CN1272444C - 一种用于降解纤维素的反胶束方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于降解纤维素的反胶束方法，首先将纤维素酶溶解于缓冲液得到缓冲液A；其次配备含有表面活性剂的有机溶液B；第三是将溶液A与溶液B均匀混合，形成溶液C；第四是待溶液C形成均一透明体系后，加入微晶纤维素；第五是加入10倍于溶液A体积的磷酸缓冲液和与溶液C等体积的萃取剂，剧烈震荡后离心使溶液分层，取出上层溶液即为降解产物葡萄糖溶液。本方法具有反应效率高，生产过程安全、降解成本低的优点，同时生产过程设备简单，具有很好的工业化生产前景。

Description

一种用于降解纤维素的反胶束方法

技术领域：

本发明属生物能源技术开发与产业化的领域，具体地说，本发明涉及一种用于降解纤维素的反胶束方法。该方法将反胶束应用于纤维素酶催化水解纤维素这一具有重要应用前景的生物酶催化反应，产品葡萄糖则进一步加工为饲料、食粮、化学原料、微生物蛋白、氨基酸、抗生素等产品，从而开发出废弃纤维素的生物降解无污染新工艺，实现纤维素类生物质(如农作物秸秆等)的综合利用。该方法有效地克服传统酶水解法的缺陷，使得纤维素降解效率极大提高。

背景技术：

反胶束是表面活性剂在非极性有机溶剂为本体的溶液中的聚集体，具有极性的内腔和非极性的外壳。反胶束的一个重要性质是能增溶一定量的水分子(称为核心水团或“水池”)，水溶性的酶分子又可增溶在反胶束的“水池”中。由于反胶束中的“水池”为纳米级空间，以此空间为反应场可合成1～100nm的纳米材料，因此又将其称为纳米反应器。固定在反胶束中的酶学研究为介质工程带来了新的革命。利用反胶束包覆可使酶溶解在极性“水池”中，而一些水不溶性化合物，如胆固醇、生物碱、脂类等则溶解在非极性有机溶剂中，作为酶催化的底物进行了转化。利用酶作用的专一性，还可能实现生物催化的手性合成。反胶束体系作为酶反应介质，具有组成灵活、热力学稳定、界面积大、可通过相调节来实现产物回收等优点，因此近年来受到人们的普遍关注。其中研究最多的是肽的合成和脂肪酶的催化反应。如Xin0等研究了AOT/正辛烷的反胶束体系中α2胰凝乳蛋白酶催化合成肽衍生物的反应，得到56％～88％的产率；Tsai等研究了AOT/异辛烷/磷酸缓冲液中脂肪酶催化油脂水解反应时表面活性剂浓度对CabdidaRngosa脂肪酶(CRL)水解活力的影响；Chen等在反胶束体系中用不同的蛋白酶合成了二肽。随着研究的不断深入，在反胶束体系中进行酶的催化合成反应不仅仅是在理论方面，而且在应用开发上同样具有广阔的前景。

纳米反应器中的酶分子往往表现出超活性。从结构上说，反胶束十分类似于生物膜的脂双层结构，当使用疏水性底物(如纤维素)时，人们能研究底物分子分配在纳米反应器和有机相中的酶促反应动力学，同时由于反胶束的巨大比表面和它的极性内腔与非极性外壳间的超短距离，且反胶束微粒间的碰撞频率极高，其间的传质速率极快，为酶与底物的作用提供了最佳的微环境，因而可有效提高纤维素酶的催化效率和末端产物葡萄糖的收率。最近反胶束技术已被成功地应用于研究二氢叶酸还原酶、钙离子-ATP酶、β-乳酸酶和葡萄糖氧化酶等。

纤维素是地球上最丰富的可再生性自然资源，木质纤维材料生物量的全利用无疑将是新的千年中对人类最为重要的生物技术之一。人类对纤维素的利用，迄今为止主要限于将木材直接作为建筑材料或加工成纸、纤维等，其废弃物则作为堆肥或儿乎用焚烧处理。美国化学会认为，将来能代替石油的唯一的化学原料就是每年超过2亿吨的废弃纤维素。同时由于我国是一个农业大国，农产废弃纤维素(如稻草、麦秆等)的年产量非常巨大，因此积极开展纤维素生物降解的研究对缓解人类的粮食和能源危机、加速我国天然资源再生利用的发展具有重大意义，同时在环境污染的防治和良性生态系统的建立上也会发挥重要作用。

将纤维素分解为葡萄糖的手段有酸水解法和传统酶水解法。酸水解法需高温、高酸条件和耐酸耐压容器，葡萄糖的收率虽可达50％，但严重污染环境，所以现在已被弃用。传统酶水解法则克服了酸水解法的许多不足。天然纤维素在水溶液中由纤维素酶系(包括内切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶)催化水解为葡萄糖的机理，目前尚不十分清楚，但一般认为首先由前两者将纤维素催化分解为纤维二糖等低聚糖，然后由β-葡萄糖苷酶将这些低聚糖水解为葡萄糖。虽然纤维素的酶水解法已进行了不少颇有成效的研究，但将纤维素以工业规模转换成葡萄糖的无污染新工艺尚末实现，这主要是由于天然纤维素为疏水性底物，在水溶液中的溶解度较差而造成传统酶水解法中葡萄糖的收率尚不足50％。

在中国专利网中，涉及反胶束的专利较少，共有10项，其中有8项是以制备纳米级化学物质为内容的。涉及纤维素生物降解的专利共47项，但这些专利无一涉及本项目——反胶束体系中纤维素高效降解的新方法。我国专利CN02289267“纤维素固相酶解——液体发酵耦合制备乙醇的装置”，该装置可降低酶解液中糖类对纤维素的抑制作用，从而有利于工业生产乙醇；我国专利CN97125800“从碱金属的硅酸盐制备纳米二氧化硅颗粒的方法”，涉及到在反胶束中制备纳米二氧化硅颗粒的新方法。国外涉及反胶束的专利有200多项，主要集中化学物质的制备合成，生物分子的萃取分离，以及不同类型反胶束体系的制备，也有一些是对反胶束中化学反应的方法研究。美国专利US 2004009117“Preparation of nanosizedcopper(I)compounds”，涉及反胶束中制备纳米级铜化合物颗粒的新方法。美国专利03190471名称是“Nanoparticle manganese zinc ferrites synthesized using reverse micelles”，报道了一种在反胶束中制备铁酸锌锰纳米级颗粒的新方法。世界专利WO03051333名称是“Reverse-micellar delivery system for controlledtransportation and enhanced absorption ofagents”，该专利涉及利用反胶束体系作为一种跨膜转运系统，从而提高肠吸收功能。目前反胶束系统中大分子物质的降解仍属于空白领域。

发明内容：

本发明的目的是在于提供一种用于降解纤维素的反胶束方法，该方法简单易行且操作方便，酶需求量少、使用方便高效。有利于纤维素酶解的反胶束环境，提高了纤维素的降解效率和产品获得率，且反应效率高，生产过程安全、降解成本低廉。

为了实现上述任务，本发明采用以下技术方案：本发明设计的反胶束系统能够在包含的“水池”(即反胶束体系的核心水团，为反胶束增溶的一定量水分子所形成)中加入纤维素酶(一种多组分的复合酶，主要有3种组分：即内切型β-葡聚糖酶，外切型β-葡聚糖纤维二糖水解酶和β-葡萄糖苷酶)，在体系中加入纤维素。纤维素酶在保持甚至增强活性的基础上与纤维素结合并进行降解，释放产物葡萄糖。产物溶于“水池”中，可以通过萃取的方法从体系中得到分散液，而后从中分离得到。利用本发明提供反胶束体系来进行纤维素的酶解，能在短时间(10分钟～24小时)内大量降解纤维素并获取产物葡萄糖，相对传统的酸水解或水溶液体系中的酶解等模式更加方便、高效。

本发明设计的反胶束体系是由表面活性剂(如Triton X-100、AOT等)溶解在有机溶剂(如二甲苯或正己醇或异辛烷等)中自发形成的、热力学稳定的、光学透明的球形聚集体(如图1所示)。其特点在于反胶束有一个由表面活性剂分子(如Triton X-100、AOT等)的烃链组成的外壳，疏水尾指向有机溶剂(如二甲苯或正己醇或异辛烷等)，极性头指向聚集体内部形成极性腔。水分子在极性腔中形成纳米尺寸的水池。

本发明设计中的磷酸缓冲液，为柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液或磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液。

本发明提供了一种降解纤维素的反胶束方法，它含有下列步骤：

A、室温下(20～25℃)，配置pH5.2～6.4的含有纤维素酶的缓冲溶液(A)，其中纤维素酶的浓度为30～900μM；

B、配备含有表面活性剂的有机溶液(B)，其中表面活性剂的浓度为0.01～0.20M；表面活性剂为聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton X-100)或2-乙基己基琥珀酸钠(AOT)；有机溶剂是二甲苯或正己醇或异辛烷；

C、将适量溶液A和溶液B均匀混合，使得纤维素酶分子在混合液中的浓度为0.15～4.5μM，纤维素酶分子被包含于形成的反胶束体系的水池中，形成溶液C；

D、静置15～25秒，待溶液C形成均一稳定的透明体系后，按0.9～10g/l的比例向其中加入微晶纤维素。所述微晶纤维素在30～60℃反应10分钟～24小时后被充分降解；

E、加入10倍于溶液A体积的磷酸缓冲液及与溶液C等体积的萃取剂(氯仿)，剧烈振荡后以3000～4000rpm的转速高速离心5～10分钟，使溶液分层。取出上层溶液，即为降解产物葡萄糖溶液。

从结构上说，反胶束十分类似于生物膜的脂双层，同时由于反胶束的巨大比表面和它的极性内腔与非极性外壳间的超短距离，而且反胶束微粒间的碰撞频率极高，其间的传质速率极快，这为酶与底物的作用提供了最佳的微环境，因而可有效提高纤维素酶的催化效率和纤维素降解并能源化的效率。该方法将反胶束应用于纤维素酶催化水解纤维素这一具有重要应用前景的生物酶催化反应，产品葡萄糖则进一步加工为饲料、食粮、化学原料、微生物蛋白、氨基酸、抗生素等产品，从而开发出废弃纤维素的生物降解无污染新工艺，实现纤维素类生物质(如农作物秸秆等)的综合利用。该方法生产过程设备简单，具有良好的工业前景。图2的实验结果说明，与在相同条件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纤维素酶解的结果相比，反胶束体系尤其是Triton X-100反胶束体系中进行的纤维素酶解效率得到了显著的提高，产物葡萄糖溶液的浓度提高了30多倍。实验证明，本发明可有效地克服传统酶水解法的缺陷，使得纤维素降解效率极大提高。此外，该方法中使用的反胶束体系各有机组分可以通过精馏回收技术重复使用，从而减少环境污染，并进一步降低了成本。

附图说明：

图1为反胶束体系结构示意图。图中A为水分子在反胶束极性内腔中形成的纳米尺寸的水池；B为有机相(如二甲苯或正己醇或异辛烷等)；C为单个表面活性剂分子(如Triton X-100、AOT等)；

图2为Triton X-100和AOT两种反胶束体系以及水溶液中纤维素酶解后产物葡萄糖溶液的浓度比较，图中“T”型标识为误差。由图2可见，与在相同条件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纤维素酶解的结果相比，反胶束体系尤其是Triton X-100反胶束体系中进行的纤维素酶解效率得到了显著的提高。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：赵永芳主编，武汉大学出版社，2002，生物化学技术原理及其应用(第三版)；周科衍、高占先主编，高等教育出版社，1997，有机化学实验(第三版)；陈毓荃，科学出版社，2002，生物化学实验方法和技术。

实施例1：利用表面活性剂AOT形成的反胶束降解微晶纤维素的方法

1.室温下(25℃)，配制1ml pH6.0的纤维素酶缓冲溶液(缓冲液的配制方案参看生物化学技术原理及其应用)，浓度为380μM，记为溶液A；

2.取0.15mmol 2-乙基己基琥珀酸钠(AOT)溶于3ml异辛烷，剧烈振荡后静置备用，记为溶液B：

3.从溶液A中取14μl与溶液B混合，剧烈振荡后静置20秒，待其均一透明后，即为包含有纤维素酶分子的反胶束体系；

4.将上述体系在50℃条件下保温10分钟后加入10mg微晶纤维素，在恒温摇床中充分反应10分钟(50℃，220rpm)；

5.此后加入140μl磷酸缓冲液和3ml氯仿，剧烈振荡后以3000rpm的转速高速离心5分钟，使溶液分层。上层无色透明，为产物葡萄糖溶液(本步为萃取操作，参看生物化学实验方法和技术)；

6.用硫酸蒽酮法(参看生物化学实验方法和技术)测定产物葡萄糖的分解液，得到产物溶液中的葡萄糖含量，同时与相同条件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纤维素酶解的结果相比较，结果如图2所示。从图2可以看出，在AOT反胶束体系中进行的纤维素酶解效率要大大高于水溶液中进行的酶解反应效率。详细数据如下表所示(T＝50℃，pH＝6.0)：

反应体系	AOT反胶束体系	水溶液体系
			葡萄糖浓度(μg/ml)	4.54	0.83

实施例2：利用表面活性剂Triton X-100形成的反胶束降解微晶纤维素的方法

1.室温下(25℃)，配制1ml pH6.0的纤维素酶缓冲溶液(缓冲液的配制方案参看生物化学技术原理及其应用)，浓度为400μM，记为溶液A；

2.取0.15mmol聚氧乙烯烷基苯基醚(Triton X-100)溶于1ml二甲苯中，再加入2ml正己醇，剧烈振荡后静置备用，记为溶液B；

3.从溶液A中取18μl与溶液B混合，剧烈振荡后静置约15秒，待其均一透明后，即为包含有酶分子的反胶束体系；

4.将体系在50℃条件下保温10分钟后加入10mg微晶纤维素，在恒温摇床中充分反应10分钟(50℃，220rpm)；

5.此后加入180μl磷酸缓冲液和3ml氯仿，剧烈振荡后以3500rpm的转速高速离心8分钟，使溶液分层。上层无色透明，为产物葡萄糖溶液(本步为萃取操作，参看生物化学实验方法和技术)；

6.用硫酸蒽酮法(参看生物化学实验方法和技术)测定产物葡萄糖的分解液，得到分解液中的葡萄糖含量，同时与相同条件(T＝50℃，pH＝6.0)下水溶液中纤维素酶解的结果相比较，结果如图2所示。从图2可以看出，在反胶束体系尤其是Triton X-100反胶束体系中进行的纤维素酶解效率要大大高于水溶液中进行的酶解反应效率。详细数据如下表所示(T＝50℃，pH＝6.0)：

反应体系	Triton X-100反胶束体系	水溶液体系
			葡萄糖浓度(μg/ml)	28.63	0.83

Claims (1)

1、一种用于降解纤维素的反胶束方法，其特征在于，它含有下列步骤：

A、室温下，配制pH5.2～6.4含有纤维素酶的缓冲溶液A，其中纤维素酶的浓度为30～900μM；

B、配备含有表面活性剂的有机溶液B，其中表面活性剂的浓度为0.01～0.20M；表面活性剂为聚氧乙烯烷基苯基醚或2-乙基己基琥珀酸钠；有机溶剂是二甲苯或正己醇或异辛烷；

C、将溶液A和溶液B均匀混合，使得纤维素酶分子在混合液中的浓度为0.15～4.5μM，纤维素酶分子被包含于形成的反胶束体系的水池中，形成溶液C；

D、静置15～25秒，待溶液C形成透明体系后，向其中加入微晶纤维素，使纤维素在体系中的浓度为0.9-10g/l，所述微晶纤维素在30～60℃反应1～24小时后被充分降解；

E、加入10倍于溶液A体积的磷酸缓冲液及与溶液C等体积的氯仿，振荡后以3000～4000rpm的转速离心5～10分钟，使溶液分层，取出上层溶液，即为降解产物葡萄糖溶液。

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