CN100402088C - 低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物的制备方法及产品 - Google Patents

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Abstract

低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物的制备方法，包括如下步骤：选料清洗、粉碎匀浆、蛋白酶水解、催化裂解、灭菌消毒、过滤或超滤截留、浓缩干燥和包装。本发明能够得到低分子量的氨基多糖胶原蛋白复合物，利于人体吸收和利用，克服了目前同类产品中大分子氨基多糖难以吸收利用的缺陷，因而可大大提高其作用效果。利用该产品可制造出多种医疗保健产品。可广泛添加于各种食品、饮料中，也可用于化妆美容行业，特别是用于防治关节疾病，如颈椎病、膝关节炎等。

Description

低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物的制备方法及产品
技术领域
本发明涉及低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物及制备方法和用途。
背景技术
胶原蛋白是机体结缔组织(包括软骨、骨骼、肌腱、韧带和皮肤等)的主要结构蛋白。其主要作用是支持和联接细胞。机体含有12至19种不同的胶原蛋白，其中一型、二型和三型胶原蛋白的含量最高。一型和三型胶原蛋白主要存在于皮肤、肌腱和硬骨骼，而二型胶原蛋白则专一性地存在于软骨组织。与一般蛋白质不同，胶原蛋白不仅含有非常高的甘氨酸和脯氨酸，而且还含有其它两种特殊的氨基酸-羟基脯氨酸和羟基赖氨酸。二型胶原蛋白是软骨的主要结构蛋白，占软骨胶原蛋白总量的90％以上，较其它胶原蛋白含有更多的羟基赖氨酸。
胶原蛋白水解物广泛用于化妆美容，在欧洲国家已广泛的用于关节疾病的防治。临床试验证明每天服用10克胶原蛋白水解物对关节炎引起的关节疼痛具有明显的减缓作用。最近Oesser等人(Cell Tissue Res 311：393-399，2003)科学研究证明胶原蛋白水解物能促进软骨细胞合成和分泌二型胶原蛋白。二型胶原蛋白是生物软骨的主要结构蛋白。美国专利(US5399347)和Trentham等人(Science 261：1727-1729，1993)也披露水溶性鸡二型胶原蛋白及由此制得的生物活性肽对类风湿性关节炎有明显的疗效。其作用一般认为是通过对自身抗原的口服忍耐性。
临床试验证明氨基多糖能减缓关节疼痛和促进机体结缔组织的修复。氨基多糖是软骨的主要组成成份之一，包括硫酸软骨素和透明质酸等。
天然硫酸软骨素是生物结缔组织的大分子聚合物，平均分子量约40,000-50,000道尔顿，分为三种类型：硫酸软骨素A、B和C。研究表明硫酸软骨素A具有抗炎作用，能够改善血液循环，减少心血管疾病，以及维持关节的结构的作用。硫酸软骨素B，又称硫酸角质素，分布于皮肤组织，对维持皮肤的粘弹性起主要的作用。硫酸软骨素C能够抑制弹性蛋白酶的作用，而弹性蛋白酶则是关节软骨降解的主要蛋白酶。总之，硫酸软骨素对维持生物结缔组织有着极其重要的作用。
目前硫酸软骨素主要来源于贝类、沙鱼软骨和其它生物软骨。硫酸软骨素注射液在心血管疾病的治疗方面早已得到广泛的使用。近来发现硫酸软骨素对关节炎的防治有明显的疗效。然而与其它氨基多糖一样，天然的硫酸软骨素分子量大，不能被人体充分的吸收，因此利用率低、疗效差。研究证明硫酸软骨素的生物活性与其分子量的大小有着密切的关系。美国专利(US3405120)披露：平均分子量为2,000-6,000道尔顿的硫酸软骨素药理活性较强，对防止动脉粥样硬化、风湿性关节炎和伤口愈合等方面具有更好的疗效。CHO等人(Biol.Pharm.Bull.27(1)47-51，2004)研究证明低分子量硫酸软骨素较天然大分子量硫酸软骨素更易吸收，对关节炎作用更好。
透明质酸是另一种氨基多糖，它不仅存在于软骨组织，而且还广泛分布于其它结缔组织，例如眼睛玻璃体、关节滑腔液以及皮肤组织。透明质酸主要起润滑剂的作用，保护关节免受冲击和有助于机体保持皮肤水分等。随年龄的增长，机体中透明质酸的含量逐渐减少，健康问题也就会随之发生，例如50岁以上的人，一般皮肤就会丧失粘弹性，产生皱纹。透明质酸也是关节滑液的主要成份，对关节起着极其重要的润滑作用。关节炎患者关节滑液中透明质酸的含量大大降低。补充关节滑液中透明质酸的量就会减缓关节炎的临床症状。近年来关节腔内注射透明质酸已广泛地用于减缓关节炎引起的疼痛。
透明质酸一般来源于动物组织，如鸡冠，或者来源于微生物发酵。天然透明质酸的分子量特大，可达107道尔顿，不能穿过表皮或被机体吸收进入血液，因此限制了其应用范围。天然的大分子透明质酸一般用于眼睛手术、化妆品和关节腔内注射等领域。
近年来，低分子量透明质酸的生理活性及其应用也得到越来越大的重视。例如，美国专利(US5646129)披露使用小分子透明质酸可诱导骨质再生。Noble等人(J.Clin.Inv.，vol.91，page 2163，1993)研究发现小分子透明质酸可抑制肿瘤坏死因子的作用，因此具有减轻炎症的作用。毫无疑问，服用小分子透明质酸可增加其吸收利用率，提高其疗效。
一般的胶原蛋白水解物几乎都是来源于动物皮肤，主要是一型和三型胶原蛋白的水解物，并且不含有任何氨基多糖成份。因此，这些一型和三型胶原蛋白的水解物作用疗效较差。另外，目前市场上销售的氨基多糖产品，如硫酸软骨素和透明质酸，几乎都是天然大分子提取物，分子量特大而不能有效地吸收和利用。并且这些产品成份单一，功能范围有限，疗效差。
目前也有一些软骨胶原蛋白产品，尽管这些产品含有胶原蛋白、氨基多糖等多种生物活性成份，但是它们大多是没有经过任何深加工的产品，所含的生物活性物质多以大分子天然束缚状态形式存在，吸收利用率极低。例如，硫酸软骨素、透明质酸等其它氨基多糖多数存在于大分子胶原蛋白结合体构架内，因此不易被消化吸收利用。近年来也出现了一些水解软骨胶原产品，例如蛋白酶或者是碱水解的软骨胶原产品。通过蛋白酶或碱的作用，使软骨胶原蛋白分子结构发生了变化，既由大的软骨胶原蛋白分子变成了小分子的多肽，从而大大的提高了软骨胶原蛋白的吸收利用率。例如，中国专利(CN1385489)公布了一种从动物软骨中提取复合骨胶原的加工工艺，该工艺包括如下步骤：选料清洗→碱性水溶液水解→冷却加酸→过滤→浓缩→酒精沉淀→脱水→烘干包装。再例如，美国专利(US6780841)公布了一种含有透明质酸和硫酸软骨素的水解二型胶原蛋白及其制备方法，其制备工艺是：切割鸡胸软骨→水溶液浸泡→蛋白酶水解→消毒→过滤→浓缩→烘干包装。这些制备工艺的确能使大分子的软骨胶原蛋白或者软骨组织中的糖蛋白的蛋白成份水解变成了小分子的多肽或游离的氨基酸，从而大大地提高了软骨蛋白的吸收利用率。然而这些生产工艺都不能改变其产品中所含的氨基多糖的分子结构和大小。也就是说，这些产品中所含的氨基多糖，主要包括硫酸软骨素及透明质酸等，还是以其天然的大分子形式存在。通过这些工艺制备的软骨胶原产品所含的氨基多糖生物大分子分子量极大。例如，Luo等人(PoultSci.81：1086-9，2002)发现利用鸡胸软骨提取的硫酸软骨素平均分子量是48,500道尔顿。如此之大的硫酸软骨素分子是不能被机体有效地吸收和利用，因此疗效也就较差。
近年来大量的科学研究证明了小分子的硫酸软骨素、透明质酸等氨基多糖更易被人体吸收和利用，并且研究还证明小分子的硫酸软骨素较大分子的硫酸软骨素对关节炎的治疗效果更佳。因此，制备含低分子量的透明质酸和硫酸软骨素等其它氨基多糖的胶原蛋白复合物无疑将会大大提高人体对其所含氨基多糖成份的吸收利用率，从而对关节的营养保护和关节疾病的防治将会产生更好的效果。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物的生产制备方法，以及该复合物在医疗保健、食品加工、化妆美容等领域的应用，解决目前产品中氨基多糖生物大分子吸收和利用率低，疗效差的问题。
本发明低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)选用天然动物软骨为原料，用水进行清洗；
(2)加水粉碎成匀浆；
(3)调节匀浆的PH值在5～8，控制反应温度在20～70℃加蛋白酶水解软骨蛋白；
(4)加反应催化剂催化裂解软骨氨基多糖，反应催化剂为金属离子、过氧化氢、抗坏血酸中的一种或两种或两种以上的组合；
(5)灭菌消毒；
(6)过滤和/或采用分子量截留规格30000道尔顿的超滤膜进行超滤截留；
(7)浓缩干燥及包装。
以下对该制备方法进行详细说明：
本发明低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物是以天然动物软骨为主要原料加工制备而成。天然动物软骨是包括来源于鸡、鸭、牛、猪、羊、沙鱼或其它动物的软骨，最好是选用鸡胸软骨为原料。
选优质动物软骨为原料，用水清洗并去除表面杂质。按原料1-10倍的重量，最好3-5倍，向清洗后的动物软骨中加水并粉碎匀浆。用盐酸或氢氧化钠将其匀浆液pH值调节在5-8之间。将匀浆物料置入恒温反应罐内，添加一种或一种以上的蛋白水解酶(例如胰蛋白酶、木瓜酶、菠萝酶、无花果酶、细菌蛋白酶等)，控制反应温度在20-70℃，搅拌作用1-24小时，最好温度在30-60℃作用6-10小时，将软骨蛋白水解。作用温度和溶液pH值以及蛋白酶的使用量取决于具体使用的蛋白酶类，按照公知技术方式确定。
在蛋白酶水解过程的同时或水解过程终止后，向软骨水解液中加入反应催化剂，保持温度在20-70℃，搅拌作用1-24小时，最好温度在30-60℃催化反应4-10小时，使其软骨水解液中大分子的氨基多糖裂解成低分子量的氨基多糖。
反应催化剂是金属离子、过氧化氢和/或抗坏血酸；或者是其中的一种，也可是其中的两种或两种以上的组合。每种催化剂使用时的用量为：
金属离子包括Fe2+、Cu+等，浓度一般为0.001-1,000微摩尔/升，最好使用浓度1-100微摩尔/升。
过氧化氢浓度一般为0.001-1,000毫摩尔/升，最好使用浓度0.1-10毫摩尔/升。
抗坏血酸浓度一般为0.001-1,000毫摩尔/升，最好使用浓度0.1-10毫摩尔/升。
反应结束后，将其反应液升温到95-105℃灭菌消毒30分钟，然后将灭菌消毒的溶液冷却至室温。将其所得反应水解液进行过滤和/或超滤截留。例如先通过200目筛过滤，以去除骨粒等多种杂质，然后可再使用分子量截留规格30,000道尔顿的超滤膜进行分子量截留，从而得到分子量低于30,000道尔顿的胶原蛋白复合物。
将过滤和/或超滤截留后的软骨水解液进行浓缩再通过滚筒干燥机或喷雾干燥方法进行干燥，然后包装即得到含低分子量氨基多糖的天然软骨胶原蛋白复合物。
最终得到的含低分子量氨基多糖的天然软骨胶原蛋白复合物粉末是水溶性的；含水分在10％以内；含动物软骨胶原蛋白水解物(蛋白质质量含量)55％至70％，最好是60％至65％，平均分子量是50-15,000道尔顿，最好在2,000-6,000道尔顿之间；含有低分子量的氨基多糖20％至35％，最好是25％至30％，平均分子量是50-30,000道尔顿，最好在5,000-20,000道尔顿之间。
本发明低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物可以应用在医疗保健、食品加工、化妆美容等方面。特别是在治疗关节疾病，例如膝关节炎和颈椎病等方面效果更好。
本发明的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物可以以粉末、片剂、胶囊、膏状物等形式给关节疾病患者服用，可以治疗关节疾病，包括关节软骨损伤，退化性关节炎，类风湿性关节炎，和其它结缔组织功能紊乱等。具体服用方法是：口服本发明的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物，每天1至10克(最好每天4至5克)，5至10天(最好7天)为一个疗程。
本发明的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物也可作为食品和饮料的营养添加剂，制作生产对人体有保健和抗衰老作用的保健品。也可将本发明的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物作为主要或添加成份，进一步加工制作成化妆或美容保健品。
本发明的优点：
能够得到低分子量的氨基多糖胶原蛋白复合物，利于人体吸收和利用，从而对关节的营养保护和关节疾病的防治将会产生更好的效果。
附图说明
图1为抗坏血酸、过氧化氢和金属离子Fe2+对氨基多糖的降解作用。
具体实施方式
实施例1：以鸡胸软骨为原料制备低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物
选用健康鸡胸软骨1,000克，除去表面杂质，加水搅拌清洗数分钟，放掉浊水。将清洗过的鸡胸软骨切成谷粒大小，然后加水3升，用胶体磨将其磨细，成粘稠状悬浊液。将其悬浊液置入恒温反应罐内，加入胰蛋白酶(按原料重量的2-5％添加)，保持恒温(37±1℃)6-8小时，每半小时搅拌一次。反应结束后，将酶水解反应液速升温至沸点(100℃)10分钟，后冷却至37℃。
在上述酶水解反应液中加入FeSO4(浓度为50微摩尔/升)和过氧化氢(浓度为1500微摩尔/升)，37℃反应24小时。然后通过200目筛过滤，以去除骨粒等多种杂质(也可再使用分子量截留规格30,000道尔顿的超滤膜进行超滤截留)，从而得到含低分子量氨基多糖的天然软骨蛋白复合物。此天然软骨蛋白复合物中蛋白质的平均分子量约6,000道尔顿，氨基多糖的平均分子量约10,500道尔顿。
将上述过滤液打入浓缩罐内，加热蒸发水分，使其浓缩成稀膏状。将上述膏状物料置入滚筒干燥机储料箱内，使其干燥成片状。将片状物料用粉碎机粉碎，然后将其置入60-70℃烘箱内，抽风条件下继续干燥，使水分控制在10％以内，然后密封包装。每1,000克原料可制备约110克含低分子量氨基多糖的天然的软骨胶原蛋白复合物。其中氨基多糖含量约30％，蛋白质含量约65％。
实施例2：金属离子Fe2+、过氧化氢和抗坏血酸对氨基多糖的降解作用
取实施例1中的软骨胶原蛋白酶水解液数份，分别加入不同浓度的金属离子Fe2+、过氧化氢或/和抗坏血酸。将反应液置37℃反应24小时或50℃反应8小时。然后分别取样各0.3毫升，用5倍体积的甲醇/丙酮(2∶1)混合物沉淀。在12,000g离心将其氨基多糖沉淀物分离。将离心所得的沉淀物干燥，然后溶解于0.1毫升水，即得到氨基多糖水溶液。取7.5微升氨基多糖水溶液与7.5微升样品液(0.2摩尔蔗糖-0.089摩尔Tris-0.089摩尔硼酸-0.002摩尔EDTA-0.02％溴酚蓝)混合，然后通过25％聚丙希酰胺凝胶电泳(电泳缓冲液：0.089摩尔Tris-0.089摩尔硼酸-0.002摩尔EDTA)将其混合物分离分析。电泳完毕后，使用2％阿利新(Alcian)蓝水溶液将其电泳分离的氨基多糖固定，然后用银染色方法将氨基多糖染色，并观测其样品中氨基多糖的降解情况。金属离子Fe2+、过氧化氢和/或抗坏血酸对氨基多糖的降解作用如图1所示。
A.不同浓度的抗坏血酸，过氧化氢和金属离子Fe2+在50℃下8小时对氨基多糖的催化降解作用。从图可看出在软骨蛋白酶水解液中加入不同浓度的过氧化氢，在50℃下8小时对软骨蛋白水解液中的大分子量的氨基多糖催化降解作用不明显(可能是由于高温使过氧化氢分解的原因)，但是在软骨蛋白酶水解液中加入抗坏血酸或FeSO4，在50℃下8小时对软骨蛋白水解液中的大分子量的氨基多糖有明显的催化降解作用，并且其催化降解作用随催化剂浓度的增加而增强。
B.表示金属离子Fe2+和过氧化氢或抗坏血酸在37℃下24小时对氨基多糖的催化降解作用。从图可看出在软骨蛋白酶水解液中加入1500μM过氧化氢，1500μM过氧化氢和50μM FeSO4，500μM抗坏血酸，或500μM抗坏血酸和50μM FeSO4，在37℃下24小时对软骨蛋白水解液中的大分子量的氨基多糖有明显的催化降解作用。尤其是1500μM过氧化氢和50μM FeSO4组合对软骨蛋白水解液中的大分子量的氨基多糖催化降解作用最佳。
实施例3：低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物中蛋白质含量的测定
低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物中蛋白质含量的测定是根据蛋白质测定的国际规定方法-凯氏定氮法。从分批生产的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物中精密称取样品0.2-2.0克，使用凯氏定氮法测定其样品中蛋白质的含量。经此方法测定计算，各批软骨蛋白复合物的蛋白质的含量均在63％左右。
实施例4：低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物中氨基多糖含量的测定
低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物中氨基多糖含量的测定是根据Gold博士在美国分析生物化学杂志上发表的方法[(Gold，E.W.Analytical Biochemistry 99，183-188(1979)]。此方法操作简便快速且重现性好，是国际上广泛应用的氨基多糖(Glycosaminoglycan，GAG)测定方法之一。
标准液的配制：称取10毫克商品硫酸软骨素，将其溶入蒸馏水，并定容至10毫升，即得到浓度为1毫克/毫升的标准品母液。将标准品母液稀释配制不同浓度的标准液。
阿利新(Alcian)蓝溶液(1.4毫克/毫升)的配制：称取70毫克Alcian蓝8XG，将其溶入50毫升0.05摩尔醋酸钠溶液。
低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物待测样品的配制：从分批生产的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物中精密称取样品15毫克，将其溶入蒸馏水，并定容至10毫升，即得待测样品溶液浓度为1.50毫克/毫升。
标准曲线的制备和待测样品的测定：各取0.1毫升不同浓度的标准液和待测样品于试管内。向各试管中分别加入1.2毫升Alcian蓝溶液，混合均匀，常温下反应10分钟。然后测定该反应液在480纳米的光吸收强度。根据不同浓度的标准液的光吸收强度绘制标准曲线。低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物待测样品的氨基多糖浓度可根据其在480纳米的光吸收强度从标准曲线查出。经计算所得，各批低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物中氨基多糖的含量均在27％左右。
实施例5：低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物的应用
本发明的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物在医疗保健、食品加工、化妆美容等方面有广泛的应用，特别是对治疗关节疾病，包括关节软骨损伤，退化性骨关节炎，类风湿性关节炎，和其它结缔组织功能紊乱等。
使用食用明胶胶囊壳将本发明的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物制做成食用胶囊，每个胶囊含本发明的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物净重200-1,000毫克，最好500毫克。用此500毫克胶囊治疗关节疾病，每天口服有效剂量2-20粒，最好每天8-10粒，5至10天为一个疗程，最好7天为一个疗程，对关节疾病有明显的治疗效果。
本发明的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物也可与水和/或果汁混合饮用，例如将2-3克本发明的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物溶入250毫升水或果汁中饮用，每天2-3次，可防止和治疗关节疾病和其它结缔组织功能紊乱。
实施例6：以猪或牛软骨为原料制备低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物
选用猪或牛软骨1,000克，除去表面杂质，加水搅拌清洗数分钟，放掉浊水。将清洗过的猪或牛软骨切成谷粒大小，然后加水3升，用胶体磨将其磨细，成粘稠状悬浊液。将其悬浊液置入恒温反应罐内，加入木瓜酶(活性80万u/g，按原料量的5～8‰加入)，保持恒温50℃，酶解2小时后加入FeSO4(浓度为50μm/l)和抗坏血酸(浓度为0.5毫摩尔/升)，反应10～12小时。反应结束后，将酶水解反应液速升温至沸点(100℃)10分钟，后冷却至常温。然后通过200目筛过滤，以去除骨粒等多种杂质(也可再使用分子量截留规格30,000道尔顿的超滤膜进行超滤截留)，从而得到含低分子量氨基多糖的天然软骨蛋白复合物。此天然软骨蛋白复合物中蛋白质的平均分子量在约3,000道尔顿，氨基多糖的平均分子量15,000道尔顿。
将上述过滤液打入浓缩罐内，加热蒸发水分，使其浓缩成稀膏状。将上述膏状物料置入滚筒干燥机储料箱内，使其干燥成片状。将片状物料用粉碎机粉碎，然后将其置入60-70℃烘箱内，抽风条件下继续干燥，使水分控制在10％以内，然后密封包装。每1,000克原料可制备约120克含低分子量氨基多糖的天然的软骨胶原蛋白复合物，其中氨基多糖含量27％，蛋白质含量65％。
实施例7：以沙鱼软骨为原料制备低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物
选用沙鱼软骨1,000克，除去表面杂质，加水搅拌清洗数分钟，放掉浊水。将清洗过的沙鱼软骨切成谷粒大小，然后加水8升，用胶体磨将其磨细，成粘稠状悬浊液。将其悬浊液置入恒温反应罐内，加入菠萝酶(活性80万u/g，按原料量的2～4‰加入)，保持恒温50℃，6～8小时，每半小时搅拌一次。反应结束后，将酶水解反应液速升温至沸点(100℃)10分钟，后冷却至50℃。
在上述酶水解反应液中加入FeSO4(浓度为500微摩尔/升)，50℃反应8小时。然后通过200目筛过滤，以去除骨粒等多种杂质(也可再使用分子量截留规格30,000道尔顿的超滤膜进行超滤截留)，从而得到含低分子量氨基多糖的天然软骨蛋白复合物。此天然软骨蛋白复合物中蛋白质的平均分子量为8,000道尔顿，氨基多糖的平均分子量为22,000道尔顿。
将上述过滤液打入浓缩罐内，加热蒸发水分，使其浓缩成稀膏状。将上述膏状物料置入滚筒干燥机储料箱内，使其干燥成片状。将片状物料用粉碎机粉碎，然后将其置入60-70℃烘箱内，抽风条件下继续干燥，使水分控制在10％以内，然后密封包装。每1,000克原料可制备约100克含低分子量氨基多糖的天然的软骨胶原蛋白复合物，其中氨基多糖含量27％，蛋白质含量62％。
实施例8：以鸡胸软骨为原料制备低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物
选用健康鸡胸软骨1,000克，除去表面杂质，加水搅拌清洗数分钟，放掉浊水。将清洗过的鸡胸软骨切成谷粒大小，然后加水10升，用胶体磨将其磨细，成粘稠状悬浊液。将其悬浊液置入恒温反应罐内，加入胰蛋白酶(按原料重量的2-5％添加)，保持恒温(37±1℃)6-8小时，每半小时搅拌一次。反应结束后，将酶水解反应液速升温至沸点(100℃)10分钟，后冷却至37℃。
在上述酶水解反应液中加入FeSO4(浓度为10微摩尔/升)和过氧化氢(浓度为10毫摩尔/升)，37℃反应24小时。然后通过200目筛过滤，以去除骨粒等多种杂质(也可再使用分子量截留规格30,000道尔顿的超滤膜进行超滤截留)，从而得到含低分子量氨基多糖的天然软骨蛋白复合物。此天然软骨蛋白复合物中蛋白质的平均分子量为6,000道尔顿，氨基多糖的平均分子量为18,000道尔顿。
将上述过滤液打入浓缩罐内，加热蒸发水分，使其浓缩成稀膏状。将上述膏状物料置入滚筒干燥机储料箱内，使其干燥成片状。将片状物料用粉碎机粉碎，然后将其置入60-70℃烘箱内，抽风条件下继续干燥，使水分控制在10％以内，然后密封包装。每1,000克原料可制备约110克含低分子量氨基多糖的天然的软骨胶原蛋白复合物。其中氨基多糖含量30％，蛋白质含量65％。
实施例9：以鸡胸软骨为原料制备低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物
选用健康鸡胸软骨1,000克，除去表面杂质，加水搅拌清洗数分钟，放掉浊水。将清洗过的鸡胸软骨切成谷粒大小，然后加水5升，用胶体磨将其磨细，成粘稠状悬浊液。将其悬浊液置入恒温反应罐内，加入菠萝酶(活性80万u/g，按原料量的2～4‰加入)，保持恒温50℃，6～8小时。反应结束后，将酶水解反应液速升温至沸点(100℃)10分钟，后冷却至50℃。
在上述酶水解反应液中加入FeSO4(浓度为0.5微摩尔/升)和抗坏血酸(浓度为10毫摩尔/升)，50℃反应10小时。然后通过200目筛过滤，以去除骨粒等多种杂质(也可再使用分子量截留规格30,000道尔顿的超滤膜进行超滤截留)，从而得到含低分子量氨基多糖的天然软骨蛋白复合物。此天然软骨蛋白复合物中蛋白质的平均分子量为5,000道尔顿，氨基多糖的平均分子量为20,000道尔顿。
将上述过滤液打入浓缩罐内，加热蒸发水分，使其浓缩成稀膏状。将上述膏状物料置入滚筒干燥机储料箱内，使其干燥成片状。将片状物料用粉碎机粉碎，然后将其置入60-70℃烘箱内，抽风条件下继续干燥，使水分控制在10％以内，然后密封包装。每1,000克原料可制备约110克含低分子量氨基多糖的天然的软骨胶原蛋白复合物。其中氨基多糖含量30％，蛋白质含量65％。
实施例10：以羊软骨为原料制备低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物
选用健康羊软骨1,000克，除去表面杂质，加水搅拌清洗数分钟，放掉浊水。将清洗过的羊软骨切成谷粒大小，然后加水5升，用胶体磨将其磨细，成粘稠状悬浊液。将其悬浊液置入恒温反应罐内，加入菠萝酶(活性80万u/g，按原料量的2～4‰加入)，保持恒温50℃，6～8小时。反应结束后，将酶水解反应液速升温至沸点(100℃)10分钟，后冷却至50℃。
在上述酶水解反应液中加入抗坏血酸(浓度为50毫摩尔/升)，50℃反应10小时。然后通过200目筛过滤，以去除骨粒等多种杂质(也可再使用分子量截留规格30,000道尔顿的超滤膜进行超滤截留)，从而得到含低分子量氨基多糖的天然软骨蛋白复合物。此天然软骨蛋白复合物中蛋白质的平均分子量为6,000道尔顿，氨基多糖的平均分子量为16,000道尔顿。
将上述过滤液打入浓缩罐内，加热蒸发水分，使其浓缩成稀膏状。将上述膏状物料置入滚筒干燥机储料箱内，使其干燥成片状。将片状物料用粉碎机粉碎，然后将其置入60-70℃烘箱内，抽风条件下继续干燥，使水分控制在10％以内，然后密封包装。每1,000克原料可制备约110克含低分子量氨基多糖的天然的软骨胶原蛋白复合物。其中氨基多糖含量30％，蛋白质含量65％。

Claims (8)

1.一种低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)选用天然动物软骨为原料，用水进行清洗；
(2)加水粉碎成匀浆；
(3)调节匀浆的PH值在5～8，控制反应温度在20～70℃加蛋白酶水解软骨蛋白；
(4)加反应催化剂催化裂解软骨氨基多糖，反应催化剂为金属离子、过氧化氢、抗坏血酸中的一种或两种或两种以上的组合，反应温度为20～70℃，反应时间1～24小时，所述反应催化剂的金属离子选用Fe2+或Cu+，浓度为50～1000微摩尔/升，过氧化氢浓度为0.1～10毫摩尔/升，抗坏血酸浓度为0.1～50毫摩尔/升；
(5)灭菌消毒；
(6)过滤和/或采用分子量截留规格30,000道尔顿的超滤膜进行超滤截留；
(7)浓缩干燥及包装。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述天然动物软骨，选用鸡、牛、猪、鸭、羊或沙鱼的软骨。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)所述天然动物软骨，选用鸡胸软骨。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)反应催化剂催化裂解软骨氨基多糖与步骤(3)蛋白酶水解软骨蛋白同时进行，或者在蛋白酶水解软骨蛋白水解终止后进行。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤(4)的反应温度为30～60℃，反应时间4～10小时。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)所述蛋白酶采用胰蛋白酶、木瓜酶、菠萝酶、无花果酶、细菌蛋白酶中的一种或一种以上的组合。
7.一种权利要求1所述低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物的制备方法得到的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物，复合物中，以蛋白质质量含量计，含动物软骨胶原蛋白水解物55％～70％，含有低分子量的氨基多糖20％～35％，胶原蛋白水解物蛋白质的平均分子量是50-15,000道尔顿，氨基多糖的平均分子量是50-30,000道尔顿。
8.根据权利要求7所述的低分子量氨基多糖胶原蛋白复合物，其特征在于所述胶原蛋白水解物蛋白质的平均分子量是2,000-6,000道尔顿，氨基多糖的平均分子量是5,000-20,000道尔顿。
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