CN104448038B - 一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及硫酸软骨素制备，特别涉及一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺，包括如下步骤预处理、酶解、超滤、醇沉、醇洗及干燥，本发明的制备工艺中无需树脂转型，无需添加双氧水防腐或脱色，过程简单、快捷，投资成本低，可以从动物软骨中提取品质优良的硫酸软骨素钙盐产品，同时保证高的提取率，本发明的制备工艺要比转型法提取率高出20‑30%。

Description

一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺

技术领域

本发明涉及硫酸软骨素制备，特别涉及一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺。

背景技术

硫酸软骨素(Chondroitin Sulfate，CS)是存在于人和动物结缔组织中的酸性黏多糖，属于硫酸化糖胺聚糖的一种，由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖二糖重复单位组成的一组不均一的线性多糖，相对分子质量一般为10000～50000，主要分布于动物喉骨、鼻中隔、气管等软骨及肌腱、肌膜和血管壁中。

CS具有明显的亲软骨性，可优先进入软骨组织，保护软骨。2003年在欧洲风湿病防治联合会发表的对于膝骨关节炎(osteoarthritis，OA)的治疗建议中认为CS是一种治疗膝OA的有效药物。研究发现，CS抑制水肿的产生，促进基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和白介素-1β(IL-1β)的合成，并能抑制蛋白水解酶和溶酶体酶，如弹性酶，N乙酰氨基葡糖苷酶等损坏关节软骨的酶的生成，从而避免了软骨损害的进一步发展。口服CS用于治疗关节疾病，可缓解症状，减少对非甾体抗炎药的需求，虽然起效较慢，但是长期服用副作用少，无肠胃刺激性。

缓解关节炎疼痛：关节腔内的关节滑液能提供垫衬作用，缓和行动时的冲击和摩擦，软骨素能将水分吸入蛋白多糖分子内，使软骨变厚，并增加关节内的滑液量。CS具有缓解OA患者关节疼痛的作用在多项实验中已经得到证实。骨关节炎患者口服硫酸软骨素1～3年后，放射学图像显示硫酸软骨素治疗组的关节问隙宽度的恶化明显小于安慰剂组，相比而言抗炎类药物仅可以缓解关节炎的疼痛，而CS还可以控制症状的进一步发展，有利于软骨的修复。硫酸软骨素作为缓解症状的骨关节炎慢作用药物的优点表现在：减轻疼痛、改善功能和降低非甾体抗炎药或止痛药的消费。

作为膳食补充剂：用于保护关节CS能够结合水分子用于润滑和支撑关节，使关节活动自如。在国外上市的CS或以CS为主要原料的制剂很多，如Chondroitin Sulfate、Osteo JointCare、More Free等，作为膳食补充剂用于预防关节炎，保护关节。

软骨组织工程是将体外分离培养的正常组织细胞接种到具有一定空间结构和良好的生物相容性的三维支架上，然后将细胞一支架复合物在体外继续培养或植入体内，同时辅以特殊的生长因子，支架材料逐渐降解，为细胞分泌的基质所代替，形成组织或器官的结构，并行使功能。CS用于体内移植或注射时无炎症和变态反应，在动物体内可被降解为氨基葡萄糖，参与代谢，表现出良好的生物相容性和生物可降解性，因而在组织工程中显示出较为广泛的应用前景。利用异相成核模型研究硫酸软骨素对羟磷灰石结晶化的效应，发现CS能促进羟磷灰石(Hap)微晶装配的形成。用氢氧化钙乳浊液和含CS的磷酸溶液经沉淀法制备磷灰石和CS混合物，检晶仪检查发现，Hap和CS晶体官能团交联良好，此混合物可用于人工骨或软骨的构建。

在椎间盘突出研究中发现椎问盘退行性改变时除了基本的病理变化还伴随着CS浓度的降低，发生腰椎间盘退行性改变较严重的患者可口服CS进行治疗。其机理在于CS能增强II型胶原mRNA表达和软骨再生，促进成骨细胞的增生，促进新骨形成，加速骨愈合的过程。

由于硫酸软骨素具有多种生物活性而被广泛应用，作为保健品和药品用于防治关节痛、关节炎、动脉硬化、冠心病和心绞痛等疾病。中国每年约有3500吨硫酸软骨素以原料药形式出口至美国，是美国关节保健品市场的重要组成部分。

由于现有硫酸软骨素钙盐生产工艺难度较大，市场上主要以硫酸软骨素钠盐为主，钙盐占比很少。此外，硫酸软骨素对钙的亲和能力比钠强，故传统硫酸软骨素钠盐在使用中存在对血管和毛细血管产生钙沉积而导致瘀点和血肿的风险。硫酸软骨素钙盐除有助于关节恢复外，还对骨质疏松有补钙修复的功能。硫酸软骨素钙盐在市场售价上面较硫酸软骨素钠盐更高。

传统的硫酸软骨素钙盐制备方法为以硫酸软骨素钠盐为底物，溶解后料液通过D204阴树脂吸附，直至流出液检出硫酸软骨素。再以氯化钙溶液对树脂进行洗脱，同时保持流出液pH6.5，再醇沉精制流出液得到硫酸软骨素钙盐。该方法有两大弊端，一是硫酸软骨素钠盐回溶后有约20％的损失致成本大大增加，二是整个工艺过程时间较长，存在物料腐败的风险。

中国专利CN 102816809A“一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺”，公开了硫酸软骨素钙盐的制备工艺包括加水蒸煮、碱解提取、酶解、吸附和洗涤、洗脱、脱色、沉淀和干燥等步骤，可从动物软骨中直接提取制备出硫酸软骨素钙，但是工艺过程中添加含钠的物质，需树脂转型，树脂转型法在洗脱过程中导致硫酸软骨素流失；再者，工艺过程中需要使用双氧水脱色，双氧水作为消毒剂，已经从《GB 2760-2011食品添加剂使用标准》中剔除，生产中不可随意添加，存在食品安全风险；最后，工艺整体过程耗时时间长，得率低。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种从动物软骨中高效提取品质优良的硫酸软骨素钙盐的制备工艺。

本发明的技术方案是：

一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺，包括如下步骤预处理、酶解、超滤、醇沉、醇洗及干燥；

步骤1：预处理，将原料软骨清洗，使用纯水以便洗脱原料表面血渍等，同时降低成品中钠离子含量过高的风险；后再复水浸泡，再加工成均匀的骨浆；

步骤2：酶解，骨浆在搅拌下升温至50-60℃，调节pH8.0-10.0，再加入物料量3.0-5.0‰的蛋白酶，酶解4-5小时；

步骤3：超滤，调节pH5.0-7.0，并升温至80℃；向酶解液中加入硅藻土，搅拌均匀后出料过滤，过滤得到澄清的酶解滤液；酶解滤液经6000D超滤浓缩去除小分子蛋白；

步骤4：醇沉，加入食品级氯化钙颗粒，搅拌溶解后加入95％食用酒精，调节酒精度至70％，搅拌30min后分层；

步骤5：醇洗，弃上清，下部沉淀醇沉；分层后，弃上清，下部沉淀物经离心分离后得到硫酸软骨素半成品；

步骤6：干燥，得到干品，干品经粉碎后得到硫酸软骨素钙盐成品。

以上方案的基础上，步骤1中所述预处理的具体方法为使用5-6倍体积的纯水清洗原料软骨至表面无污物，并排放清洗水；再按照原料干软骨1:8～10的比例加入60-70℃纯水，浸泡复水3-4小时；复水后软骨依次进入粉碎机和胶体磨，得到均匀的骨浆。

以上方案的基础上，步骤2中食品级氢氧化钙调节pH值，再加入蛋白酶。

该步骤中使用氢氧化钙替代传统的氢氧化钠来调节物料的pH，物料中无钠离子进入，只引入钙离子。此阶段硫酸软骨素是以蛋白多糖的形式存在。经过酶解后，大分子蛋白被酶解成为小肽或者多肽，硫酸软骨素可与钙结合形成硫酸软骨素钙盐。由于整个工艺过程没有钠离子引入，且在预处理时对原料进行纯水清洗，故成品无需树脂转型，即可得到低钠高钙的产品。

以上方案的基础上，步骤3采用食品级盐酸调节pH值。

以上方案的基础上，步骤3中所述硅藻土的添加量为物料量的3.5-5.0‰。加入硅藻土作为助滤剂，在物料中均匀分布后无需等待分层沉淀即可过滤，大大缩短加工时间。

以上方案的基础上，步骤3中所述过滤采用经0.2μm级过滤机过滤。

以上方案的基础上，步骤4中先将步骤3中超滤浓缩液降温至20-30℃，再加入物料量1.5-2.5％的食品级氯化钙颗粒

以上方案的基础上，步骤5中所述醇洗的具体方法为抽取上清液，下部沉淀经离心分离后再次加入95％食用酒精，调节酒精度至85％，搅拌30min后分层；再次抽取上清液，下部沉淀物经离心分离后得到硫酸软骨素半成品。

以上方案的基础上，步骤6中所述干燥的具体方法为硫酸软骨素半成品在105℃下烘干8小时。

本发明的有益效果是：

1、本发明的制备工艺中无需树脂转型，硫酸软骨素中钠含量极低，主要以钙盐形式存在，大大缩短了工艺时间，而且，本发明的制备工艺要比转型法提取率高出20-30％。

2、加入硅藻土作为助滤剂，无需等待分层沉淀即可过滤，使整体工时大大缩短，无腐败风险，故工艺过程中无需添加双氧水防腐或脱色。

3、本发明的方法可以得到高品质的稳定的高钙、低钠含量硫酸软骨素钙盐，同时，还能避免污水排放，有效对蛋白进行回收。

4、本发明在传统的硫酸软骨素生产工艺中，无需新增设备投资即可实现，并且可以持续带来高额回报。市场上硫酸软骨素钙盐的价格较同类型硫酸软骨素钠盐(CPC含量相同的产品)高约20％，而传统工艺产出的软骨素钙盐有约20％的损失，且工艺耗时长，以软骨素钠盐转型的方式带来的经济效益明显低于本方法。

5、以下是本方法与中国专利CN 102816809A传统方法获得硫酸软骨素钙盐产品指标和收率的对比：

主要指标对比表：

附图说明

附图1为本发明制备工艺的流程图。

具体实施方式

本发明的具体实施方式如下：

实施例1：

硫酸软骨素钙盐生产过程如下：

1)向反应釜中投料1.5吨猪鼻骨，再注入5-6倍体积的纯水搅拌清洗原料软骨至表面无污物，并排放清洗水；使用纯水防止其他离子污染，同时洗去软骨表面的血渍污物。

2)再按照原料干软骨1:8～10的比例加入60-70℃纯水，浸泡复水3-4小时。复水后软骨依次进入粉碎机和胶体磨，得到均匀的骨浆；软骨热水复水后变脆且饱满，易于粉碎加工，粉碎后原料比表面积增大，增大了物料与酶的接触机会，有助于加速酶解。

3)骨浆输送至酶解反应釜，加水至液位13-15m³。骨浆在搅拌下升温至50-60℃，加入食品级氢氧化钙调节pH8.0-10.0，加入物料总量3.0-5.0‰的蛋白酶，酶解4-5小时；

4)酶解结束后，加入食品级盐酸调节pH5.0-7.0，并升温至80℃。向酶解液中加入硅藻土，添加量为物料量的3.5-5.0‰，搅拌均匀后出料过滤，经0.2μm级过滤机过滤得到澄清的酶解滤液；经过反复试验，确定助滤剂硅藻土的添加比例，能快速的达到澄清过滤效果，且无需传统方法静置分层。

5)酶解滤液经截留分子量6000D的超滤浓缩去除小分子蛋白，剩余40-50％体积的料液；使用截留分子量6000D的超滤膜能有效滤除小分子蛋白，截留大分子硫酸软骨素，同时兼顾过滤时间。

6)浓缩液降温至20-30℃，加入物料量1.5-2.5％的食品级氯化钙颗粒，搅拌溶解后加入95％食用酒精，调节酒精度至70％，搅拌30min后分层；由于酒精度随温度升高而降低，故物料降温后，酒精度可更快达到70％，减少酒精的用量。

7)抽取上清液，下部沉淀经离心分离后再次加入95％食用酒精，调节酒精度至85％，搅拌30min后分层；

8)抽取上清液，下部沉淀物经离心分离后得到硫酸软骨素半成品；

9)硫酸软骨素半成品在105℃下烘干8小时得到干品，干品经粉碎后得到硫酸软骨素钙盐成品。

硫酸软骨素钙盐的收率及检测数据：

以青岛一硫酸软骨素生产工厂为例：以本方法日产出硫酸软骨素钙盐2T，而传统方法用相同原料仅能产出相同理化指标的硫酸软骨素钙盐产品1.5T。以硫酸软骨素钙盐(HPLC，CPC≥96％)目前市场单价600元/kg计，本方法较传统生产工艺每日可增加利润240,000元。

附检测数据的计算：

a、钙、钠含量的计算： $X_i=\frac{(c_i-c_{i0})\×V}{m\×1000}$

Xi----试样中待测元素的含量，单位为毫克每千克(mg/kg)；

Ci----从标准曲线上查得式样溶液中各被测元素的浓度，单位为微克每升(μg/L)；

Ci0---从标准曲线上查得空白溶液中被测元素的浓度，单位为微克每升(μg/L)；

V----测试溶液的体积，单位为毫升(ml)；

m----试样的质量，单位为克(g)。

b、CPC含量的计算：20×(M/W)×100

M----测试溶液中硫酸软骨素的量；

W----配制测试溶液所用的硫酸软骨素质量。

c、水分的计算： $X_1=\frac{m1-m2}{m1-m3}\×100$

X1----试样中水分的含量，单位为克每百克(g/100g)；

m1---称量瓶(加海砂、玻棒)和试样的质量，单位为克(g)；

m2---称量瓶(加海砂、玻棒)和试样干燥后的质量，单位为克(g)；

m3---称量瓶(加海砂、玻棒)的质量，单位为克(g)；

水分含量≥1g/100g时，计算结果保留三位有效数字；水分含量＜1g/100g时，结果保留两位有效数字。

Claims (6)

1.一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤预处理、酶解、超滤、醇沉、醇洗及干燥；

步骤1：预处理，使用5-6倍体积的纯水清洗原料软骨至表面无污物，并排放清洗水；再按照原料干软骨1:8～10的比例加入60-70℃纯水，浸泡复水3-4小时；复水后软骨依次进入粉碎机和胶体磨，得到均匀的骨浆；

步骤2：酶解，骨浆在搅拌下升温至50-60℃，调节pH8.0-10.0，再加入物料量3.0-5.0‰的蛋白酶，酶解4-5小时；采用食品级氢氧化钙调节pH值；

步骤3：超滤，调节pH5.0-7.0，并升温至80℃；向酶解液中加入硅藻土，搅拌均匀后出料过滤，过滤得到澄清的酶解滤液；酶解滤液经6000D超滤浓缩去除小分子蛋白；

步骤4：醇沉，先将步骤3中超滤浓缩液降温至20-30℃，再加入物料量1.5-2.5％的食品级氯化钙颗粒，搅拌溶解后加入95％食用酒精，调节酒精度至70％，搅拌30min后分层；

步骤5：醇洗，弃上清，下部沉淀醇沉；分层后，弃上清，下部沉淀物经离心分离后得到硫酸软骨素半成品；

步骤6：干燥，得到干品，干品经粉碎后得到硫酸软骨素钙盐成品。

2.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，步骤3采用食品级盐酸调节pH值。

3.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，步骤3中所述硅藻土的添加量为物料量的3.5-5.0‰。

4.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，步骤3中所述过滤采用经0.2μm级过滤机过滤。

5.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，步骤5中所述醇洗的具体方法为抽取上清液，下部沉淀经离心分离后再次加入95％食用酒精，调节酒精度至85％，搅拌30min后分层；再次抽取上清液，下部沉淀物经离心分离后得到硫酸软骨素半成品。

6.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，步骤6中所述干燥的具体方法为硫酸软骨素半成品在105℃下烘干8小时。