JP2003501047A

JP2003501047A - ザイゴサッカロミセスの検出用培地

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Publication number: JP2003501047A
Application number: JP2001500804A
Authority: JP
Inventors: セシリアレアン; マヌエラコルテ−レアル; ドリトシュッラー
Original assignee: ウニヴェルシダーデドミンホ; スタブヴィダ−インヴェスティガカンエセルヴィコスエムシエンシアスビオロジカスリミターダ
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 2000-05-31
Publication date: 2003-01-14
Also published as: EP1185685A1; CA2375111A1; WO2000073494A1; WO2000073494B1; PT102305B; ZA200109748B; NZ515657A; BR0011107A; AU5116300A; CN1367842A; PT102305A

Abstract

(57)【要約】本発明は、ザイゴサッカロミセス・ベイリイ種やザイゴサッカロミセス・ビスポラス種の酵母を検出するための、これらの種の従来の検出に通常関係する時間と作業を大幅に短縮することができる鑑別又は選択培地に関する。本発明によれば、ザイゴサッカロミセス・ベイリイやザイゴサッカロミセス・ビスポラスの検出は、1つの液体培地又は固形培地の調製と接種だけを必要とする1回の試験で行われる。本培地は、微量元素及びビタミンで補足された基礎無機培地、唯一のエネルギー源と炭素源としてグルコースとギ酸、及び酸-塩基指示薬によって構成されている。酸-塩基指示薬、特にブロモクレゾールグリーンによって培地が緑色を呈し、上記酵母の作用のために青色に変わる。更に、コロニーによって示される青色は、これらの種に特異な特徴であり、使用される接種法によって48〜96時間のインキュベーション後に該培地中に見ることができる。本発明は、食品工業、即ち、ワインや他の飲料においてザイゴサッカロミセス・ベイリイ種やザイゴサッカロミセス・ビスポラス種を検出するために、予め単離及び精製した酵母株か又はこれらの種と異なる他の酵母を含有する混合酵母集団の細胞浮遊液と共に使用し得る。該培地は、酵母同定試験のギャラリーに含めることもできる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の目的本発明は、食品の劣化を考える場合に2種類の最も危険な種であるザイゴサッ
カロミセス・ベイリイとザイゴサッカロミセス・ビスポラスの酵母が48時間後に試
料中に検出される、グルコース、ギ酸及び酸-塩基指示薬を含有する鑑別又は選
択培地、及び前記培地を用いてザイゴサッカロミセス・ベイリイとザイゴサッカ
ロミセス・ビスポラスの酵母を検出する方法に関する。本発明は、また、酵母同
定試験のギャラリーのための前記培地の使用に関する。

【０００２】従来の技術の状態食品工業においては、酵母の問題が進行している。しかし、細菌の混入を避け
るために設計された、製品、気圧が変化したパッケージ、及び新しい処方の感覚
受容特性を維持するために弱い保存工程を用いることは、酵母汚染には都合がよ
い。いくつかの病原性酵母種が食品中に検出され、日和見株が一部の集団にとっ
て危険なものとなるが、生じる汚染の基本的な危険は衛生的な本質の危険ではな
く、ザイゴサッカロミセス・ベイリイやザイゴサッカロミセス・ビスポラスのよう
なある種の酵母が食品中にある変質作用にあり、その結果、経済的損失が生じる
。これまでは、最も異なる生息場所(例えば、食品、自然界)に存在する酵母ミク
ロフローラの研究は、慣用的方法及び/又は分子生物学的に基づく方法の使用に
よって、一般選択酵母培地を用いた第1株分離段階、及び分離した株の第2同定段
階を含んでいた。古典的酵母同定法は、一連の栄養特性と有性繁殖特性によるも
のであり、広い範囲の生理的試験と生化学的試験を含んでいる。少なくとも1〜2
週間後にしか結果が出ない厳しい仕事であり、結果を正しく解釈するために多量
の経験が必要である。分子生物学に基づく方法は、一般的には、古典的な方法よ
り速いが、オペレータの多量の経験が必要であり、費用のかかる装置と反応剤が
必要である。

【０００３】ワインの中の酵母を検出するために市販されている培地、即ち、発酵酵母を検
出するために用いられるワラーシュタイン(Wallerstein)実験栄養培地と、乳酸
菌又は酢酸菌、又は非発酵フローラに属している酵母を検出することができるワ
ラーシュタイン実験鑑別培地、WLDがある(いずれもディフコ製)。しかしながら
、これらの従来の技術の培地は、酵母、特にザイゴサッカロミセス・ベイリイ種
を区別することができない。従って、迅速かつ効率よくザイゴサッカロミセス・ベイリイ又はザイゴサッカ
ロミセス・ビスポラスを検出及び同定する培地及び方法、即ち、これらの種を迅
速に検出するための慣用的な手法に代わる手段である培地及び方法が必要とされ
ている。

【０００４】発明の説明驚くべきことに、ザイゴサッカロミセス・ベイリイ又はザイゴサッカロミセス・
ビスポラスの酵母をグルコース、ギ酸及び適合した酸-塩基指示薬を含有する培
地中で生育した場合に培地の色が急速に変化し、少なくとも48時間後に呈色した
コロニーが形成され、それらの変化は前記培地中の前記酵母に特有であり限定的
であることがわかった。また、本発明の培地が、適合した酸-塩基指示薬を含めることによってザイゴ
サッカロミセス・ベイリイとザイゴサッカロミセス・ビスポラスの酵母を区別し、
培地中に存在するギ酸濃度によって前記酵母の発育を選択的にし得ることがわか
った。従って、本発明によれば、ザイゴサッカロミセス・ベイリイ又はザイゴサッカ
ロミセス・ビスポラスの酵母の同定を可能にし、少なくとも48時間インキュベー
トした後に結果が確かめられ、よってこれらの種を迅速に検出するために慣用的
な手法に代わる手段であり、同定に関係する時間と作業の大幅な短縮を可能にす
る、新規な鑑別又は選択培地が開発された。本発明の培地は、ビタミン、微量元素、唯一の炭素源及びエネルギー源として
のグルコース及びギ酸、適合した酸-塩基指示薬、即ち、pＫiが4.5〜4.8である
もの、特にブロモクレゾールグリーン、及び任意により寒天及びクロラムフェニ
コールのような抗生物質細菌発育阻止剤で補足された基礎無機培地を含んでいる
。

【０００５】本発明によれば、ギ酸は0.1％〜0.5％(v/v)の濃度で培地中に存在し、該濃度
は培地が選択培地であるか、単に鑑別培地であるかによって選択される。ギ酸濃度が本発明の培地中で高くなる場合、Z.ベイリイ又はZ.ビスポラスの酵
母に対する培地の選択性が高くなるが、下記実施例6及び7に示されるように鑑別
性が一部犠牲になる。本発明によれば、グルコースは、0.05％〜0.1％(p/v)、好ましくは0.1％(p/v)
の濃度で存在する。本発明の培地は、更に、実施例4及び8に示されるように選択的であるので、他
の酵母の存在に無関係に、適合した条件、特に接種法によって、試料中のZ.ベイ
リイやZ.ビスポラスの酵母の計数が可能になる。本発明の実施態様においては、酸-塩基指示薬は培地が緑色を呈するブロモク
レゾールグリーンであり、ザイゴサッカロミセス・ベイリイ又はザイゴサッカロ
ミセス・ビスポラスの酵母によって青色に変わる。更に、前記酵母のコロニーは
、本発明の培地中では青色に呈色している。他の実施態様においては、本発明の培地は、更に、細菌発育阻止剤を含み、細
菌を含む混合集団の試料に適用するのに特に有効である。

【０００６】本発明の培地は、脱イオン水中の基礎無機培地をオートクレーブ滅菌すること
により調製される。次に、培養液を冷却し、固化する前に、適した溶液として調
製するとともに予め滅菌したグルコース、ギ酸、微量元素及びビタミンを無菌条
件下で添加する。全培養液をホモジェナイズし、ペトリ皿に無菌的に分配する。本発明は、また、上で確認された本発明の培地を用いて試料中に存在するザイ
ゴサッカロミセス・ベイリイ又はザイゴサッカロミセス・ビスポラスの酵母を検出
する方法に関する。本発明のこの特徴によれば、(i)本発明に従って培地を調製する段階; (ii)ザ
イゴサッカロミセス・ベイリイ及び/又はザイゴサッカロミセス・ビスポラスの酵
母を分析すべき試料に、一滴の細胞浮遊液を塗沫、画線、又は付着させることに
よって接種する段階; (iii)インキュベーター中で酵母の発育に適した温度と十
分な時間(最低48時間)でインキュベートする段階; (iv)培地中の色の変化とコロ
ニー形成を観察して、培地の色の変化と使用酸-塩基指示薬と一致した呈色コロ
ニーの形成が生じた場合に前記酵母の存在を決定する段階を含む方法が開発され
た。

【０００７】本発明は、予め単離及び精製された株と共に用いることができ、用いられる接
種のタイプに関して制限はない。しかしながら、指示薬の変化を観察するために
必要とされる時間は、接種物の細胞濃度や接種方法に左右される。本発明は、また、ザイゴサッカロミセス・ベイリイとザイゴサッカロミセス・ビ
スポラス以外の酵母を含有する混合酵母集団の細胞浮遊液と共に用いることがで
き、青色コロニーが培地の色の変化と共に検出される毎にこれらの種の存在につ
いて情報を与える。本発明の目的の1つは、食品工業、特にワイン及び飲料工業にザイゴサッカロ
ミセス・ベイリイ又はザイゴサッカロミセス・ビスポラスの酵母の検出手順を提供
することである。その手順は、簡便で微生物学的分析実験によって容易に再現で
きる。更に、培地の生産は、新しい技術を必要としない。一旦調製されると、通
常の微生物学的分析を経験した人以外の高度に熟練した人を必要としないので、
工業的設備又は品質管理実験室において直接用いられる。更に、本発明の培地は、酵母の同定ギャラリーを組込むためにも使用し得る。

【０００８】本発明の好適実施態様本発明の好適実施例においては、48時間のインキュベーション後に試料中のザ
イゴサッカロミセス・ベイリイ又はザイゴサッカロミセスビスポラスの酵母を同
定するための鑑別又は選択培地は、酸-塩基指示薬としてブロモクレゾールグリ
ーンを含む、微量元素及びビタミン、唯一のエネルギー源及び炭素源として0.05
％〜0.1％(w/v)のグルコース及び0.1％〜0.5％(v/v)のギ酸、及び任意により寒
天及び細菌発育阻止剤で補足された基礎無機培地を含んでいる。本発明の本実施例においては、ブロモクレゾールグリーンによって、適切な条
件下でのインキュベーション中にザイゴサッカロミセス・ベイリイやザイゴサッ
カロミセスビスポラスの酵母の作用のために青色に変わる緑色に呈色している培
地が得られる。更に、これらの酵母のコロニーも青色である。培地の色の変化は
、実施例1及び2に示されるようにこれらの酵母種に特有であり、よって色の変化
によってのみ試料中のその存在の検出が可能である。ここで、本発明の方法を下記の限定されない実施例によって具体的に説明する
。

【０００９】実施例実施例1 本実施例は、本発明の固形培地の調製を示すものであり、Z.ベイリイ又はZ.ビ
スポラスの酵母の同定に有効であることを示すものである。下記の成分を含む培地を調製した。

【００１０】

【表１】表1 ザイゴサッカロミセス・ベイリイやザイゴサッカロミセスビスポラスの酵母
を検出するための培地の組成

【００１１】

【表２】

【００１２】基礎培地化合物を脱イオン水推定量の4/5に溶解し、滅菌を121℃のオートクレ
ーブ中で20分間行う。その他の培地化合物(グルコース、ギ酸、微量元素溶液A、微量元素溶液B、及
びビタミン溶液)を残りの水量に溶解し、これらの化合物の最終濃度が表1に示さ
れた値と等しくなる。pＨをHCl 1Mで4.5に調整しなければならない。滅菌をろ過
により行う。この溶液及び基礎培地を50±5℃にした後、一緒に混合する。全培
養液をホモジェナイズし、ペトリ皿に分配する。予め精製し一般酵母培地(酵母エキス培地、ペプトン、及びグルコース)を含む
寒天傾斜に接種した同定すべき酵母株を28℃で48時間インキュベートする。上で
調製したグルコースとギ酸を含む培地にループフルを移す。画線することにより
接種し、プレートを30℃で最低48時間インキュベートする。また、同等のバイオ
マス量を含有するコットン塗沫により接種することもできる。結果を表3に示す。

【００１３】

【表３】 * 更に24〜48時間のインキュベーション後に培地の色の変化が見られた。

【００１４】試験したZ.ベイリイ株のすべてに緑から青への培地の色の変化が見られた。し
かしながら、8つの試験したZ.ビスポラス株のうち3つは、更に24〜48時間インキ
ュベーションした後にのみ培地の色を変えることが見られた。その他の試験した
種の株すべてについては、培地の色が変化しないので負の結果が見られた。得られた結果から、本発明の培地が48時間の最低インキュベーション時間後の
固体培地において培養物から直接接種したZ.ベイリイやZ.ビスポラスの検出に適
切かつ効果的であることがわかる。

【００１５】実施例2 固形培地中で生成した細胞の代わりに単一株細胞浮遊液用いて接種を行ったこ
と以外は実施例1と同じ手順を用いた。細胞は、実施例1に記載されたように寒天
傾斜に由来している。細胞浮遊液は、光学濃度(OD640)が0.7〜1.0の範囲内にあ
るように脱イオン水中で調製される。10μl滴のこれらの浮遊液を実施例1に記載
された培地を含有するペトリ皿の表面上に置く。プレートを30℃で48時間インキ
ュベートした。得られた結果を表4に示す。これらの結果は、実施例1に示されたものと同じで
ある。

【００１６】

【表４】 * 更に72〜96時間のインキュベーション後に培地の色の変化が見られた。

【００１７】本発明の培地は、48時間の最低インキュベーション時間後に純粋な培養浮遊液
からZ.ベイリイやZ.ビスポラスを検出するのに適切かつ効果的である。

【００１８】実施例3 液状の培養液を用いた以外は実施例2と同様の手順を用いた。25μlの細胞浮遊
液を、寒天を除き、25μlの細胞浮遊液を添加した後に最終培養液成分濃度が実
施例1に記載されたものと等しいような濃度に実施例1に記載された225μlの培養
液に移した。インキュベーション条件は、実施例2に記載されたものと同様であ
る。更に、培養物を160rpmで機械的混合によりホモジェナイズする。得られた結果を表5に示す。これらの結果は、上記実施例で得られたものと同
様である。

【００１９】

【表５】 * 更に48〜72時間のインキュベーション後に培養液の色の変化が見られた。

【００２０】液状の本発明の培養液は、48時間の最低インキュベーション時間後に純粋な培
養浮遊液からZ.ベイリイやZ.ビスポラスの検出に同様に適切でありかつ効果的で
ある。

【００２１】実施例4 本実施例は、本発明の培地が混合酵母集団の試料中のZ.ベイリイ種やZ.ビスポ
ラス種の酵母に選択的であることを示すものである。使用した細胞浮遊液が純粋な又は混合(等比で)酵母細胞浮遊液であること、及
び膜ろ過法が用いられること以外は実施例3と同様の手順を用いる。細胞浮遊液
を実施例2のように調製する。混合培養物を純粋な培養浮遊液から調製する。本
例においては、接種は適切に希釈された浮遊液のアリコートを用いて行われ、減
圧下で滅菌したろ過膜(0.45μmの孔)によってろ過され、次にろ過物をペトリ皿
に置き、実施例1に記載された培地の表面上にろ過物を含む皿を30℃で96時間イ
ンキュベートする。対照の培地として(100％の回収率に対応する)、一般酵母培
養液を用いる(酵母エキス、ペプトン及びグルコース含有培地)。得られた結果を表6に示す。実施例1に記載された培地中のZ.ベイリイ細胞の回
収率は、他の酵母種の存在に無関係に約60〜70％である。培地は、S.セレビシエ
、P.メンブランファシエンス及びD.アノマラの回収率が著しく低く、0.01％より
低いので高度に選択的であることがわかった。 S.セレビシエ、P.メンブランファシエンス及びD.アノマラはワイン中の不純物
種の代表例であり、本発明の培地は、汚染されたワイン試料中のZ.ベイリイの同
定に有効かつ適切である。

【００２２】

【表６】表6 30℃で96時間のインキュベーション後の膜ろ過法によって得られた回収率(
％) n.d. 測定せず

【００２３】図3、4、及び5は、コロニーの色と形態のみを用いて3種間の容易な判別が顕著
である、純粋培養物と混合培養物中の異なる種のコロニー形態を示す写真である
。一部の例においては、青の呈色が弱い又は青の呈色が強い典型的でないコロニ
ー(約2〜3％)が存在し得る。形態がS.セレビシエと同様のこれらの最初の種類(
図4)は、この種に属するものとして判断した。これらのコロニーの弱い呈色は、
色の変化がZ.ベイリイの存在によって生じた後の指示薬の取込みによるものであ
る。形態がP.メンブランファシエンスと同様の第2種類のコロニー(図5)は、この
種に属するものとして判断し、呈色の強さはZ.ベイリイの存在によって生じた色
の変化後の指示薬に対するこれらの細胞の親和性が高いことによるものである。
この特性は、P.メンブランファシエンスの純粋培養物にも同様に観察され、これ
らの条件下で緑色〜クリーム色を呈するS.セレビシエと対照的に非常に強い緑色
を呈した。しかしながら、それらのコロニー間の判別は、添付の図4と5からわか
るように明らかである。

【００２４】実施例5 本実施例は、本発明の培地の鑑別能及びワイン試料中のZ.ベイリイ細胞の計数
を示すものである。ワイン試料中のZ.ベイリイ細胞の計数は、膜ろ過を用いて行われる(実施例4に
記載された方法に従って)。ワインのコロニー形成単位(CFU)/mlの数は、30℃の
温度で96時間インキュベートした後に定量される。ワイン中の酵母を検出するた
めに現在用いられている他の市販の培地(ワラーシュタイン(Wallerstein)実験栄
養培地、WLDとワラーシュタイン実験鑑別培地、WLD、共にディフコ(Difco)から
市販されている)も同時に試験する。WLN培地は発酵酵母の検出に用いられ、WLD
培地は乳酸菌及び酢酸菌並びに非発酵フローラに属する酵母を検出することがで
きる。結果を表7に纏める。

【００２５】

【表７】表7 グルコースとギ酸(0.4％v/v)を含有する培地中で30℃で96時間インキュベ
ートした後に膜ろ過法によって得られた2種類の汚染ワイン中のCFU/ml数 ⁽¹⁾ クリーム色〜黄色コロニー⁽²⁾ Z.ベイリイの典型的な青色コロニー

【００２６】 Z.ベイリイ種に属する又は属しない青色コロニーと白色〜黄色コロニーの同定
を分子法によって確認した。実施例1に記載された培地は、ザイゴサッカロミセス・ベイリイ種の酵母の単離
に理想的な培地であり、この酵母種と他の酵母種とを色だけで判別することがで
きる。WLN培地とWLD培地は、本発明の培地の特性であるこの鑑別能を示さない。
この性質が本培地を現在市販されているものより優れたものにしている。

【００２７】実施例6 本実施例は、本発明の固形培地中のギ酸濃度の影響を示すものである。種々の濃度のギ酸を用いた以外は実施例1のような培地を調製し、表8に示され
るように、実施例2と同様の手順に従って各種酵母株を接種した。得られた結果を表8に示す。低いギ酸濃度については、Z.ベイリイやZ.ビスポ
ラスの種に属する株すべてに固形培地の塩基性化が見られる。濃度が高くなると
、3つのZ.ベイリイ株は培地の色の変化がゆっくりになった。他の試験種の株は
すべて培地の色の変化を生じなかった。

【００２８】

【表８】 ^* 更に48〜72時間インキュベートした後に培地の色の変化が見られた n.d. 測定せず

【００２９】従って、本培地は、48時間の最低のインキュベーション時間後、試験濃度のギ
酸すべてについて培地の表面上に滴下した純粋な培養浮遊液からのZ.ベイリイや
Z.ビスポラスの検出に適切かつ効果的である。得られた結果は、0.3％のギ酸濃
度については、本発明の培地が、48時間の最低のインキュベーション後に、液状
培養液に接種した純粋な培養浮遊液中のZ.ベイリイやZ.ビスポラスの検出に適切
かつ効率のよいことを示している。0.5％ギ酸濃度を含む培地中のZ.ベイリイの
検出にも同じことが成り立つ。いずれの濃度もその他の試験種から負の応答を保
証するのに適している。しかしながら、0.5％(v/v)のギ酸を含む培地は、酸条件
に耐性が小さいZ.ベイリイ株の検出には最良に適した培地ではない。

【００３０】実施例7 本実施例は、本発明の培地においてギ酸濃度の影響を示すものである。種々の濃度のギ酸を用いた以外は実施例3のように培養液を調製し、表9に示さ
れるように、実施例3の手順に従って各種酵母株を接種した。得られた結果は、実施例6と同様であり、表9に示されている。図2においては
、Z.ベイリイ種に属する酵母株と属しない酵母株の典型的な応答を示している。

【００３１】

【表９】 ^* 更に48〜72時間インキュベートした後に培養液の色の変化が見られた n.d. 測定せず

【００３２】実施例6のように、得られた結果は、0.3％のギ酸濃度については、本発明の培
養液が48時間の最低インキュベーション時間の後の液体培養液中で接種した純粋
な培養浮遊液からZ.ベイリイやZ.ビスポラスの検出に適切かつ効果的であること
を示している。ギ酸濃度が0.5％のZ.ベイリイの検出にも同じことが成り立つ。

【００３３】実施例8 本実施例は、培地の選択性に対する本発明の培地中のギ酸濃度の影響を示すも
のである。培地中種々の濃度のギ酸を用いる以外は実施例4の手順を用いた。得られた結果を表10に示す。これらの結果と実施例4の結果は、汚染ワインに
見出され得る他の酵母種の存在に無関係に、ギ酸濃度が高くなるにつれて培地中
のZ.ベイリイ細胞の回収率が低下することを示している。他の3つの試験種のう
ちの2つについては、ギ酸濃度が高くなるにつれて回収率が低下する。

【００３４】

【表１０】 n.d. 測定せず

【００３５】このように、本発明の培地は、予め分離した酵母株を含有するか又は混合酵母
集団を含有する試料中のザイゴサッカロミセス・ベイリイ又はザイゴサッカロミ
セス・ビスポラスの酵母の検出、同定及び計数に適切かつ非常に効果的である選
択及び鑑別培地の特性を有することがわかった。これらの鑑別性と選択性の特性
は、最適化され得る。低いギ酸濃度によって、選択性は低いが判別能が著しい培
地が得られる。一方、高いギ酸濃度については、培地は非常に選択的である。培地を細菌発育阻止剤で補足することもでき、細菌を含む混合集団試料、例え
ば、食品や飲料において用いるのにも有効である。本発明は好適実施態様に基づいて記載されているが、前述の特許請求の範囲の
真意と範囲内の変更及び修正が可能であることは当業者に明らかでなければなら
ない。

【図面の簡単な説明】

【図１】 30℃で96時間のインキュベーション後のグルコース(0.1％w/v)とギ酸(0.3％v/
v)を含有する本発明の固形培地中の各種酵母の応答(Z.ベイリイISA 1265及びZ.
ベイリイIGC 4806: 正の応答; T.デルブルエッキイ(delbrueckii)ISA 1229及びI
.オリエンタリス(Orientalis)IGC 3806: 負の応答)を示す写真である。正の応答
を示したZ.ベイリイ酵母は、皿の培地が青色に呈色することによって示され、負
の応答は、インキュベーション中に変化しなかった緑色として示されている。

【図２】 30℃で48時間のインキュベーション後のグルコース(0.1％w/v)とギ酸(0.3％w/
v)を含有する本発明の液体培地中の各種酵母の応答を示す写真である。Z.ベイリ
イ株はすべて培地を青色に変化させたが、その他はすべて緑色を維持した。

【図３】 30℃の温度で96時間のインキュベーション後に膜ろ過法を用いることによって
得られた、0.3％(v/v)のギ酸と0.1％(w/v)のグルコースを含有する本発明の培地
中のザイゴサッカロミセス・ベイリイ酵母コロニーの形態を示す写真である。青
色により明瞭なコロニーが観察し得る。

【図４】 30℃の温度で96時間のインキュベーション後に膜ろ過法を用いることによって
得られた、0.2％(v/v)のギ酸と0.1％(w/v)のグルコースを含有する本発明の培地
中のS.セレビシエ(cerevisiae)コロニーとザイゴサッカロミセス・ベイリイ酵母
コロニーの形態を示す写真である。Z.ベイリイコロニーは青色を呈し、その他の
コロニーのクリーム色の呈色と完全に異なっている。

【図５】 30℃の温度で96時間のインキュベーション後に膜ろ過法を用いることによって
得られた、0.2％(v/v)のギ酸と0.1％(w/v)のグルコースを含有する本発明の培地
中のP.メンブランフェイシエンス(membranaefaciens)コロニーとザイゴサッカロ
ミセス・ベイリイ酵母コロニーの形態を示す写真である。Z.ベイリイコロニーは
、形態と青色から完全に区別できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者コルテ−レアルマヌエラポルトガルペー−4200 ポルトルアセニョーラドポルト 798 アール／セディル (72)発明者シュッラードリトポルトガルペー−4700 ブラガルアモンセニョールフェレイラ 118 １エスクＦターム(参考） 4B063 QA01 QQ07 QR47 QS31 QS40 QX10 4B065 AA72X BB03 BB08 BB15 CA46

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ザイゴサッカロミセス・ベイリイ(Zygosaccharomyces bailii
)及びザイゴサッカロミセス・ビスポラス(Zygosaccharomyces bisporus)の酵母の
ための鑑別又は選択培地であって、ビタミン、微量元素、唯一の炭素源及びエネ
ルギー源としてのグルコース及びギ酸、適合した酸-塩基指示薬、及び任意によ
り抗生物質細菌発育阻止剤及び寒天で補足された基礎無機培地を含むことを特徴
とする、前記培地。
【請求項２】グルコースが0.05％〜0.1％(p/v)、好ましくは0.1(p/v)の濃
度で存在していることを特徴とする、請求項1記載の培地。
【請求項３】ギ酸が、所望の鑑別性と選択性によって、0.1％〜0.5％(v/v
)、好ましくは0.2％〜0.4％(v/v)、更に好ましくは0.4％(v/v)の濃度で存在して
いることを特徴とする、請求項1記載の培地。
【請求項４】ギ酸の該濃度が、好ましくは0.4％(v/v)であることを特徴と
する、請求項3記載の培地。
【請求項５】該基礎無機培地が硫酸アンモニウム(0.5％(w/v))、燐酸二水
素カリウム(0.5％(w/v))、硫酸マグネシウム7水和物(0.05％(w/v))及び塩化カル
シウム2水和物(0.013％(w/v))を含み、該微量元素溶液A(0.05％(v/v))がホウ酸(
1.0％(w/v))、ヨウ化カリウム(0.2％(w/v))及びモリブデン酸ナトリウム2水和物
(0.4％(w/v))を含み、該微量元素溶液B(0.05％(v/v))が硫酸銅5水和物(0.08％(w
/v))、塩化鉄6水和物(0.4％(w/v))、硫酸マンガン6水和物(0.8％(w/v))、硫酸亜
鉛7水和物(0.8％(w/v))及び塩酸(HCl 10^-3N、0.8％(v/v))を含み、該ビタミン溶
液(0.05％(v/v))がビオチン(0.001％(w/v))、パントテン酸カルシウム(0.08％(w
/v))、ミオイノシトール(4.0％(w/v))、ナイアシン(0.16％(w/v))、塩酸ピリド
キシン(0.16％(w/v))及び塩酸チアミン(0.16％(w/v))を含んでいることを特徴と
する、請求項1記載の培地。
【請求項６】該酸-塩基指示薬が、pＫ_iが4.5〜4.8であるもの、好ましく
はブロモクレゾールグリーンであることを特徴とする、請求項1記載の培地。
【請求項７】 pＨが4.3〜4.8、好ましくは4.5に調整されることを特徴とす
る、請求項6記載の培地。
【請求項８】細菌を含む混合集団試料と共に用いられる抗生物質細菌発育
阻止剤をこのために通常用いられる濃度で更に含有することを特徴とする、請求
項1記載の培地。
【請求項９】寒天を除く成分すべてを含有し、液状であることを特徴とす
る、請求項1〜8のいずれか1項に記載の培地。
【請求項１０】ザイゴサッカロミセス・ベイリイ及びザイゴサッカロミセ
ス・ビスポラスの酵母のための鑑別又は選択培地であって、グルコース 0.1％(w/v) ギ酸 0.4％(v/v) 基礎培地: 硫酸アンモニウム 0.5％(w/v) 燐酸二水素カリウム 0.5％(w/v) 硫酸マグネシウム7水和物 0.05％(w/v) 塩化カルシウム2水和物 0.013％(w/v) ブロモクレゾールグリーン 0.005％(w/v) 寒天 2.0％(w/v) 微量元素溶液A 0.05％(v/v) ホウ酸 1.0％(w/v) ヨウ化カリウム 0.2％(w/v) モリブデン酸ナトリウム2水和物 0.4％(w/v) 微量元素溶液B 0.05％(v/v) 硫酸銅5水和物 0.08％(w/v) 塩化鉄6水和物 0.4％(w/v) 硫酸マンガン4水和物 0.8％(w/v) 硫酸亜鉛7水和物 0.8％(w/v) 塩酸、HCl 10^-3N 0.8％(v/v) ビタミン溶液 0.05％(v/v) ビオチン 0.001％(w/v) パントテン酸カルシウム 0.08％(w/v) ミオイノシトール 4.0％(w/v) ナイアシン 0.16％(w/v) 塩酸ピリドキシン 0.16％(w/v) 塩酸チアミン 0.16％(w/v) から構成され、pＨがHCl 1MでpＨ4.5に調整されていることを特徴とする、前記
培地。
【請求項１１】該培地が、該基礎培地の化合物を脱イオン水推定量の4/5
に溶解し、滅菌を121℃のオートクレーブ中で20分間行い、その他の培地化合物
をこれらの化合物の最終濃度が所望値と等しくなるように残りの水に溶解し、滅
菌をろ過で行い、その溶液と該基礎培地を約50±5℃にした後、混合し、最終pＨ
値を所望値に調整することにより、調製されることを特徴とする、請求項1〜10
記載の培地。
【請求項１２】ザイゴサッカロミセス・ベイリイ及びザイゴサッカロミセ
ス・ビスポラスの酵母の検出方法であって、ビタミン、微量元素、唯一の炭素源
及びエネルギー源としてのグルコース及びギ酸で補足された基礎無機培地、適合
した酸-塩基指示薬、及び任意により抗生物質細菌発育阻止剤及び寒天を含む、
前記酵母種のための鑑別又は選択培地を用いることを特徴とする、前記方法。
【請求項１３】該酸-塩基指示薬がブロモクレゾールグリーンであり、前
記培地にザイゴサッカロミセス・ベイリイ及び/又はザイゴサッカロミセス・ビス
ポラスの酵母を含有する試料を接種し、前記酵母の発育に適した条件でインキュ
ベートした後、約48時間後に培地の色が緑から青に変化することによって前記酵
母種の存在が決定されること、及び所望される場合には約96時間後に青色に呈色
したコロニーの発育によって前記酵母種を計数することが可能であることを特徴
とする、請求項12記載の方法。
【請求項１４】混合酵母集団を含有する又は含有しない、ワイン、又は他
の飲料又は食品中の該ザイゴサッカロミセス・ベイリイ又はザイゴサッカロミセ
ス・ビスポラスの酵母の検出及び計数に適用されることを特徴とする、請求項12
又は13記載の方法。
【請求項１５】酵母同定ギャラリーに含まれる、請求項1〜11のいずれか1
項に記載の培地の使用。
【請求項１６】工業における、特に食品及び飲料工業における品質と工程
管理のための請求項１〜11のいずれか1項に記載の培地の使用。