の寒天を含む。 本発明の培地の実施態様において、栄養基礎培地は“酵母窒素源基礎培地（Ye
ast Nitrogen Base）”であり、酸-塩基指示薬はブロモクレゾールグリーンであ
る。 他の実施態様において、本発明の培地は、さらに細菌の増殖阻害物質、特にク
ロラムフェニコール及び／又はオキシテトラサイクリンを含み、個体群を含む混
合した細菌内でのデケラ属及びブレタノミセス属のイーストの検出に特に有用で
ある。

【０００６】 本発明の目的の培地は、液体形態の場合、滅菌濾過によって調製され、次いで
適切な試験管に分配される。培地が固体形態で求められる場合、寒天が脱塩水に
溶解され、次いでオートクレーブで滅菌され、滅菌及び約50℃への冷却に続いて
、予め滅菌濾過されたその他の成分が無菌状態で添加される。両方の培地のｐＨ
は、滅菌前に、使用する酸-塩基指示薬に依存するｐＨ値へ調整される。混合物
は均質化され、ペトリ皿に注がれ、凝固後培地は使用のために用意される。

【０００７】 また、本発明は、上記のように特徴付けられ、部分的に選択的で、かつ、完全
に差別的な培地を用いる、デケラ属及びブレタノミセス属のイーストの検出及び
計数のための方法に関する。 本発明の方法は、本発明の培地を用いる簡単な方法で、デケラ属及びブレタノ
ミセス属のイーストの検出及び計数を可能にする。 本発明によれば、培地は分析下でサンプルと直接接触させて使用され、好適な
希釈は混入物イーストの計数を目的とする場合に使用される。次いで、こうして
播種された培地は、イーストの増殖のための十分な温度で、はっきりと見える群
体の発育のために（固形培地の場合）、又は溶液の濁りのために（液体培地の場
合）充分な時間、通常5〜10日間、インキュベートされる。ペトリ皿のデケラ属
及びブレタノミセス属のイーストの検出は、クリーム色の群体の直接観察、使用
した酸-塩基指示薬のタイプに従った培地の色の変化、及びフェノールのような
特有の芳香の存在によってなされる。インキュベーション時間が長くなれば、群
体はより暗い着色を得る。液体の培地での検出は、培地の色の変化、及びフェノ
ールのような芳香の存在によってなされる。

【０００８】 さらに、それは、いずれの微生物学の培地の製造工場によっても、新しい技術
の使用を必要としないで、便利に、迅速に、かつ容易に再現できる手順である。
一度培地が製造されれば、いずれかの食品及び飲料産業又は品質管理工場による
その使用は、それが微生物学のルーチン分析の担当者以外の特別なオペレーター
を必要としないために、即時的である。 従って、本発明の目的の一つは、食品産業に、単離、特有の群体の生成、培地
の色変化及びフェノールのような芳香の生成によるデケラ属及びブレタノミセス
属のイーストの差別検出及び計数を可能にする手順を提供し、こうして、その単
離後の該イーストの識別の不便さを解消することにあり、目的は上述されるよう
に本発明の培地及び方法を用いて達成される。 このように、本発明の培地の使用は以下のことを可能にする。 a）製造プロセスのすべての工程において、原料から最終製品及び貯蔵製品ま
での食品及び飲料産業におけるデケラ属及びブレタノミセス属のイーストによる
混入物の検出及び識別。 b）食品及び飲料産業におけるこれらのポイントの一つ一つに適した制御基準
（control criteria）を確立するための重要な制御ポイント（critical control
points）の決定。 さらに、本発明の培地はイースト同定ギャラリー（yeast identification gal
leries）に含むために有用である。

【０００９】 発明の好ましい実施態様 好ましい実施態様において、本発明は、栄養基礎培地として“酵母窒素源基礎
培地”、非発酵性エネルギー源としてエタノール、芳香族化合物（4-エチルフェ
ノール）の促進基質としてp-クマル酸、酸性領域中に転換点を有する酸-塩基指
示薬としてブロモクレゾールグリーン、多くのイースト種を抑制する抗生物質（
シクロヘキシミド）、及び細菌増殖抑制物質抗生物質を含むデケラ属及びブレタ
ノミセス属のイーストの差別検出及び計数のための培地に関する。 本発明のこの実施態様において、デケラ属及びブレタノミセス属のイーストを
含むサンプルによる培地播種後、該サンプルはこれらのイーストの予め単離した
サンプルであってもよく、又はイースト及び／又はイーストと細菌の混合サンプ
ルであってもよく、これらのイースト属のために有利な増殖条件下のインキュベ
ーションであってもよく、約5から12日後、識別は青色から黄色への培地の色変
化、クリーム色の群体の発育及び特有のフェノールのような芳香によって可能で
ある。 本発明は、以下の実施例によってさらに具体的に説明され、これら実施例は例
示することのみを目的とし、本発明の範囲を制限することを意味しない。

【００１０】 実施例 実施例１： 本発明の培地の調製 本発明の目的の培地は以下の処方を用いて調製できる（g/L）：栄養基礎培地
として酵母窒素源基礎培地（6.7）、非発酵性エネルギー源及びある種のイース
トの抑制剤としてエタノール（48）、フェノールのような生成芳香サブストラク
トとしてp-クマル酸（0.1）、酸-塩基指示薬として、予めNaOHに溶解したブロモ
クレゾールグリーン（0.222）、ある種のイースト種の抑制剤抗生物質としてシ
クロヘキシミド（0.01）、細菌抑制剤抗生物質としてクロラムフェニコール（0.
1）及び／又はオキシテトラサイクリン（0.1）、及びゲル化剤として寒天（20）
。培地を以下に従って滅菌した：寒天を必要な水全体の70％に溶解し、ｐＨを強
酸で5.4に調整し、得られた溶液を120℃のオートクレーブ中で20分間滅菌した。
その他の成分を残りの脱塩水に溶解し、ｐＨを強酸で5.4に調整し、得られた溶
液を0.22μmの細孔直径の膜を通して濾過により滅菌した。次いで、上記の溶液
の両方を、寒天溶液が50℃に達したときに一緒に混合した。次いで、培地を均質
化し、ペトリ皿に分配し、播種の前にそれを凝固した。

【００１１】 実施例２： ワインにおけるデケラ属及びブレタノミセス属のイーストの検出のための本発明
の目的の培地の使用 この実施例において、変化するのではないかと疑われる2つのワインを実施例
１の培地を用いて分析した。20mlサンプルの各ワインを、0.22μmの細孔直径の
酢酸セルロースの膜を通して、無菌状態下で濾過した。各膜を、本発明の培地を
含むペトリ皿の表面に配置し、25℃でインキュベートした。3日後、一つの皿に
おいて、青色から黄色への培地の色変化とともに、群体を観測することができ、
皿を開放したときに、フェノールのような芳香の存在は検出されなかった。他方
の皿において、群体は3日後においても検出されなかった。9日後、群体が観測さ
れた皿は同じ特性を維持した。他方の皿においては、小さなクリーム色の群体、
青色から黄色への培地の色変化及び特有のフェノールのような芳香を観測するこ
とができた。古典的な識別方法を用いて、フェノールのような芳香を示さない皿
で発育した群体がデケラ属又はブレタノミセス属に属さないことを確認し、同時
にフェノールのような芳香を示した皿の群体がこれらの属に属することを確認し
た。

【００１２】 実施例３： 糸状菌の存在が疑われるワイン中のイーストの計数のための本発明の目的の培地
の使用 ペトリ皿の表面のカビの発育がイースト群体の結果を遮蔽又は抑制できる場合
において、最も有望なナンバー計数方法（the Most Probable Number enumerati
on technique）を使用し、液体培地の試験管を用いた。従って、培地処方物にお
いて寒天を使用せず、濾過により培地を完全に滅菌した。この例において、培地
の曇り、青色から黄色へのその色の変化、及びフェノールのような芳香の存在が
ある場合、デケラ属又はブレタノミセス属のイーストの存在が検出され、従って
、これらの特徴を示すすべての試験管は陽性であるとみなされ、それ以外はすべ
て陰性であるとみなされる。 本発明はその好ましい実施態様に基づいて記載されるが、特許請求の範囲の意
図及び範囲内の変更及び修正が可能であることは、いずれの当業者にとっても明
らかであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，Ｓ Ｅ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 ロウレイロ ヴィルジリオ ボルゲス ポルトガル ペー−1070 リスボア ルア ９ エヌ 13 バイロ ダ カルカダ ドス メストレス (72)発明者 ゴンカルヴェス マリア ダ グラカ ア ルヴェス ポルトガル ペー−2000−647 サンタレ ム ポルテラ ダス パデイラス エヌ ６ アール／セ エスク アール 19 デ マルコ (72)発明者 ロドリゲス ヌノ ミゲル ソウサ ファ ルカン フレイレ ポルトガル ペー−1700−076 リスボア エヌ 158 ２ エスク アヴェニュー ド ブラジル Ｆターム(参考） 4B063 QA01 QQ07 QR47 QR68 QR69 QR90 QS31 4B065 AA72X BB06 BB08 BB37 CA46

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 デケラ属及びブレタノミセス属の食物及び飲料混入物イース
   トの列挙のための異なる培地であって、栄養基礎培地、エタノール、p-クマル酸
   、酸領域中に転換点を有する酸-塩基指示薬、あるイースト種のための抑制剤抗
   生物質を含むことを特徴とし、必要により細菌増殖抑制物質及び寒天を含んでも
   よい前記培地。
2. 【請求項２】 エタノールの存在量が32〜96g/L、好ましくは48g/Lである請
   求の範囲第１項に記載の培地。
3. 【請求項３】 p-クマル酸の存在量が0.05〜1.0g/L、好ましくは0.1g/Lであ
   る請求の範囲第１項に記載の培地。
4. 【請求項４】 栄養基礎培地が、5〜10g/L、好ましくは6.7g/Lの量の“酵母
   窒素源基礎培地”である請求の範囲第１項に記載の培地。
5. 【請求項５】 あるイースト種のための抑制剤抗生物質が、0.004〜0.1g/L
   、好ましくは0.01g/Lの量で存在するシクロヘキシミドである請求の範囲第１項
   に記載の培地。
6. 【請求項６】 ｐＨ指示薬が、約0.022g/Lの量で存在するブロモクレゾール
   グリーンである請求の範囲第１項に記載の培地。
7. 【請求項７】 培地のｐＨが、強酸により4.8〜6.0の範囲、好ましくは5.4
   の値に調整される請求の範囲第６項に記載の培地。
8. 【請求項８】 さらに、細菌増殖抑制物質、好ましくはクロラムフェニコー
   ル及び／又はオキシテトラサイクリンを、約0.1g/Lの量で含み、イースト及び細
   菌の混合した個体群を含む食品及び飲料製品中のデケラ属及びブレタノミセス属
   のイーストを検出及び識別するための請求の範囲第１項に記載の培地。
9. 【請求項９】 寒天を除くすべての成分を含み、イースト、細菌、特に糸状
   菌の混合した個体群を含む食品及び飲料製品中のデケラ属及びブレタノミセス属
   のイーストを検出及び識別するための請求の範囲第１項から第８項のいずれか一
   項に記載の培地。
10. 【請求項１０】 デケラ属及びブレタノミセス属の食品及び飲料混入物イー
    ストの計数のための差別培地であって、以下の組成を有し、培地のｐＨが強酸に
    より4.8〜6.0の範囲、好ましくは5.4に調整されることを特徴とする前記培地：
    5〜10g/L、好ましくは6.7g/Lの“酵母窒素源基礎培地”； 0.004〜0.1g/L、好ましくは0.01g/Lのシクロヘキシミド； 0.05〜1.0g/L、好ましくは0.1g/Lのp-クマル酸； 0.022g/Lのブロモクレゾールグリーン、又は同様の転換点を有する他の酸-塩基
    指示薬； 32〜96g/L、好ましくは48g/Lのエタノール； 0.1g/Lのクロラムフェニコール及び／又は0.1g/Lのオキシテトラサイクリン、及
    び20g/Lの寒天。
11. 【請求項１１】 請求の範囲第１項から第１０項のいずれか一項に記載のデ
    ケラ属及びブレタノミセス属の食品及び飲料混入物イーストの計数のための差別
    培地であって、オートクレーブで滅菌される寒天を除いて、すべての成分の滅菌
    が濾過によって行われ；寒天の冷却後であって、それが凝固する前に、予め濾過
    によって滅菌された培地のすべてのその他の成分のこの溶液への無菌状態下での
    添加；及びそれが凝固するようにペトリ皿へ培地を分配する前記培地。
12. 【請求項１２】 デケラ属及びブレタノミセス属のイーストの検出及び／又
    は識別方法であって、栄養塩基培地、非発酵性エネルギー源、p-クマル酸、酸性
    領域中に転換点を有する酸-塩基指示薬、あるイースト種のための抑制剤抗生物
    質を含み、必要により細菌増殖抑制物質及び寒天を含んでもよい、デケラ属及び
    ブレタノミセス属の食品及び飲料混入物イーストの計数のための差別培地の使用
    による前記検出及び／又は識別方法。
13. 【請求項１３】 請求の範囲第１２項に記載のデケラ属及びブレタノミセス
    属のイーストの検出及び／又は識別方法であって、酸-塩基指示薬がブロモクレ
    ゾールグリーンであり、デケラ属及びブレタノミセス属のイーストを含むサンプ
    ルによる前記培地の播種及び前記イーストの増殖に適した条件で5から12日間の
    インキュベーション後、前記イースト属の列挙を必要とする場合には青色から黄
    色への培地の色変化、及びクリーム色の群体及びフェノールのような芳香の発生
    によって、デケラ属及びブレタノミセス属のイーストの特性の存在を検出できる
    前記検出及び／又は識別方法。
14. 【請求項１４】 請求の範囲第１２項及び第１３項に記載のデケラ属及びブ
    レタノミセス属のイーストの検出及び／又は識別方法であって、食品及び飲料製
    品サンプル内のデケラ属及びブレタノミセス属のイーストの検出及び計数に適用
    する前記検出及び／又は識別方法。
15. 【請求項１５】 その他のイースト識別試験と共に、識別ギャラリー内に包
    含するための請求の範囲第１項から第１１項のいずれか一項に記載の培地の使用
    。
16. 【請求項１６】 産業、特に食品及び飲料産業の品質及びプロセス制御にお
    ける請求の範囲第１項から第１１項のいずれか一項に記載の培地の使用。