PT102305A

PT102305A - Meio de cultura para a deteccao das leveduras zygosaccharomyces bailii e zygosaccharomyces bisporus

Info

Publication number: PT102305A
Application number: PT10230599A
Authority: PT
Inventors: Cecilia Leao; Manuela Corte-Real; Dorit Schuller
Original assignee: Univ Do Minho; Stab Tratamento De Aguas E Bio
Priority date: 1999-05-31
Filing date: 1999-05-31
Publication date: 2000-11-30
Also published as: ZA200109748B; NZ515657A; PT102305B; CN1367842A; WO2000073494B1; BR0011107A; AU5116300A; CA2375111A1; WO2000073494A1; JP2003501047A; EP1185685A1

Description

1 V

Meio de cultura para a detecção das leveduras Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus

A presente invenção refere-se a um meio de cultura, selectivo ou diferencial, para a detecção, a partir de 48 horas, das leveduras Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus, duas das mais perigosas espécies em termos de deterioração alimentar. Este meio constitui uma alternativa às técnicas convencionais para o despiste rápido destas espécies, permitindo reduzir drasticamente o tempo e trabalho envolvido na identificação convencional destas espécies. Com efeito, normalmente, o estudo da microflora de leveduras presentes nos mais diversos habitats (e.g. alimentos, natureza) envolve uma primeira fase de isolamento das estirpes, através da utilização de meios de cultura selectivos para leveduras em geral, e uma segunda fase de identificação das estirpes isoladas, através da utilização de métodos convencionais e/ou baseados na biologia molecular. Estes métodos clássicos de identificação de leveduras baseiam-se numa série de características de reprodução vegetativa e sexual, e incluem uma vasta gama de testes fisiológicos e bioquímicos. Trata-se de um trabalho muito exigente, que não dá resultados em menos de uma ou duas semanas, e que requer muita experiência para uma correcta interpretação dos resultados. Os métodos de identificação baseados na biologia molecular são, em regra, mais céleres que os clássicos, mas também exigem alguma experiência do operador e envolvem equipamentos e reagentes dispendiosos.

O meio de cultura a que se refere a invenção garante resultados a partir das 48 horas de incubação. Esse meio de cultura é constituído por um meio base mineral, suplementado com vitaminas, oligoelementos e fontes de carbono e de energia O meio base apresenta a seguinte composição: sulfato de amónia (0,5%, p/v), dihidrogenofosfato de potássio (0,5%, p/v), sulfato de magnésio heptahidratado (0,05%, p/v), cloreto de cálcio dihidratado (0,013%, p/v), verde de bromocresol (0,005%, p/v) e agar (2%, p/v), devendo o pH ser acertado a 4,50 ± 0,05 com um ácido forte. Os compostos do meio base são dissolvidos em 4/5 do volume previsto de água desionizada. A esterilização é realizada em autoclave, a 121°C, durante 20 minutos. No volume restante de água são dissolvidos os seguintes compostos do meio: glucose (0,1%, p/v), ácido fórmico (0,4%, v/v), solução de oligoelementos A (0,05% v/v), solução de oligoelementos B (0,05% v/v), solução de vitaminas (0,05% v/v) devendo o pH ser acertado a 4,50 ± 0,05 com HC1 1 M. Esta solução é esterilizada por filtração. Esta solução e o meio base são temperadas a 2

50 ± 5°C antes da sua mistura. O meio completo é homogeneizado e distribuído assepticamente por caixas de Petri. A solução de oligoelementos A tem a seguinte composição: H3BO3 (1%, p/v), Kl (0,2%, p/v), Na2MoC>4 · 2 H2O (0,4%, p/v). A solução de oligoelementos B tem a seguinte composição: CUSO4 · 5 H2O (0,08%, p/v), FeCl3 · 6 H20 (0,4%, p/v), MnS04 · 4 H20 (0,8%, p/v), ZnS04 · 7 H20 (0,8%, p/v) e e ácido clorídrico (HC1, 0,012 % v/v). A solução de vitaminas tem a seguinte composição: bíotina (0,001%, p/v), pantotenato de cálcio (0,08%, p/v), mio-inositol (4%, p/v), niacina(0,16%, p/v), hidrocloreto de piridoxina (0,16%, p/v) e hidrocloreto de tiamina (0,16%, p/v).

De acordo com a invenção, as células são inoculadas neste meio por espalhamento, estriamento ou aplicação de uma gota de suspensão celular, e incubadas, preferencialmente, a 30°C. O indicador ácido-base (verde de bromocresol) no meio confere-lhe uma coloração verde que é convertida a azul pelas leveduras Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus. Adicionalmente, a mudança rápida de cor das colónias para azul é uma característica específica destas espécies e pode ser visível no meio a partir 48 horas de incubação. A presente invenção pode ser aplicada a estirpes previamente isoladas e purificadas, não havendo qualquer restrição no tipo de inoculação a efectuar. Contudo, o tempo necessário à vizualização da viragem do indicador depende da concentração celular do inoculo e da metodologia de inoculação de acordo com a seguir discriminado: i) a aplicação de uma suspensão celular densa (106 a 108 cel/ml) sob a forma de uma gota conduz à viragem do indicador ao fim de 48 horas, ii) a inoculação, por espalhamento, de uma suspensão de células (1 a 3xl03 cel/ml) permite avaliar o número de colónias a partir de 96 horas. Pode, ainda, ser aplicado a suspensões celulares de populações mistas de leveduras, para além de Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus, dando indicações sobre a presença destas espécies, sempre que se registe uma alteração na cor do meio ou da colónia. O processo de acordo com a presente invenção será ilustrado, seguidamente, através de exemplos:

Exemplo! O meio de cultura é constituído por um meio mineral base, suplementado com vitaminas, oligoelementos e fontes de carbono e de energia. O meio base apresenta a seguinte composição: sulfato de amónia (0,5%, p/v), dihidrogenofosfato de potássio (0,5%, p/v), sulfato de magnésio heptahidratado (0,05%, p/v), cloreto de cálcio dihidratado (0,013%, p/v), verde de bromocresol (0,005%, p/v) e agar (2%, p/v), 3

devendo o pH ser acertado a 4,50 ± 0,05 com um ácido forte. Os compostos do meio base são dissolvidos em 4/5 do volume previsto de água desionizada. A esterilização é realizada em autoclave, a 121°C, durante 20 minutos. No volume restante de água são dissolvidos os seguintes compostos do meio: glucose (0,1%, p/v), ácido fórmico (0,4%, v/v), solução de oligoelementos A (0,05% v/v), solução de oligoelementos B (0,05% v/v), solução de vitaminas (0,05% v/v) devendo o pH ser acertado a 4,50 ± 0,05 com um ácido forte. Esta solução é esterilizada por filtração. Esta solução e o meio base são temperadas a 50 ± 5°C antes da sua mistura. O meio completo é homogeneizado e distribuído por placas de Petri. A solução de oligoelementos A tem a seguinte composição: H3BO3 (1%, p/v), Kl (0,2%, p/v), Na2MoC>4 · 2 H2O (0,4%, p/v). A solução de oligoelementos B tem a seguinte composição: CUSO4 · 5 H2O (0,08%, p/v), FeCl3 · 6 H20 (0,4%, p/v), MnS04 · 4 H20 (0,8%, p/v), ZnS04 · 7 H20 (0,8%, p/v) e ácido clorídrico (HC1,0,012 % v/v). A solução de vitaminas tem a seguinte composição: biotina (0,001%, p/v), pantotenato de cálcio (0,08%, p/v), mio-inositol (4%, p/v), niacina (0,16%, p/v), hidrocloreto de piridoxina (0,16%, p/v) e hidrocloreto de tiamina (0,16%, p/v). O indicador ácido-base (verde de bromocresol) no meio confere-lhe uma coloração verde que é convertida a azul pelas espécies Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus. Adicionalmente, a mudança de cor das colónias para azul é uma característica específica destas espécies e pode ser visível no meio a partir 48 horas de incubação.

Cada uma das estirpes de levedura a identificar, previamente isolada, é inoculada neste meio, sob a forma de estriamento ou de uma simples risca, e incubada a 30°C. Todas as estirpes em que o meio fica azul a partir de 48 horas de incubação pertencem às espécies Zygosaccharomyces bailii ou Zygosaccharomyces bisporus.

Exemplo 2

Como o exemplo 1, mas em que, ao invés de se inocular células de meio sólido se inoculam suspensões de células de uma estirpe. O procedimento para a inoculação é o referido no texto introdutório desta secção e os resultados obtidos são idênticos aos descritos no exemplo 1.

Exemplai

Como o anterior, mas aplicado a suspensões celulares de populações mistas de leveduras, para além de Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus. Neste caso, para inocular, filtra-se sob vácuo, através de uma membrana filtrante esterelizada (porosidade de 0,45 pm), uma alíquota da suspensão. Os resultados são similares aos descritos no exemplo 1, e permitem concluir que a suspensão contém ou não células das espécies Zygosaccharomyces baitíi e/ou Zygosaccharomyces bisporus, consoante ocorram ou não colónias de coloração azul. E*çmplp_4

Como os exemplos 1 e 3, mas utilizando ácido fórmico nas concentrações 0,2 ou 0,3 (%, v/v). Todas as estirpes em que as colónias ficam azuis após 96 horas de incubação pertencem às espécies Zygosaccharomyces bailii e/ou Zygosaccharomyces bisporus. Adicionalmente, no caso de aparecimento no meio de colónias de coloração não azul, permite concluir a presença de leveduras pertencentes a outras espécies.

Nesta situação o meio comporta-se como diferencial.

Eaemploi

Como os exemplos 1 e 3, mas utilizando ácido fórmico na concentração 0,5 (%, v/v). Todas as estirpes em que as colónias ficam azuis após 96 horas de incubação pertencem às espécies Zygosaccharomyces bailii dou Zygosaccharomyces bisporus. Nesta situação o meio comporta-se como selectivo não permitindo o crescimento de outras espécies que possam estar presentes na amostra.

Exemplo 6

Como o exemplo 1, mas utilizando o meio sem agar distribuído em tubos de ensaio ou em microplacas. Todas as estirpes que conduzirem a uma viragem da cor do meio de verde para azul a partir das 48 horas de incubação pertencem às espécies Zygosaccharomyces bailii ou Zygosaccharomyces bisporus.

Braga, 25 de Maio de 1999

Universidade do Minho

Os requerentes

Claims

Reivindicações: Ia Meio de cultura diferencial caracterizado pelo facto de ser um método para detectar rapidamente leveduras das espécies Zygosaccharomyces bailii e Zygasaeeharamyce.fi bisporus, constituído por sulfato de amónia (0,5%, p/v), dihidrogenofosfato de potássio (0,5%, p/v), sulfato de magnésio heptahidratado (0,05%, p/v), cloreto de cálcio dihidratado (0,013%, p/v), verde de bromocresol (0,005%, p/v), glucose (0,1%, p/v), ácido fórmico (0,4%, v/v), pH 4,50 ± 0,05, agar (2%, p/v), vitaminas e oligoelemenlos. 2a Meio de cultura diferencial de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto das leveduras das espécies Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus, quando crescidas neste meio, conduzirem a uma viragem de cor do meio, de verde para azul, a partir de 48 horas, constituindo um método para o despiste rápido de leveduras destas espécies. 3a Meio de cultura diferencial de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um método para a detecção de leveduras das espécies Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus, pelo facto destas espécies conduzirem a uma viragem da cor do meio de verde para azul ou à formação de colónias azuis, quando crescidas num meio contendo glucose, ácido fórmico e verde de bromocresol. 4a Meio de cultura diferencial de acordo com a reivindicação 1, 2 e 3, caracterizado por ser um método para a detecção de leveduras das espécies Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus em vinhos, ou outros produtos alimentares contendo populações mistas de leveduras. 1 5' Meio de cultura diferencial de acordo com a reivindicação 1, 2 e 3, caracterizado por conter todos os componentes à excepção do agar, para detec.tar leveduras das espécies Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus em vinhos, ou outros produtos alimentares contendo populações mistas de leveduras. Meio de cultura diferencial de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um método para a detecção de leveduras das espécies Zygosaccharomyces bailii e Zygosaccharomyces bisporus ,a integrar em galerias de testes de identificação de leveduras. Braga, 13 de Outubro de 1999 Os Requerentes O Reitor da Universidade do Minho

Sociedade de Tratamento de Águas e Biotecnologia