CN105948938B - 一种食用菌的合成培养基及其制备方法和应用 - Google Patents

一种食用菌的合成培养基及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

一种食用菌的合成培养基及其制备方法和应用，具体组分为：碳源：葡萄糖，麦芽糖，纤维二糖；氮源：硝酸铵，L‑天冬氨酸，L‑丝氨酸；无机盐：硫酸镁，氯化钙，硫酸锰，硫酸锌，硫酸铁，硫酸铜；缓冲盐：磷酸二氢钾，磷酸氢二钾；维生素：盐酸硫胺素；吡哆醇；生物素。碳源、氮源、无机盐、缓冲盐加水溶解后，灭菌，加入维生素储备液，混匀得全合成培养基。优点是：成分明确，质量可控，重复性理想，特别适用于侧耳属(Pleurotus sp.)食用菌。

Description

一种食用菌的合成培养基及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种食用菌的合成培养基及其制备方法和应用。
背景技术
食用菌生产中最常用的培养基是马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，以及在此基础上的改良和加富。作为半合成培养基，原料的来源和处理方法对最终产品的影响比较大，难以把控质量。受营养成分限制，菌株长期使用PDA传代，种性退化现象明显，具体表现为畸形菇增加、转化率降低等，并且只有少数的食用菌能够在PDA上实现快速直接出菇。
全合成培养基成分明确，质量稳定，虽然成本比半合成培养基高，但是对食用菌生产中母种(一级种)的稳定性控制是非常必要的。尤其是全合成培养基中杂质极少而且容易追踪，重复性理想，设计合理的全合成培养基能够提供菌丝至子实体发育各个阶段的必须营养从而实现培养基上快速直接出菇，为育种工作提供了一种极其便利的工具。
人工栽培的侧耳属(Pleurotus sp.)食用菌种类繁多，商品名混乱，但是进化上的亲缘关系使侧耳属内食用菌的营养需求和代谢过程存在共性，可以针对性的设计出通用型的培养基。除PDA外，Macaya-Lizano合成培养基也常用来栽培平菇(P.ostreatus)，该培养基的碳氮源单一，缓冲体系弹性小，氮代谢后培养基酸化快，可用范围和子实体结实能力有局限性。
发明内容
本发明目的在于提供一种食用菌的合成培养基及其制备方法和应用，成分明确，质量可控，重复性理想，特别适用于侧耳属(Pleurotus sp.)食用菌。
一种食用菌的合成培养基，该合成培养基包括碳氮源、无机盐、缓冲盐和维生素，溶剂为去离子水或纯水，具体组分和含量为：
碳源：葡萄糖10g/L，麦芽糖5g/L，纤维二糖5g/L；
氮源：硝酸铵0.5g/L，L-天冬氨酸1g/L，L-丝氨酸0.2g/L；
无机盐：硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g/L，氯化钙0.2g/L，硫酸锰(MnSO4·7H2O)0.2g/L，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.2g/L，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.1g/L，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.1g/L；
缓冲盐：磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L；
维生素(最终浓度)：盐酸硫胺素(VB1)100μg/L；吡哆醇(VB6)100μg/L；生物素(VH)100μg/L。
所述合成培养基还包括琼脂，琼脂的量为常规加入量，只需要凝固为固体培养基即可，一般为1.5％～2.0wt％。
一种食用菌的合成培养基的制备方法，其具体步骤为：
(1)、碳源、氮源、无机盐、缓冲盐按比例加水溶解后，灭菌温度115℃～121℃，灭菌时间15min～30min，得溶液A；
(2)、维生素分别配制成浓度10mg/L溶液，用无菌滤膜(≤0.45μm)过滤除菌，得到维生素储备液；
(3)、待溶液A冷却至60℃以下时，以盐酸硫胺素(VB1)100μg/L；吡哆醇(VB6)100μg/L；生物素(VH)100μg/L终浓度计算加入维生素储备液，混匀得全合成培养基。
配制溶液A将碳源、氮源、无机盐、缓冲盐加水溶解后，加入琼脂并煮沸，以制作固体培养基。灭菌后降温至60℃以下时，以盐酸硫胺素(VB1)100μg/L；吡哆醇(VB6)100μg/L；生物素(VH)100μg/L终浓度计算加入维生素储备液，混匀得全合成固体培养基。
一种食用菌的合成培养基在侧耳属(Pleurotus sp.)食用菌培养和保藏中的应用。
本发明的有益效果：
(1)、该合成培养基为全合成培养基，成分明确，质量稳定，重复性理想；
(2)、合成培养基的碳源使用麦芽糖和纤维二糖，增加发育期间碳源储备，同时维持菌株α-糖苷酶和β糖苷酶活性，维持菌株种性防止菌种退化；
(3)、合成培养基的无机氮源使用硝酸铵，促进菌丝快速生长；有机氮源L-天冬氨酸是三羧酸循环中间产物产生的氨基酸，增加氮储备且菌丝利用率高，L-丝氨酸对促进原基萌发形成子实体非常重要；
(4)该合成培养基含有生长必须的多种微量元素和维生素；磷酸缓冲体系有效降低氮源快速利用造成的培养基酸化，有利于增加菌丝生物量，提高菌种质量；
(5)该合成培养基成分明确，质量可控，重复性理想，能够实现培养基上快速直接出菇，特别适用于侧耳属(Pleurotus sp.)食用菌，为育种工作提供了一种极其便利的工具。
具体实施方式
实施例1
使用10L液体发酵罐制作杏鲍菇(P.eryngii)液体菌种，按发酵罐操作规程进行空消后配制食用菌的合成培养基基6L，具体用量为：葡萄糖60g，麦芽糖30g，纤维二糖30g，硝酸铵3g，L-天冬氨酸6g，L-丝氨酸1.2g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)3g，氯化钙1.2g，硫酸锰(MnSO4·7H2O)1.2g，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)1.2g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.6g，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.6g，磷酸二氢钾12g，磷酸氢二钾6g，去离子水6L，实消温度121℃维持30min，得到溶液A。将盐酸硫胺素(VB1)、吡哆醇(VB6)、生物素(VH)分别配制成浓度10mg/L溶液，用无菌滤膜(≤0.45μm)过滤除菌，得到维生素储备液。将溶液A降温至50℃，加入维生素储备液至盐酸硫胺素(VB1)最终浓度为100μg/L；吡哆醇(VB6)最终浓度为100μg/L；生物素(VH)最终浓度为100μg/L，继续降温至30℃，5％接种量接种杏白2号液体母种进行菌丝液体发酵。发酵控制条件为：温度(25±1)℃，搅拌转200r/min，空气压力40kPa～50kPa，通气量1:0.5(V/V·min)，发酵时间72h。
本方法培养的杏鲍菇液体菌种生物量较马铃薯葡萄糖及在此基础上的多种衍生培养基提升20％以上，且菌团均匀致密。液体种接种菌袋后，菌丝萌发时间较其他液体种配方缩短1～2d，萌发后菌丝生长均匀，菌袋个体间差异较小。
实施例2
配制本发明所述培养基1L用于平菇(P.ostreatus)菌种筛检，具体用量为：葡萄糖10g，麦芽糖5g，纤维二糖5g，硝酸铵0.5g，L-天冬氨酸1g，L-丝氨酸0.2g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钙0.2g，硫酸锰(MnSO4·7H2O)0.2g，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.2g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.1g，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.1g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾1g，琼脂16g，纯水1L，灭菌温度121℃维持15min，得到溶液A。将盐酸硫胺素(VB1)、吡哆醇(VB6)、生物素(VH)分别配制成浓度10mg/L溶液，用无菌滤膜(≤0.45μm)过滤除菌，得到维生素储备液。溶液A降温至55℃加入维生素储备液至盐酸硫胺素(VB1)最终浓度为100μg/L；吡哆醇(VB6)最终浓度为100μg/L；生物素(VH)最终浓度为100μg/L，得到全合成固体培养基。使用90mm无菌平皿铺制全合成固体培养基，20mL培养基/平皿，制作固体平板，冷却后37℃空白培养检查是否染菌。确认无菌后，使用组织分离法在平菇黑平美丰子实体菌盖与菌柄连接处取内部组织块接种于固体平板。
本方法筛检组织分离法获得的平菇黑平美丰菌株，25℃暗培养(7±1)d菌丝可长满平皿，9d后放置于人工气候箱，控制温度20℃、光照100Lux、相对湿度80％，12～15d可见原基形成，并直接在固体培养基上产生子实体。有效缩短育种周期，减少人力物力投入。
实施例3
配制本发明所述培养基1L用于小平菇(P.cornucopiae)菌种继代保藏，具体用量为：葡萄糖10g，麦芽糖5g，纤维二糖5g，硝酸铵0.5g，L-天冬氨酸1g，L-丝氨酸0.2g，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g，氯化钙0.2g，硫酸锰(MnSO4·7H2O)0.2g，硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.2g，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)0.1g，硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.1g，磷酸二氢钾2g，磷酸氢二钾1g，琼脂16g，纯水1L，灭菌温度115℃维持15min，得到溶液A。将盐酸硫胺素(VB1)、吡哆醇(VB6)、生物素(VH)分别配制成浓度10mg/L溶液，用无菌滤膜(≤0.45μm)过滤除菌，得到维生素储备液。溶液A降温至55℃加入维生素储备液至盐酸硫胺素(VB1)最终浓度为100μg/L；吡哆醇(VB6)最终浓度为100μg/L；生物素(VH)最终浓度为100μg/L，得到全合成固体培养基。使用20mm×200mm无菌试管分装制作斜面培养基，冷却后37℃空白培养检查是否染菌。确认无菌后，取待保藏菌株辽平16#菌块接种于本斜面培养基。
本方法保藏菌株辽平16#，接种后25℃暗培养9d至菌丝长满，置4℃冰箱冷藏保存，20d后取出1支进行转管传代，连续传代5次。传代株与原始保存株平行出菇试验检测产量未见显著减退，总体转化率仍达到130％以上。使用PDA培养基继代保存，连续传代5次，辽平16#菌株种性退化明显，转化率降低至110％，且出菇同步性变差。
以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种食用菌的合成培养基在侧耳属食用菌保藏中的应用，其特征是：
该食用菌的合成培养基包括碳氮源、无机盐、缓冲盐和维生素，溶剂为去离子水或纯水，具体组分和含量为：
碳源：葡萄糖10g/L，麦芽糖5g/L，纤维二糖5g/L；
氮源：硝酸铵0. 5g/L，L-天冬氨酸1g/L，L-丝氨酸0.2g/L；
无机盐：MgSO4·7H2O 0.5g/L，氯化钙0.2g/L，MnSO4·7H2O 0.2g/L， ZnSO4·7H2O0.2g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，CuSO4·5H2O 0.1g/L；
缓冲盐：磷酸二氢钾2g/L，磷酸氢二钾1g/L；
维生素：盐酸硫胺素（VB1）100μg/L；吡哆醇（VB6）100μg/L；生物素（VH）100μg/L；
该食用菌的合成培养基还包括琼脂。
2.根据权利要求1所述的食用菌的合成培养基在侧耳属食用菌保藏中的应用，其特征是：
所述食用菌的合成培养基的制备具体步骤为：
（1）、碳源、氮源、无机盐、缓冲盐按比例加水溶解后，加入琼脂并煮沸，灭菌温度115℃～121℃，灭菌时间15min～30min，得溶液A；
（2）、维生素分别配制成浓度10mg/L溶液，用无菌滤膜过滤除菌，得到维生素储备液；
（3）、待溶液A冷却至60℃以下时，以盐酸硫胺素（VB1）100μg/L；吡哆醇（VB6）100μg/L；生物素（VH）100μg/L终浓度计算加入维生素储备液，混匀得全合成培养基。
3.根据权利要求2所述的食用菌的合成培养基在侧耳属食用菌保藏中的应用，其特征是：所述无菌滤膜的孔径≤0.45μm。
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