CN1367842A - 接合糖酵母属的培养基 - Google Patents

Abstract

本发明涉及到适于拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母种酵母检测、时间上极大减少并且工作通常包含于这些种常规检测之中的鉴别和选择性的培养基。按照本发明,拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的检测以一种单一的、仅需要制备一种液体或固体培养基和接种试验完成。这种培养基包括碱性无机培养基,它以低量元素和维生素,作为唯一的能量和碳源的葡萄糖和蚁酸,和酸－碱指示剂补充。酸－碱指示剂,特别是溴甲酚绿,提供培养基绿色染色,它在上述的酵母作用下会转变成蓝色。另外,菌落呈现的蓝色是这些菌种的专一特征,并且在取决于采用的接种方法的48至96小时的培养之后可被观察到。本发明可与或者预先分离和纯化过的酵母,或者含有不同于拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的其它酵母的细胞悬浮液一起使用,以便在食品工业检测这些菌种,即在酒类和其它饮料中。这种培养基也包含于酵母鉴定试验的途径中。

Description

接合糖酵母属的培养基

发明目的

本发明涉及一种鉴别的和选择性的含有葡萄糖、蚁酸和酸-碱提示剂的培养基，以便48小时之后，在样品中，检测拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母，考虑食品变质时它们是最危险的菌种，以及采用这种涉及的培养基的拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的检测方法。本发明的进一步的目的是涉及的培养基在酵母鉴定试验途径(gallery)中的用途。

先有技术状况

在食品工业中酵母是增长的问题。设计以便维持食品感官性能的温和防腐处理，含改性空气的包装，以及新制剂的使用，以避免细菌污染，虽然如此，它们有利于酵母污染。尽管在食品中已经检测到一些致病的酵母菌种，机会菌株对于部分人群是危险的，出现的污染的基本风险不是卫生实质的一种，但是它是某些酵母，例如拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母(Zygosaccharomyces bailii andZygosacchromyces bisporus)在食物中的变质作用，随后结果包括经济损失。

迄今，在种种聚集处(例如食品、自然)的酵母微生物区系的研究，包括首先菌株分离阶段，采用一般的选择性酵母培养基，和其次的分离菌株的鉴定阶段，利用常规和/或分子生物学基础的方法。经典的的酵母鉴定方法基于系列的营养和有性生殖特征，并且包括大范围的生理学和生物化学试验。它是一种要求高的工作，至少一或两周之后产生结果，并且需要大量的经验以便恰当地解释结果。分子生物学基础的方法通常比经典方法快，但是它们也需要良好的操作经验值并且包括昂贵的设备和反应物。

有一些商业上可得到的检测酒中酵母的培养基，即WallersteinLaboratory Nutrient Medium(Wallerstein实验室营养培养基)，WLN，用于检测发酵酵母，和Wallerstein Laboratory DifferentialMedium(Wallerstein实验室鉴别培养基)，WLD，它允许检测乳酸菌和醋酸菌以及属于非发酵区系的酵母(均来自Difco)。然而，这些先有技术的培养基不能够区别酵母，特别是拜列氏接合糖酵母种。

因此需要快速和有效地检测和鉴定拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的培养基和方法，对于这些菌种快速检测的常规技术它从而是一种选择性的手段。

发明介绍

令人惊奇地发现，拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母，当生长在含有葡萄糖、蚁酸和适当的酸-碱指示剂的培养基时，导致培养基颜色的迅速改变和在48小时之后染色菌落的形成，这些变化是特征性的和所涉及酵母在涉及的培养基中专有的。

亦发现按照本发明的培养基经适当的酸-碱指示剂掺入，对于拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母是鉴别的，并且对于涉及到的酵母的生长是选择性的，这取决于培养基中蚁酸的浓度。

从而，按照本发明，研发一种新型鉴别的和选择性的培养基，它允许拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的鉴别，培养48小时之后使人确信的结果，并且它因此对于这些物种快速检测的常规技术是一种选择性的手段，允许在包括它们的鉴定的时间和工作上的极大减少。

按照本发明的培养基包括碱性无机培养基，补充维生素，低量元素，作为唯一碳和能量来源的葡萄糖和蚁酸，适当的酸-碱指示剂，即pK_i在4.5和4.8之间的一种，特别是溴甲酚绿，以及选择性的琼脂和细菌生长的抗生素抑制剂，例如cloramphenicol。

按照本发明，培养基中蚁酸的浓度是0.1％至0.5％(v/v)，浓度的选择取决于培养基是否是选择性的或者仅仅是鉴别的。

当蚁酸的浓度在按照本发明的培养基中升高时，适于Z.bailii(拜列氏接合糖酵母)和Z.bisporus(双孢接合糖酵母)酵母的培养基的选择性升高，如以下实施例6和7所示，尽管牺牲一定的可辨性。

按照本发明，葡萄糖浓度是0.05％和0.1％(p/v)，优选0，1％(p/v)。

按照本发明的培养基进一步允许，通过适当条件的选择，尤其接种方法，样品中Z.bailii和Z.bisporus酵母的计数，不考虑其它酵母的存在，由于它是如实施例4和8所示的选择性的。

在本发明的一项实施方案中，酸-碱指示剂是溴甲酚绿，它导致培养基为绿色，绿色会由拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母转变成蓝色。此外，本发明的培养基中的所涉及酵母的菌落，染蓝色。

在另一项实施方案中，按照本发明的培养基可含有细菌生长抑制剂的添加物，尤其适用于含细菌的混合种群的样品。

本发明的培养基经碱性无机培养基在去离子水中高压蒸汽灭菌制备。接着冷却培养基，并且在固化之前，制备成适当溶液的并以前灭菌的葡萄糖、蚁酸、低量元素和维生素在无菌条件下加入。匀化整个培养基并且无菌分散到陪替氏培养皿。

本发明也涉及到拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的检测方法，采用按照本发明的、如以上表征的培养基。

按照本发明的特征，研发一种方法，它包括：(i)制备按照本发明的培养基；(ii)以待分析拜列氏接合糖酵母和/或双孢接合糖酵母的样品，通过涂布、划线或通过细胞悬浮液的沉积，接种；(iii)在恒温箱内于适当的温度下和足够酵母生长的时间(最少48小时)内培养；和(iv)观察培养基颜色的变化和菌落的形成，以便在培养基颜色变化和染色菌落的形成与使用的酸-碱指示剂一致时推断所涉及的酵母的存在。

本发明也可与预先分离和纯化的菌株一起使用，关于采用的接种类型没有方式上的限制。然而，观察指示剂转变需要的时间取决于接种物的细胞浓度和接种方法。

亦可以采用本发明与含有除了拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母之外的混合的酵母种群一起使用，提供有关这些种存在的的信息，每当检测到与培养基颜色变化结合的蓝色菌落时。

本发明的一项目的是提供食品工业，特别是酒和饮料工业，拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的检测方法。通过任何微生物学分析实验室，这种方法是简单和易于重复的。此外，培养基的生产并不需要新的技术。一经制备，这种培养基发现可立即用于任何工业设备或质量控制实验室，由于它不需要不同于负责常规微生物学分析的非常熟练的人员。

进一步地，按照本发明的培养基可用于酵母鉴定的综合途径(integrate galeries)。

附图简要说明

图1显示在按照本发明的含有葡萄糖(0.1％w/v)和蚁酸(0.3％v/v)的固体培养基中，30℃培养96小时末期一些酵母反应的照片(Z.bailiiISA 1265和Z.bailii IGC 3806：阳性反应；T.delbrueckii(戴尔凯氏有孢贺酵母)ISA 1229和/或I.Orientais(东方伊氏酵母)IGC 3806：阴性反应)。Z.bailii酵母显示由皿中染蓝色的培养基揭露的阳性反应，而阴性反应由如在培养中未改变的绿色显示。

图2显示在按照本发明的含有葡萄糖(0.1％w/v)和蚁酸(0.3％v/v)的液体培养基中，于30℃培养48小时末期一些酵母的反应。培养基中诱导的所有Z.bailii菌株变成蓝色，而其它的保持绿色。

图3显示在按照本发明的含有蚁酸(0.2％v/v)和葡萄糖(0.1％w/v)的培养基中，于30℃培养96小时之后，经薄膜过滤法得到的，拜列氏接合糖酵母的形态学。可观测到蓝色良好清晰度的菌落。

图4显示在按照本发明的含有蚁酸(0.2％v/v)和葡萄糖(0.1％w/v)的培养基中，于30℃培养96小时之后，经薄膜过滤法得到的，S.cerevisiae(啤酒糖酵母)和拜列氏接合糖酵母菌落的形态学。Z.bailii菌落显示染蓝色，完全不同于染乳色的其它菌落。

图5显示在按照本发明的含有蚁酸(0.2％v/v)和葡萄糖(0.1％w/v)的培养基中，于30℃培养96小时之后，经薄膜过滤法得到的，P.membranaefaciens(膜醭毕赤氏酵母)和拜列氏接合糖酵母菌落的形态学。通过其形态学和蓝色，Z.bailii菌落完全是区别得出的。

本发明优选的实施方案

在本发明优选的实施方案中，在培养48小时之后，用于样品中拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母鉴定的鉴别的和选择性的培养基，含有碱性无机培养基，包括溴甲酚绿作为酸-碱指示剂，补充低量元素和维生素，作为唯一能量和碳源的0.05％至0.1％(w/v)的葡萄糖和0.1％至0.5％(v/v)的蚁酸，和选择性的琼脂和细菌生长抑制剂。

在本发明的实施方案中，在适当条件下培养期间，溴甲酚绿提供培养基经拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母作用可转变成蓝色的绿色。此外，这些酵母的菌落也会是蓝色。培养基颜色的变化是如实施例1和2介绍的这些酵母种的特征，从而允许在样品中仅仅通过颜色改变检测其存在。

按照本发明的方法现通过以下非限制性的实施例举例说明：

实施例

实施例1

本实施例说明按照本发明的固体培养基的制备，并显示它在Z.bailii和Z.bisporus的鉴定中是有效的。

制备包括下列成分的培养基：

表1适于拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母检测的培养基组

             合物化合物                                            浓度(％)碱性培养基       硫酸氨            (NH₄)₂SO₄      0.5(W/V)

             硫酸二氢钾        KH₂PO₄          0.5(W/V)

             七水合硫酸镁      MgSO4-7H2O         0.05(W/V)

             二水合氯化钙      CaCl₂-2H₂O      0.013(W/V)

             溴甲酚绿          C₂₁H₁₄Br₄O₅S  0.005(W/V)

             琼脂                                 2.0(W/V)葡萄糖           -                 C₆H₁₂O₆        0.1(W/V)蚁酸             -                 CH₂O₂           0.4(V/V)低量元素溶液A(成分按照表2)         -                  0.05(V/V)低量元素溶液B(成分按照表2)         -                  0.05(V/V)维生素溶液   (成分按照表2)         -                  0.05(V/V)

表2低量元素和维生素溶液成分化合物                                                浓度(％)低量元素溶液A硼酸                  H₃BO₃           1.0(W/V)

         碘化钾                KI                 0.2(W/V)

         二水合钼酸钠          Na₂MoO₄-2H₂O   0.4(W/V)低量元素溶液B五水合硫酸铜          CuSO4-5H₂O        0.08(W/V)

         六水合氯化铁          FeCl₃-6H₂O       0.4(W/V)

          六水合硫酸锰          MnSO₄-4H₂O         0.8(W/V)

          六水合硫酸锌          ZnSO₄-7H₂O         0.8(W/V)

          盐酸                  HCl10^-3N            0.8(W/V)维生素溶液    维生素H               C₁₀H₁₆N₂O₂S      0.001(W/V)

          calcium panthotenate  C₉H₁₆NO₅-1/2Ca    0.08(W/V)

          Mioinositol           C₆H₁₂O₆           4.0(W/V)

          烟酸                  C₆H₅NO₂           0.16(W/V)

          维生素B₆盐酸盐       C₆H₁₁NO₃-HCl      0.16(W/V)

          维生素B₁盐酸盐       C₁₂H₁₇ClN₄O₂S-HC 0.16(W/V)

                                l

这类碱性培养基化合物溶于4/5体积的估计的去离子水，高压灭菌器在121℃完成20分钟的灭菌。

其它的培养基化合物(葡萄糖、蚁酸、低量元素溶液A、低量元素溶液B和维生素溶液)溶于剩余体积的水中，以便这些化合物的最终浓度等于表1提及的值。pH必须以1M HCl调节至4.5。通过过滤完成灭菌。这种溶液和碱性培养基在一起混合之前退火至50±5℃。匀化整个培养基并分散入陪替氏培养皿。

这种待鉴别的酵母菌株，预先纯化和以一般的酵母培养基接种在琼脂斜面上(酵母提取物培养基、蛋白胨和葡萄糖)，在28℃培养48小时。一铂环量转移至以上制备的含葡萄糖和蚁酸的培养基上。通过划线进行接种并且在30℃培养48小时的最少时间。选择性地，以含有等当量的生物量的棉花涂片进行接种。

得到的结果如表3所示。

表3划线接种—在含有葡萄糖和蚁酸(0.4％v/v)的培养基中于30

   ℃下培养48小时之后一些酵母的反应

          种                      试验菌株数           培养基颜色拜列氏接合糖酵母                          15                  蓝色双孢接合糖酵母                            5                   蓝色Zygosaccharomyees rouxii                  3                   蓝色^*弗罗棱接合糖酵母                          1                   绿色巴扬氏糖酵母                              2                   绿色啤酒糖酵母                                21                  绿色巴斯德氏糖酵母                            2                   绿色路克氏类糖酵母                            3                   绿色粟酒型殖糖酵母                            4                   绿色膜醭毕赤氏酵母                            13                  绿色Pichia anomala                            7                   绿色Dekkera anomala                           3                   绿色布鲁塞尔德克氏酵母                        4                   绿色汉逊氏德巴利氏酵母                        2                   绿色Issatchenkia orientalis(东方伊氏酵母)     6                   绿色马克斯克鲁维氏酵母                        5                   绿色细尖克勒氏酵母                            1                   绿色Lodderomyces elongisporus                 2                   绿色粘性红酵母                                2                   绿色戴尔凯氏有孢贺酵母                        7                   绿色

^*在24-48小时的额外培养期之后，观察到培养基颜色的变化

在所有试验的Z.bailii菌株中观察到培养基颜色从绿色改变成蓝色。然而，观察到8个试验的Z.bailii菌株中3个在另外的24至48小时的培养期之后转变培养基的颜色。对于其它试验种的所有菌株，观察到阴性结果，由于培养基颜色并未改变。

所得的结果显示按照本发明的培养基，对于从培养物直接接种在固体培养基上、至少48小时培养期之后的Z.bailii和Z.bisporus的检测是适合的和有效的。

实施例2

采用如实施例1相同的步骤，不同之处仅在于以单一菌株细胞悬浮液代替源自固体培养基的细胞，进行接种。这些细胞可源自如实施例1公开的琼脂斜面。以这样的方式在去离子水中制备的细胞悬浮液光密度(OD₆₄₀)在0.7至1.0之间。10μ1滴的这些悬浮液置入含有实施例1公开的培养基的陪替氏培养皿表面上。板在30℃培养48小时。

得到的结果如表4所示。这些结果类似于实施例1呈现的结果。

表4在固体培养基表面上涂布细胞悬浮液—在含有葡萄糖和蚁酸(0.4％v/v)的培养基中于30℃下培养48小时之后一些酵母的反应

          种                      试验菌株数               培养基颜色拜列氏接合糖酵母                          15                       蓝色双孢接合糖酵母                            5                        蓝色Zygosaccharomyces rouxii                  3                        蓝色^*弗罗棱接合糖酵母                          1                        绿色巴扬氏糖酵母                              2                        绿色啤酒糖酵母                                21                       绿色巴斯德氏糖酵母                            2                        绿色路克氏类糖酵母                            3                        绿色粟酒型殖糖酵母                            4                        绿色膜醭毕赤氏酵母                            13                       绿色Piehia anomala                            7                        绿色Dekkera anomala                           3                        绿色布鲁塞尔德克氏酵母                        4                        绿色汉逊氏德巴利氏酵母                        2                        绿色Issatchenkia orientalis(东方伊氏酵母)     6                        绿色马克斯克鲁维氏酵母                        5                        绿色细尖克勒氏酵母                            1                        绿色Lodderomyces elongisporus                 2                        绿色粘性红酵母                                2                        绿色戴尔凯氏有孢贺酵母                        7                        绿色

^*在72-96小时的额外培养期之后，观察到培养基颜色的变化

按照本发明的培养基，对于来自纯培养物悬浮液、至少48小时培养期之后的Z.bailii和Z.bisporus的检测是适合的和有效的。

实施例3

采用如实施例2相同的步骤，但是采用液体形式的培养基。25μl的细胞悬浮液转移支225μl的实施例1公开的但不含琼脂的培养基上(包含于微板孔中)，并且以这样的浓度，以致于在25μl细胞悬浮液加入之后最后浓度等于实施例1公开的浓度。培养条件与实施例2公开的那些相同。此外培养物通过160rpm的机械混合匀化。

得到的结果如表5所示。这些结果类似于实施例1呈现的结果。

表5在液体培养基内的细胞悬浮液的培养—在含有葡萄糖和蚁酸(0.4％v/v)的培养基中于30℃下培养48小时之后一些酵母的反应

          种                       试验菌株数          培养基颜色拜列氏接合糖酵母                           15                 蓝色双孢接合糖酵母                             5                  蓝色Zygosaccharomyces rouxii                   3                  蓝色^*弗罗棱接合糖酵母                           1                  绿色巴扬氏糖酵母                               2                  绿色啤酒糖酵母                                 21                 绿色巴斯德氏糖酵母                             2                  绿色路克氏类糖酵母                             3                  绿色粟酒型殖糖酵母                             4                  绿色膜醭毕赤氏酵母                             13                 绿色Pichia anomala                             7                  绿色Dekkera anomala                            3                  绿色布鲁塞尔德克氏酵母                         4                  绿色汉逊氏德巴利氏酵母                         2                  绿色Issatchenkia orientalis(东方伊氏酵母)      6                  绿色马克斯克鲁维氏酵母                         5                  绿色细尖克勒氏酵母                             1                  绿色Lodderomyces elongisporus                  2                  绿色粘性红酵母                                 2                  绿色戴尔凯氏有孢贺酵母                         7                  绿色

^*在48-72小时的额外培养期之后，观察到培养基颜色的变化

按照本发明的液体形式的培养基，对于来自纯培养物悬浮液、至少48小时培养期之后的Z.bailii和Z.bisporus的检测是适合的和有效的。

实施例4

本实施例显示按照本发明的培养基对于混合酵母种群的样品中的Z.bailii和Z.bisporus种的酵母是选择性的。

采用如实施例3的类似步骤，不同之处仅在于采用的细胞悬浮液是纯的或混合的(以相等的比例)酵母细胞悬浮液，并且使用薄膜过滤法。细胞悬浮液如实施例2制备。由纯培养物悬浮液制备混合的培养物。在这种情形下，采用等分试样的真空经灭菌过滤薄膜(0.45μm孔)过滤的适当地稀释过的悬浮液完成接种，滤液接着置于陪替氏培养皿内，在实施例1公开的培养基表面上含有滤液的皿于30℃培养96小时。作为参照的培养基(对应100％的回收率)，采用一般的酵母培养基(酵母提取物培养基，蛋白胨和葡萄糖)。

所得的结果如表6所示。如实施例1中公开的Z.bailii细胞的回收率大约是60至70％，不考虑其它酵母种的存在。由于S.cerevisiae、P.membranaefaciens和D.anomala的回收率显著地减少，低于0.01％，显示这种培养基是较高选择性的。

S.cerevisiae、P.membranaefaciens和D.anomala是酒中污染菌种的代表性实施例，按照本发明的培养基对于已污染的酒样品的Z.bailii的鉴定是有用和适当的。

表6通过薄膜过滤法在30℃培养96小时之后的回收率(％)

          种                       Z.bailii回收率拜列氏接合糖酵母                       65拜列氏接合糖酵母                       57啤酒糖酵母                             n.d拜列氏接合糖酵母                       67膜醭毕赤氏酵母                         n.d.Dekkera anomala                        n.d啤酒糖酵母                             ＜0,002膜醭毕赤氏酵母                         0,011Dekkera anomala                        ＜0,004

n.d.未检测到

图3、4和5显示在纯和混合培养物内的不同种菌落的形态学，仅仅采用菌落颜色和形态学在3个种之间是显著的，易鉴别。

在一些情形下，存在染浅蓝色或染深蓝色的非典型的菌落(ca.2-3％)。这些中的第一种(图4)，具有类似于S.cerevisiae的形态学，被判定属于该物种。这些菌落中染浅色的归因于在由Z.bailii的存在诱导的颜色改变之后指示剂的掺入。第二类的菌落(图5)，具有类似于P.membranaefaciens的形态学，被判定属于该物种，染深色归因于在由Z.bailii的存在诱导的颜色改变之后，这些细胞对指示剂的高亲合力。对于P.membranaefaciens培养物同样地观察到这种特征，它与在这些条件下显示染乳绿色的S.cerevisiae的那些相比，显示染极深的绿色。然而，在那些菌落中鉴别是清楚的，因为在附图4和5中可观察到。

实施例5

本实施例显示按照本发明的培养基的鉴别力和酒样品中Z.bailii细胞的计数。

采用膜过滤法进行酒样中Z.bailii细胞的计数(按照实施例4公开的方法)。对于每ml酒菌落形成单位(CFU)的数量的测定，在30℃的温度培养96小时之后进行。平行试验目前采用的用于酒中酵母检测的其它的商业培养基(Wallerstein实验室鉴别培养基，WLD，和Wallerstein实验室营养培养基，WLN，均由Difco销售)。WLN培养基用于发酵酵母的检测，而WLD培养基适于乳酸菌和醋酸菌以及属于非发酵区系的酵母的检测。

表7总结了结果

表7在2种污染过的酒中CFU的数量/ml，通过在含有葡萄糖和蚁酸(0.4％v/v)的培养基中于30℃培养96小时后薄膜过滤法得到

     培养基                 酒1              酒2实施例1公开的培养基             75⁽¹⁾        90⁽¹⁾+170⁽²⁾WLN                             685           620WLD                             10            200

⁽¹⁾乳-淡黄色菌落

⁽²⁾蓝色菌落，典型为Z.bailii

属于或不属于Z.bailii的蓝色菌落和乳-淡黄色菌落的鉴定通过分子方法确认。

实施例1描述的培养基是一种理想的培养基，适于拜列氏接合糖酵母种酵母的分离，可仅仅通过颜色鉴别该酵母和其它酵母种。WLN和WLD培养基并不显示属于本发明培养基的特征的鉴别力。这种性能使得这种培养基优于目前那些商业上可得到的。

实施例6

本实施例显示在按照本发明的固体培养基中蚁酸浓度的作用。

如实施例1制备培养基，但是采用不同浓度的蚁酸，以如表8所示的各种酵母菌株按实施例2介绍的相同步骤进行接种。

所得的结果如表8所示。较低的蚁酸浓度观察到属于Z.bailii和Z.bisporus种的所有菌株的固体培养基的碱化。浓度的升高对于3种Z.bailii菌株导致培养基颜色的缓慢变化。试验的其它种的菌株未诱导培养基颜色的变化。

表8细胞悬浮液滴加在固体培养基表面—含有葡萄糖和不同浓度蚁酸的培养基内一些酵母在30℃培养48小时之后的反应

           种            试验菌株数          培养基颜色

                                     蚁酸0,3％(v/v)蚁酸0,5％(v/v)拜列氏接合糖酵母                  12         蓝色          蓝色拜列氏接合糖酵母                  3          蓝色          蓝色^*双孢接合糖酵母                    8          蓝色          n.d.弗罗棱接合糖酵母                  1          绿色          绿色巴扬氏糖酵母                      2          绿色          绿色啤酒糖酵母                        21         绿色          绿色巴斯德氏糖酵母                    2          绿色          绿色膜醭毕赤氏酵母                    13         绿色          绿色汉逊氏德巴利氏酵母                2          绿色          绿色

^*在额外48-72小时的培养期之后观察到培养基颜色的变化

n.d.未观察到

本培养基因此对于从纯培养物悬浮液滴加至固体培养基表面，在所有蚁酸试验浓度下，48小时的最少培养期之后，Z.bailii和Z.bisporus的检测是适合和有效的。得到的结果显示对于0,3％蚁酸浓度，按照本发明的培养基对于由纯培养物悬液接种至液体培养基，在48小时的最少培养期之后，Z.bailii和Z.bisporus的检测是适当和有效的。对于在含0,5％蚁酸浓度的培养基上Z.bailii的检测同样有效。两种浓度适于保证其它试验种的阴性反应。然而，含0.5％(v/v)蚁酸的培养基并不是最适合的检测对酸性环境显示较低耐受性的Z.bailii的那种。

实施例7

本实施例显示蚁酸浓度在按照本发明的培养基中的作用。

如实施例3制备一种培养基，但是采用不同浓度的蚁酸，以如表9所示的各种酵母菌株按实施例3介绍的相同步骤进行接种。

这些所得的结果类似于实施例6的结果并且如表9所示。图2显示属于和不属于Z.bailii种的酵母菌株的典型反应。

表9液体培养基内细胞悬浮液的接种—含有葡萄糖和不同浓度蚁酸的培养基内一些酵母在30℃培养48小时之后的反应

          种          试验菌株数         培养基颜色

                                  蚁酸0,3％(v/v)蚁酸0,5％(v/v)拜列氏接合糖酵母              12          蓝色          蓝色拜列氏接合糖酵母              3           蓝色          蓝色^*双孢接合糖酵母                8           蓝色          n.d.弗罗棱接合糖酵母              1           绿色          绿色巴扬氏糖酵母                  2           绿色          绿色啤酒糖酵母                    21          绿色          绿色巴斯德氏糖酵母                2           绿色          绿色膜醭毕赤氏酵母                13          绿色          绿色汉逊氏德巴利氏酵母            2           绿色          绿色

^*在额外48-72小时的培养期之后观察到培养基颜色的变化

n.d.未观察到

如实施例6，所得的结果显示，对于0,3％蚁酸浓度，按照本发明的培养基，对于由纯培养物悬液接种至液体培养基，在48小时的最少培养期之后，Z.bailii和Z.bisporus的检测是适当和有效的。对于在含0,5％蚁酸浓度的培养基上Z.bailii的检测同样有效。

实施列8

本实施例显示在按照本发明的培养基上蚁酸浓度对于培养基选择性的影响。采用实施例4的步骤，但是在培养基上采用不同浓度的蚁酸。

所得的结果如表10所示。这些结果和实施例4的结果显示在培养基中的Z.bailii细胞的回收率随蚁酸浓度的升高而下降，与那些可以在污染过的酒中发现的其它的酵母种的存在无关。对于这些其它的3种试验的种之中的2种，回收率亦随蚁酸浓度的升高而下降。

表10在30℃培养96小时之后经薄膜过滤法得到的回收率

           种                  Z.bailii回收率

                    蚁酸0.2％     蚁酸0.3％     蚁酸0.5％拜列氏接合糖酵母          82            78            42拜列氏接合糖酵母          82            81            35啤酒糖酵母                              n.d.拜列氏接合糖酵母          99            94            34膜醭毕赤氏酵母            n.d.          n.d.          n.d.Dekkera anomala           n.d.          n.d.          n.d.啤酒糖酵母                30            4             ＜0.002膜醭毕赤氏酵母            55            5.9           ＜0.004Dekkera anomala           ＜0.004       ＜0.004       ＜0.004

n.d.未检测到

因而，显示按照本发明的培养基具有选择性和鉴别培养基的特征，它适合于在或者含有这些酵母中预先分离出的菌株或者含有混合酵母种群的样品中，拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的检测、鉴定和计数并且非常有效。较低的蚁酸浓度提供培养基显著的鉴别力，尽管具有较低的选择性。另一方面，对于较高的蚁酸浓度，培养基是较高选择性的。

这种培养基也可以补充细菌生长抑制剂，它有益于采用亦包括细菌的混合种群的样品，例如食品和饮料。

尽管基于其优选的实施方案介绍本发明，在附加的权利要求的精神和范围内可能的变动和修正对于本领域的任何熟练技术人员是明显的。

按照条约第19条的修改

1.一种适于拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的鉴别的和选择性的培养基，特征在于它包括补充了维生素，低量元素，作为唯一碳和能量来源的葡萄糖和蚁酸，适当的酸-碱指示剂以及，选择性的细菌生长抗生素抑制剂和琼脂的碱性无机培养基。

2.权利要求1的培养基，特征在于葡萄糖浓度为0.05％至0.1％(p/v)，优选0.1％(p/v)。

3.按照权利要求1的培养基，特征在于取决于希望的鉴定力和选择性的甲酸浓度是0.1％至0.5％(v/v)，优选0.2％至0.4％(v/v)。

4.按照权利要求3的培养基，特征在于甲酸浓度优选0.4％(v/v)。

5.按照权利要求1的培养基，特征在于碱性无机培养基包括硫酸铵(0.5％(w/v))，硫酸二氢钾(0.5％(w/v))，七水合硫酸镁(0.05％(w/v))和二水合氯化钙(0.013％(w/v))；低量元素溶液A(0.05％(v/v))包括硼酸(1.0％(w/v))，碘化钾(0.2％(w/v))和二水合钼酸钠(0.4％(w/v))；低量元素溶液B(0.05％(v/v))包括五水合硫酸铜(0.08％(w/v))，六水合氯化铁(0.4％(w/v))，四水合硫酸锰(0.8％(w/v))，七水合硫酸亚锡(0.8％(w/v))和盐酸(HCl 10^-3N，0.8％(v/v))；并且维生素溶液(0.05％(v/v))包括维生素H(0.001％(w/v))，calciumpanthotenate(0.08％(w/v))，mioinositol(4.0％(w/v))，烟酸(0.16％(w/v))，维生素B₆盐酸盐(0.16％(w/v))和维生素B₁盐酸盐(0.16％(w/v))。

6.权利要求1的培养基，特征在于酸-碱指示剂是具有4.5至4.8之间的pK_i的一种，优选溴甲酚绿。

7.权利要求6的培养基，特征在于调节pH至4.3-4.8，优选4.5。

8.按照权利要求1的培养基，特征在于它进一步地含有常规使用浓度的抑菌目的的细菌生长抗生素抑制剂，以便与混合种群的含有细菌的样品一起使用。

9.按照任何的前述权利要求的培养基，特征在于它含有除了琼脂之外的所有组分，它是液体形式。

10.适于拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的鉴别的和选择性培养基，特征在于它由以下组成：

葡萄糖                     0.1％(w/v)

蚁酸                       0.4％(v/v)

碱性培养基：

硫酸铵                     0.5％(w/v)

硫酸二氢钾                 0.5％(w/v)

七水合硫酸镁               0.05％(w/v)

二水合氯化钙               0.013％(w/v)

溴甲酚绿                   0.005％(w/v)

琼脂                       2.0％(w/v)

低量元素溶液A              0.05％(v/v)

硼酸                       1.0％(w/v)

碘化钾                     0.2％(w/v)

二水合钼酸钠               0.4％(w/v)

低量元素溶液B              0.05％(v/v)

五水合硫酸铜               0.08％(w/v)

六水合氯化铁               0.4％(w/v)

四水合硫酸锰               0.8％(w/v)

七水合硫酸亚锡             0.8％(w/v)

盐酸，HCl 10^-3N，         0.8％(v/v)

维生素溶液                 0.05％(v/v)

维生素H                    0.001％(w/v)

Calcium panthotenate       0.08％(w/v)

Mioinositol                4.0％(w/v)

烟酸                       0.16％(w/v)

维生素B₆盐酸盐            0.16％(w/v)

维生素B₁盐酸盐            0.16％(w/v)]

以1M HCl调节pH至pH4.6。

11.按照任何前述权利要求的培养基，特征在于该培养基如下制备：碱性培养基化合物溶于4/5体积的估计的去离子水，高压灭菌器在121℃完成20分钟的灭菌，其它的培养基化合物溶于剩余体积的水中，以便这些化合物的最终浓度等于预计的值，通过过滤完成灭菌，这种溶液和碱性培养基在其混合之前退火至50±5℃，调节最后的pH至预计值。

12.拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的检测方法，特征在于采用适于涉及到的酵母种的鉴别和选择性的培养基，它包括以维生素、低量元素、作为唯一碳和能量来源的葡萄糖和蚁酸，适当的酸-碱指示剂以及，选择性的细菌生长抗生素抑制剂和琼脂补充的碱性无机培养基。

13.权利要求12的方法，特征在于酸-碱指示剂是溴甲酚绿，以及涉及到培养基接种含有拜列氏接合糖酵母和/或双孢接合糖酵母的样品并且在适合涉及到的酵母生长的条件下培养，通过在大约48小时之后培养基颜色由绿至蓝的变化推断所述酵母种的存在是可行的，并且如果需要，在大约96小时之后通过染蓝色菌落的发育可对所述的酶母种计数。

14.按照权利要求12和13的方法，特征在于它应用至酒以及其它含有或无混合酵母群落的饮料或食品中拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母种酵母的检测和计数。

15.按照权利要求1至11的培养基被包括在酵母鉴定途径中的应用。

16.按照权利要求1至11的培养基在工业，尤其在食品和饮料工业中质量和过程控制中的应用。

Claims (16)

1.一种适于拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的鉴别和选择性的培养基，特征在于它包括补充了维生素，低量元素，作为唯一碳和能量来源的葡萄糖和蚁酸，适当的酸-碱指示剂以及，选择性的细菌生长抗生素抑制剂和琼脂的碱性无机培养基。

2.权利要求1的培养基，特征在于葡萄糖浓度为0.05％至0.1％(p/v)，优选0.1％(p/v)。

3.按照权利要求1的培养基，特征在于取决于希望的鉴别力和选择性的甲酸浓度是0.1％至0.5％(v/v)，优选0.2％至0.4％(v/v)，更优选0.4％(v/v)。

4.按照权利要求3的培养基，特征在于甲酸浓度优选0.4％(v/v)。

5.按照权利要求1的培养基，特征在于碱性无机培养基包括硫酸铵(0.5％(w/v))，硫酸二氢钾(0.5％(w/v))，七水合硫酸镁(0.05％(w/v))和二水合氯化钙(0.013％(w/v))；低量元素溶液A(0.05％(v/v))包括硼酸(1.0％(w/v))，碘化钾(0.2％(w/v))和二水合钼酸钠(0.4％(w/v))；低量元素溶液B(0.05％(v/v))包括五水合硫酸铜(0.08％(w/v))，六水合氯化铁(0.4％(w/v))，六水合硫酸锰(0.8％(w/v))，六水合硫酸亚锡(0.8％(w/v))和盐酸(HCl 10^-3N，0.8％(v/v))；并且维生素溶液(0.05％(v/v))包括维生素H(0.001％(w/v))，calciumpanthotenate(0.08％(w/v))，mioinositol(4.0％(w/v))，烟酸(0.16％(w/v))，维生素B₆盐酸盐(0.16％(w/v))和维生素B₁盐酸盐(0.16％(w/v))。

6.权利要求1的培养基，特征在于酸-碱指示剂是具有4.5至4.8之间的pK_i的一种，优选溴甲酚绿。

7.权利要求6的培养基，特征在于调节pH至4.3-4.8，优选4.5。

8.按照权利要求1的培养基，特征在于它进一步地含有常规使用浓度的抑菌目的的细菌生长抗生素抑制剂，以便与混合种群的含有细菌的样品一起使用。

9.按照任何的前述权利要求的培养基，特征在于它含有除了琼脂之外的所有组分，它是液体形式。

10.适于拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的鉴别的和选择性培养基，特征在于它由以下组成：

葡萄糖                               0.1％(w/v)

蚁酸                                 0.4％(v/v)

碱性培养基：

硫酸铵                               0.5％(w/v)

硫酸二氢钾                           0.5％(w/v)

七水合硫酸镁                         0.05％(w/v)

二水合氯化钙                         0.013％(w/v)

溴甲酚绿                             0.005％(w/v)

琼脂                                 2.0％(w/v)

低量元素溶液A                        0.05％(v/v)

硼酸                                 1.0％(w/v)

碘化钾                               0.2％(w/v)

二水合钼酸钠                         0.4％(w/v)

低量元素溶液B                        0.05％(v/v)

五水合硫酸铜                         0.08％(w/v)

六水合氯化铁                         0.4％(w/v)

六水合硫酸锰                         0.8％(w/v)

六水合硫酸亚锡                       0.8％(w/v)

盐酸，HCl 10^-3N，0.8％(v/v)

维生素溶液                           0.05％(v/v)

维生素H                              0.001％(w/v)

Calcium panthotenate                 0.08％(w/v)

Mioinositol                          4.0％(w/v)

烟酸                                 0.16％(w/v)

维生素B₆盐酸盐                      0.16％(w/v)

维生素B₁盐酸盐                      0.16％(w/v)]

以1M HCl调节pH至pH4.6。

11.按照任何前述权利要求的培养基，特征在于该培养基如下制备：碱性培养基化合物溶于4/5体积的估计的去离子水，高压灭菌器在121℃完成20分钟的灭菌，其它的培养基化合物溶于剩余体积的水中，以便这些化合物的最终浓度等于预计的值，通过过滤完成灭菌，这种溶液和碱性培养基在其混合之前退火至50±5℃，调节最后的pH至预计值。

12.拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母的检测方法，特征在于采用适于所涉及酵母种的鉴别和选择性的培养基，它包括以维生素，低量元素，作为唯一碳和能量来源的葡萄糖和蚁酸，适当的酸-碱指示剂以及，选择性的细菌生长抗生素抑制剂和琼脂补充的碱性无机培养基。

13.权利要求12的方法，特征在于酸-碱指示剂是溴甲酚绿，以及涉及到培养基接种含有拜列氏接合糖酵母和/或双孢接合糖酵母的样品并且在适合涉及到的酵母生长的条件下培养，通过在大约48小时之后培养基颜色由绿至蓝的变化推断所述酵母种的存在是可行的，并且如果需要，在大约96小时之后通过染蓝色菌落的发育可对所述的酶母种计数。

14.按照权利要求12和13的方法，特征在于它应用至酒以及其它含有或无混合酵母群落的饮料或食品中拜列氏接合糖酵母和双孢接合糖酵母种酵母的检测和计数。

15.按照权利要求1至11的培养基被包括在酵母鉴定途径中的应用。

16.按照权利要求1至11的培养基在工业，尤其在食品和饮料工业中质量和过程控制中的应用。

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