CN102816809B

CN102816809B - 一种硫酸软骨素钙的制备工艺

Info

Publication number: CN102816809B
Application number: CN201210253255.XA
Authority: CN
Inventors: 王世强; 马立明; 高鸿; 陈庆满; 徐康森
Original assignee: Individual
Current assignee: Weifang Shi Yu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2014-09-17
Anticipated expiration: 2032-07-20
Also published as: CN102816809A

Abstract

本发明涉及一种硫酸软骨素钙的制备工艺。本发明的制备工艺，包括加水蒸煮、碱解提取、酶解、吸附和洗涤、洗脱、脱色、沉淀和干燥等步骤，可从动物软骨中直接提取制备出硫酸软骨素钙，步骤简单，提取率高，制备得到硫酸软骨素钙的纯度高。

Description

一种硫酸软骨素钙的制备工艺

技术领域

本发明涉及一种硫酸软骨素钙的制备工艺。

发明内容

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种以关节软骨变性、破坏及骨质增生为特征的慢性关节病。在全球范围内是最常见的一种关节病变,其发病率随年龄增长而增加。根据流行病学调查，65岁以上的人群中的OA发病率男性为60%，女性为70%。随着世界老龄化人口的增加，OA的发病率也呈现逐年上升趋势。

临床症状以关节肿痛、骨质增生及活动受限最为常见。OA的发病无地域及种族差异，可分为原发性和继发性。继发性OA有明确的致病原因,如创伤、炎性关节病、先天性或发育性骨关节病、代谢性或内分泌性疾病等；原发性OA病因及发病机制尚不十分明确，可能与年龄增长、过度使用、损伤、肥胖、遗传等多种因素密切相关。OA不仅能够引起关节软骨的损害，累及整个关节，包括韧带、关节囊、滑膜等，还影响身体的其他部位，如肌肉、内脏等。随着人口老龄化的加快，OA的危害越来越大,已成为倍受公众关注的健康问题。

治疗OA的药物可分为几类镇痛药、非甾体抗炎药（NSAID，包括COX-2抑制剂）、皮质激素、慢作用药物等。

对于骨性关节炎的药物治疗应该是系统和策略的，从小剂量的对乙酰氨基酚到大剂量运用非甾体类抗炎药（NSAID）类药物，药物的选择应根据病人的症状、病史以及身体状况综合考虑。对于临床炎症表现轻，仅以疼痛为主的患者，先考虑定时或必要时口服镇痛剂，国外首选对乙酰氨基酚，止痛效果明显，但长期大量应用后有对肝、肾损害的报道；对于关节的炎症较重患者，NSAID仍是传统的首选用药，常用药物有双氯芬酸、布洛芬、萘普生以及昔布类药物，但不良反应较多，尤其是胃肠道的反应限制了其长期应用。

近年来由于选择性COX-2抑制剂的应用，保留了COX-1酶对于胃黏膜层的保护作用，通过促进某些蛋白多糖的生物合成，抑制胃酸分泌，调节肾血流动力和水电质的平衡，从而最大限度地避免出现胃肠道副反应；对于滑膜炎症重，关节有急性炎症表现的患者还可考虑局部应用皮质类激素。

关节腔内注射药物可包括：透明质酸钠（HA）、超氧化物歧化酶（SOD）以及软骨保护剂如氨基葡聚糖（GAG）等，针对骨性关节炎的发病机制，还可选用基质降解酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂以及抑制白介素-1（IL-1）产生和活性的药物，如双醋瑞因为大黄提取物，活性成分为二乙酰大黄酸，通过抑制IL-1和氧自由基的产生和释放，抑制金属蛋白酶的活性及稳定溶酶体膜而达到抗炎及保护关节软骨的作用，同时多种细胞因子在软骨损伤修复过程中起到重要作用，如转化生长因子（TGF-β）具有促进软骨细胞增殖和分化、抑制多种炎性介质（IL-1、IL-6、TNFα、MMP5、NO等）活性及免疫反应等多重生物学功能，局部应用能够延缓或阻断关节软骨基质的降解，促进缺损处关节软骨的修复，选用基因治疗的手段或组织工程学的方法可有效利用外源性生长因子。

硫酸软骨素（CS）是目前治疗OA的慢作用药物中改善症状药物的代表药物，除此之外，本类药物还包括氨基葡萄糖、葡糖胺聚糖和透明质酸等；这类药物通常可以延缓疾病进程。

CS可用于治疗高血脂症，其作用机理为硫酸软骨素可防止由脂蛋白酶活性引起的脂质沉着及血栓的形成。CS还可通过降低血清胆固醇来治疗心绞痛等疾病。

CS可抑制凝血酶和内源性凝血系统中Ⅷa/Ⅸa复合物活性，起到抗凝作用。CS的3-β-D葡萄糖醛酸残基被硫酸化的α-L-吡喃岩藻糖取代后为岩藻糖硫酸软骨素（FucoSylatedCS，FuCS），其对凝血酶有抑制作用的结构为还原末端和抗酸性的L-岩藻糖亚基。硫酸化的α-L-岩藻糖支链是其主要抗凝部位。在相同硫酸化时，FuCS比α-L-岩藻糖具有较强的抑制旁路凝血系统的作用，脱去岩藻糖或硫酸基后此活性丧失。

CS能增强猪软骨细胞培养液中Ⅱ型胶原mRNA表达和软骨再生。用羟基磷灰石硫酸软骨素生物材料注缺损拔牙患者，证实软骨内新骨生成。椎间盘变形患者，口服CS两年后，阻止了椎间盘的变形。说明cs能促进成骨细胞的增生，促进新骨形成，加速骨愈合的过程。

在蛙皮缩胆囊肽诱导鼠急性胰脏炎模型中，发现CS可改善胰脏细胞情况，减少水肿，恢复内生的抗氧化剂，减少谷胱甘肽、过氧化氢酶和过氧化物歧化酶的消耗，抑制脂质过氧化反应，减少嗜中性粒细胞的活化。在鼠注射CCl4诱发肝细胞中毒模型中，CS可提高抗氧化酶的活性，减少丙二醛浓度，抑制丙二醛蓄积，预防过氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶的钝化，肝炎和肝硬化明显减少。CS以一定剂量的方式保护了氧化应激，同时可能有清除自由基的作用。

在急性坏死性胰腺炎（acute necrotizing pancreatitis，ANP）发生的早期阶段，细胞间隙扩大，使腺泡腔内富含蛋白及消化酶的液体通过细胞间隙进入间质，这一现象被定义为胰腺水肿。细胞间隙扩大的机制是细胞连接结构的破坏口。在胰腺上皮中广泛存在的E-cadherin是一种以嗜同型方式介导同型细胞-细胞间黏附的细胞黏附分子，可以促进上皮细胞间的相互黏附，维持组织结构的完整。其表达和分布对连接复合体的形成至关重要，因其影响细胞间的连接。有研究发现，氧自由基损伤引起细胞能量耗竭导致细胞间连接蛋白降解，细胞连接破坏。外源性硫酸软骨素（chondroitin-sulfate，CS）系氨基葡聚糖家族（GAGs）主要成员之一，可通过抗氧化作用维持细胞内ATP含量，从而减轻ANP大鼠胰腺细胞损伤及胰腺水肿。试验证明，胰管注射CS对减轻ANP大鼠胰腺细胞损伤的作用，进一步揭示CS对ANP大鼠胰腺细胞间连接及连接蛋白E-cadherin表达和分布的影响，为ANP这一复杂致死性疾病提供新的治疗思路和方法。

以鲨鱼软骨为原料，用改进的提取工艺，制得纯度较高的鲨鱼软骨多糖（SCAMP)，荧光探针法证实SCAMP与DNA分子能相互作用，并呈量效关系，这可能是防癌、抗癌作用的关键所在。

在兔足趾腱鞘外科手术修复过程中，用CS-多羟基异丁烯酸酯膜处理，发现粘连减少，愈合较好。在SD大鼠盲肠绒毛膜的磨损术中，用CS腹腔注射用药后，发现腹部粘连范围纤维蛋白和胶原I沉积物明显减少。

CS有明显的抗血管生成活性，能增强人体免疫力。还具有抗炎、抗病毒、抗过敏和加速伤口愈合的作用。

CS是重要的生化药物，具有多种生物活性，因其特有的生物活性而广泛用于医学领域，目前国内外市场对其需要比较大，我们除加强研究其在临床中的应用外还应在加强生产工艺、分析技术和活性研究的基础上开发新的CS资源，重视扩展其在功能食品、保健品等领域的应用。

硫酸软骨素具有促进冠状动脉循环、降血脂、抗凝血、抗肿瘤和心血管硬化等活性，主要是治疗风湿和类风湿疾病的药物，对冠心病、动脉粥样硬化、心肌梗塞等心血管疾病的防治有一定疗效。

CS是一种天然酸性粘多糖，属生物高分子化合物。CS有A、C和D的3种异构体，均是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰-D-氨基半乳糖硫酸酯为单位组成，只是硫酸基位置不同。CS广泛存在于人和一些动物如猪、牛、羊和鱼等软骨组织中，且通过共价键与核心蛋白相结合。CS为白色、无臭、略带咸味的固体粉末，吸水性强，易溶于水而成粘度大的溶液，难溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，其盐类对热较稳定。

目前酸性黏多糖的提取方法主要有降解法和非降解法。非降解法仅用于非蛋白多糖的黏多糖—透明质酸。而降解法适用于包括透明质酸在内的所有酸性黏多糖。硫酸软骨素的提取采用降解法。降解法又包括碱提取法和蛋白酶提取法两种。根据这些性质，硫酸软骨素的提取方法有很多，归纳起来，主要有碱法、碱盐法、酶解、超声波法和乙酸抽提法等；其分离纯化有乙醇沉淀法、盐液沉淀法、季铵盐络合法和离子交换色谱法等。目前国内普遍采用稀碱和浓碱的提取法，国外报道用稀碱稀盐综合提取法，而这些制备工艺一般都要经过酶解和活性碳或白陶土等处理。

从动物软骨中提取的硫酸软骨素一般以钠盐形式存在，又称硫酸软骨素钠。由于硫酸软骨素对钙的亲和能力比钠强，皮下注射时，常引起血管及毛细血管部位的钙沉积，导致血肿和疼痛。硫酸软骨素钙避免由钠盐转变成钙盐的过程，可有效避免血肿和疼痛。同时，硫酸软骨素钙能清除体内血液中的脂质和脂蛋白，有效防治冠心病，增加细胞的核糖核酸(mRNA)和脱氧核糖核酸(DNA)的生物合成，促进细胞的新陈代谢，因而硫酸软骨素的钙盐比钠盐有更优越的性能，应用前景广阔。

于兹东等硫酸软骨素钙制备研究报道的硫酸软骨素钙制备方法如下：（1）原料溶解：称取50.0g硫酸软骨素钠，加1000mL蒸馏水搅拌溶解；（2）树脂脱钠：把适量阳离子交换树脂再生后，装入离子交换柱中，控制料液以一定速度上柱，测定流出液pH值，当pH=5.0时，开始收集；上柱完毕，用适量蒸馏水洗涤树脂柱，至流出液pH值6.5时，停止收集；（3）钙转型：向收集液中滴加氢氧化钙乳液，调溶液pH值6.5；然后向溶液中加20.0g CaCl₂，搅拌溶解，使溶液中的硫酸软骨素由钠型转变成钙型；（4）沉淀：向溶液中加入95%酒精沉淀至酒精度60%，静置过夜，次日抽滤，得沉淀物；（5）脱水：干燥沉淀物用无水乙醇脱水，静置，次日抽滤，沉淀物放入干燥箱中60℃恒温4h，即得硫酸软骨素钙。

现有技术中均采用先提取硫酸软骨钠，再将硫酸软骨钠制备成钙盐的方法，该方法步骤繁多，产率低。

发明内容

本发明的发明目的在于提出一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺。

为了完成本发明的目的，采用的技术方案为：

本发明涉及一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺，包括以下步骤：

（1）取动物软骨放入反应釜内，加水后蒸煮2～5小时；

（2）碱解提取：加入质量百分比浓度为10～15%的NaOH，优选10~12%；调节pH为12～14，30～48℃提取1～5小时；温度优选为30～45℃，提取时间优选为1～2小时；

（3）酶解：将步骤（2）中得到的提取液用质量百分比浓度为25~30%盐酸调pH值9.5～10.0，加入质量为提取液5～8‰的干料胰酶，搅拌6～7小时；用质量百分比浓度为20%NaOH调pH值8.0～9.5，搅拌6～7小时后加质量百分比浓度为25～30%的盐酸调pH值6.0～7.0，升温至60～70℃，静置1～2小时，过滤；

（4）吸附和洗涤：将步骤（3）得到的过滤液注入吸附罐内，加水调节至密度计1.1的读数为22～23，用阴离子树脂吸附1～2小时；再将滤液注入第二吸附罐，测定加水调至密度计1.1的读数为14～15，用阴离子树脂吸附1～2小时，弃去滤液；吸附后的树脂洗涤，弃去洗涤液；

（5）洗脱：将步骤（4）得到的阴离子树脂加入质量百分比浓度为15%～17%CaCl₂溶液，搅拌1～2小时进行洗脱，洗脱液进行超滤处理；

（6）脱色：步骤（5）得到的超滤液加入过氧化氢溶液中进行脱色；

（7）沉淀：将步骤（6）得到的把溶液升温至60～70℃，过滤；再将得到的滤液降温至20～30℃，边搅拌边加入质量百分比浓度为20～30%的浓盐酸调pH5.5～6.5，用85～90%乙醇沉淀2～4小时；

（8）干燥：把沉淀物用95～100%的乙醇脱水，60℃～70℃烘干，得到硫酸软骨素钙成品。

本发明的第一优选技术方案为，在步骤（1）中，加水的与软骨的重量比为1：1～2，优选1：1.2～1.8。

本发明的第二优选技术方案为，在步骤（2）中，NaOH溶液的添加量为动物软骨蒸煮后固液混合液体积的0.5～2%，优选0.8～1.2%。

本发明的第三优选技术方案为，在步骤（4）中，所述的阴离子树脂采用陶氏D-Ⅱ阴离子树脂。

本发明的第四优选技术方案为，在步骤（4）中，所述的洗涤为将所述的树脂加入到40～55℃的水中，洗涤1~3次，每次20～30分钟。

本发明的第五优选技术方案为，在步骤（4）中，所用树脂的总重量为动物软骨原料重量的4～7倍；其中，第一次吸附和第二次吸附所用的树脂的重量为2～4：1；优选2.2～3.2：1。

本发明的第六优选技术方案为，在步骤（4）中，所述的超滤处理的条件为：温度为35～42℃，优选38～40℃；膜的压力为0.6～0.9Mp，优选0.7～0.9Mp；膜截留相对分子量为5000～10000道尔顿，浓缩至总液量的1/3～1/2。

本发明的第七优选技术方案为，在步骤（5）中，所加入CaCl₂溶液的重量为动物软骨原料的8～10%。

本发明的第八优选技术方案为，所述脱色的步骤为：将得到的超滤液加入到20～27.5%过氧化氢溶液中，pH调至9～10，温度为20～30℃，静置1～4小时。

本发明的第九优选技术方案为，将制备得到的硫酸软骨素钙成品溶解后，重复步骤（7）和步骤（8）进行提纯。

下面对本发明的内容做进一步的解释和说明：

近年来随着技术的发展，对硫酸软骨素的提取方法也有了很大的发展，但是目前还没有一种能集工艺简便、产品质量好和经济性好于一体的制备工艺，特别是硫酸软骨素钙的制备，目前还没有一种能够从软骨中直接提取硫酸软骨素钙的制备工艺；研究一种能够简单快速经济的提取方法具有深远的意义。本发明的硫酸软骨素钙制备工艺，综合了碱-酶解法、酶解-树脂法等方法的优势，结合软骨素自身特点，选择并适合工业生产工艺路线，与硫酸软骨素钠转型生产硫酸软骨素钙的工艺相比，在节省时间的基础上降低了原料的损耗。

本发明的制备工艺包括以下步骤：

1．取动物软骨放入反应釜内，加水后蒸煮2～5小时；加水的与软骨的重量比为1：1～2，优选1：1.2～1.8；本发明的动物软骨可选用猪、牛的软骨组织；本发明采用的制备方法将动物软骨清洗后就可进行加工，不需要粉碎、干燥等步骤，节约时间、节省成本，并且不影响提取率；本发明对水的添加量做了进一步的研究，不仅可以最大限度的释放软骨中的硫酸软骨素，使硫酸软骨素的浓度在较适宜的浓度，从而更加有利于吸附；并且还不会因为溶剂的量过大，从而提高成本，降低提取效率;

2．碱解提取：加入质量百分比浓度为10～15%的NaOH，优选10%；调节pH为12～14，30～48℃提取1～5小时；NaOH溶液的添加量为动物软骨蒸煮后固液混合液体积的0.5～2%，优选0.8～1.2%；提取的温度为30～45℃，提取的时间为1～2小时；

3．酶解：将步骤2中得到的提取液用质量百分比浓度为25~30%盐酸调pH值9.5～10.0，加质量为提取液5～8‰的干料胰酶，搅拌6～7小时，用质量百分比浓度为20%NaOH调pH值8.0～9.5，搅拌6～7小时后加质量百分比浓度为25~30%的盐酸调pH值6.0～7.0，升温至60～70℃，静置1～2小时，过滤；

4．吸附和洗涤：将步骤3得到的过滤液注入吸附罐内，加水调节至密度计1.1的读数为22～23，用阴离子树脂吸附1.5～2小时；再将滤液注入第二吸附罐，测定加水调至密度计1.1的读数为14～15，用阴离子树脂吸附1～2小时，弃去滤液；吸附后的树脂洗涤，弃去洗涤液；所用树脂的总重量为动物软骨原料重量的4～7倍；阴离子树脂采用陶氏D-Ⅱ阴离子树脂，所述的洗涤为将所述的树脂加入到40～55℃的水中，洗涤1~3次，每次20～30分钟；超滤处理的条件为：温度为35～42℃，膜的压力为0.6～0.9Mp，膜截留相对分子量为5000～10000道尔顿；浓缩至总液量的1/3～1/2；本发明采用两次吸附，可最大限量的吸附溶液中的硫酸软骨素钠，从而提高本制备工艺的产率；经过两次吸附后，过滤液中的硫酸软骨素钠的含量低至0.1～0.5%；本发明还对第一次吸附和第二次吸附所用的树脂的重量比进行了实验，经试验检测，两者的重量比为2～4：1、优选2.2～3.2：1时，所用的树脂总量最小，吸附效率最高；

5．洗脱：将步骤4中得到的阴离子树脂加入质量百分比浓度为16%～17%CaCl₂溶液，搅拌1小时进行洗脱，洗脱液进行超滤处理；超滤处理的条件为：温度为35～42℃，膜的压力为0.6～0.9Mp，膜截留相对分子量为5000～10000道尔顿；浓缩至总液量的1/3～1/2；所加入CaCl₂溶液的重量为动物软骨原料的8～10%；超滤处理使除杂时间缩短在3小时左右，可以同时除去大、小分子杂质；采用本发明的洗脱条件，洗脱彻底；

6．脱色：步骤5中得到的洗脱液中加入质量百分比浓度为20～27.5%过氧化氢溶液，pH调至9.5～10，温度为20～30℃，静置1～4小时；

7．沉淀：将步骤6中得到的把溶液升温至60～70℃，过滤；再将得到的滤液降温至20～30℃，边搅拌边加入质量百分比浓度为20～30%的浓盐酸调pH5.5～6.5，用85～90%乙醇沉淀2～4小时；

8．干燥：把沉淀物用95～100%的乙醇脱水，60℃～70℃烘干，得到硫酸软骨素钙成品；

9．将制备得到的硫酸软骨素钙成品溶解后，重复步骤（7）和步骤（8）进行提纯。

本发明的制备工艺的产率20.0～28.0%，纯度为97.0～99.5%。

具体实施方式

实施例1：硫酸软骨素钙盐的制备工艺：

1．取猪鼻骨放入反应釜内，加水后蒸煮5小时；加水的与软骨的重量比为1：2；

2．碱解提取：加入质量百分比浓度为10%的NaOH；调节pH为12，48℃提取5小时；NaOH溶液的添加量为动物软骨蒸煮后固液混合液体积的2%；

3．酶解：将步骤2中得到的提取液用质量百分比浓度为30%盐酸调pH值10.0，加质量为提取液8‰的干料胰酶，搅拌7小时，用质量百分比浓度为20%NaOH调pH值9.5，搅拌7小时后加质量百分比浓度为30%的盐酸调pH值7.0，升温至70℃，静置2小时，过滤；

4．吸附和洗涤：将步骤3得到的过滤液注入吸附罐内，加水调节至密度计1.1的读数为23，用陶氏D-Ⅱ阴离子树脂吸附2小时；再将滤液注入第二吸附罐，测定加水调至密度计1.1的读数为13，用陶氏D-Ⅱ阴离子树脂吸附2小时，弃去滤液；吸附后的树脂用水洗涤，弃去洗涤液；所用树脂的总重量为动物软骨原料重量的5倍，第一次吸附和第二次吸附所用的树脂的重量为2.2：1；所述的洗涤为将所述的树脂加入到55℃的水中，洗涤3次，每次20分钟；

5．洗脱：将步骤4中得到的阴离子树脂加入质量百分比浓度为16%～17%CaCl₂溶液，搅拌1小时进行洗脱，洗脱液进行超滤处理；所加入CaCl₂溶液的重量为动物软骨原料的8%；超滤处理的条件为：温度为42℃，膜的压力为0.9Mp，膜截留相对分子量为8000道尔顿，浓缩至总液量的1/2；

6．脱色：步骤5中得到的洗脱液中加入质量百分比浓度为27.5%过氧化氢溶液，pH调至10，温度为30℃，静置4小时；

7．沉淀：将步骤6中得到的把溶液升温至70℃，过滤；再将得到的滤液降温至30℃，边搅拌边加入质量百分比浓度为30%的浓盐酸调pH6.5，用90%乙醇沉淀4小时；

8．干燥：把沉淀物用95%的乙醇脱水，70℃烘干，得到硫酸软骨素钙成品；

9．提纯：高规格将制备得到的硫酸软骨素钙成品溶解后，重复步骤7和步骤8进行提纯。

实施例2：硫酸软骨素钙盐的制备工艺：

1．取猪鼻骨放入反应釜内，加水后蒸煮3小时；加水的与软骨的重量比为1：1；

2．碱解提取：加入质量百分比浓度为15%的NaOH；调节pH为14，45℃提取5小时；NaOH溶液的添加量为动物软骨蒸煮后固液混合液体积的1.2%；

3．酶解：将步骤2中得到的提取液用质量百分比浓度为25~30%盐酸调pH值9.5～10.0，加质量为提取液5‰的干料胰酶，搅拌6小时，用质量百分比浓度为20%NaOH调pH值9，搅拌7小时后加质量百分比浓度为25%的盐酸调pH值6.0，升温至60℃，静置2小时，过滤；

4．吸附和洗涤：将步骤（2）得到的过滤液注入吸附罐内，加水调节至密度计1.1的读数为22，用陶氏D-Ⅱ阴离子树脂吸附2小时；再将滤液注入第二吸附罐，测定加水调至密度计1.1的读数为14，用陶氏D-Ⅱ阴离子树脂吸附2小时，弃去滤液；吸附后的树脂用水洗涤，弃去洗涤液；所用树脂的总重量为动物软骨原料重量的4倍；第一次吸附和第二次吸附所用的树脂的重量为4：1；所述的洗涤为将所述的树脂加入到50℃的水中，洗涤3次，每次30分钟；

5．洗脱：将步骤4得到的阴离子树脂加入质量百分比浓度为17%CaCl₂溶液，搅拌1小时进行洗脱，洗脱液进行超滤处理；所加入CaCl₂溶液的重量为动物软骨原料的10%；超滤处理的条件为：温度为35℃，膜的压力为0.6Mp，膜截留相对分子量为5000道尔顿；浓缩至总液量的1/3；

6．脱色：步骤5得到的超滤液中加入质量百分比浓度为25%过氧化氢溶液，pH调至10，温度为28℃，静置4小时；

7．沉淀：将步骤6得到的溶液升温至70℃，过滤；再将得到的滤液降温至30℃，边搅拌边加入质量百分比浓度为30%的浓盐酸调pH6，用90%乙醇沉淀4小时；

9．高规格将制备得到的硫酸软骨素钙成品溶解后，重复步骤7和步骤8进行提纯。

经检测得到硫酸软骨素钙的含量98.4%，水分8.3%，收率为22.65%。

实施例3：采用猪鼻骨制备硫酸软骨素钙为例：

1.取净洗后的猪鼻骨400公斤放在釜内，加水的与软骨的重量比为1：1，蒸煮2小时，然后闷煮1.5小时，再降温至35℃；

2.加入10%NaOH边搅拌边注入达到降温液总量的1%左右，调pH为13，提取3小时；

3.用浓盐酸调pH值9，加质量为提取液8‰的干料胰酶，搅拌6小时，用20%NaOH调pH值为pH8.5，6小时后加质量百分比浓度为25%的盐酸调pH值6.0，升温至70℃，静置1小时，用滤布及硅藻土过滤，滤渣加水，然后再过滤一遍，合并滤液；

4.将过滤液注入吸附罐内，软骨原料与树脂的重量比为1：6，用密度计1.1测定加水调至22，用阴离子树脂陶氏D-Ⅱ搅拌吸附1小时，此液放入第二吸附罐，用密度计1.1测定加水调至15，吸附1小时，弃掉；第一次吸附和第二次吸附所用的树脂的重量为3：1；吸附罐内用55℃水，用量以浸没过树脂为度搅拌洗涤2次，每次20分钟；

5.将步骤4得到的阴离子树脂加入质量百分比浓度为16%CaCl₂溶液，所加入CaCl₂溶液的重量为动物软骨原料的10%；搅拌1小时后洗脱；洗脱液进行超滤处理；超滤处理的条件为：温度为42℃，膜的压力为0.9Mp，膜截留相对分子量为10000道尔顿，浓缩至总液量的1/3；

6.洗脱液注入氧化罐内，加入适量的27.5%过氧化氢，pH调至9.5，温度在35℃，静置4小时；

7.将步骤6得到溶液升温至75℃，用滤布过滤至澄清，降温至35℃，边搅拌边加入30%浓盐酸调pH6.0，用90%乙醇沉淀4小时；

8.沉淀物用95%的乙醇脱水3次；70℃以下烘干，即得硫酸软骨素钙盐成品。

经检测得到含量98.4%，水分8.3%，重量92.6公斤。

实验例1：考察吸附条件对硫酸软骨素钙盐提取的影响

1.采用实施例3的制备条件，设计对比例1、对比例2、对比例3，仅改变对比例的步骤（4）中的吸附条件，其余步骤和条件同实施例3；各组条件和制备硫酸软骨素钙盐的纯度、提取率如表1所示：

表1：

	实施例3	对比例1	对比例2	对比例3
					软骨原料与树脂的重量比	1：6	1：4	1：8	1：2
纯度（HPLC）	98.4%	97.8%	94.3%	93.5%
					收率	23.15%	19.3%	19.5%	8.6%

由上述实验可知，采用本发明的吸附条件，其收率较佳；而进一步提高树脂的用量，收率没有增加，反而会增加成本。

2.采用实施例3的制备条件，设计对比例4、对比例5、对比例6，仅改变对比例的步骤（4）中的吸附条件，其余步骤和条件同实施例3；各组条件和制备硫酸软骨素钙盐的纯度、提取率如表2所示：

表2：

	实施例3	对比例4	对比例5	对比例6
					第一次吸附、第二次吸附树脂的重量比	3：1	1：1	2：1	2.5：1
纯度（HPLC）	98.4%	96.5%	94.1%	95.8%
					收率	23.15%	15.7%	17.1%	20.4%

3.采用实施例3的制备条件，设计对比例7、对比例8、对比例9，仅改变对比例的步骤（4）中的吸附条件，其余步骤和条件同实施例3；各组条件和制备硫酸软骨素钙盐的纯度、提取率如表3所示：

表3：

	实施例3	对比例7	对比例8	对比例9
					第一次吸附时溶液的密度（密度计1.1测定）	23	22	21	20
第二次吸附时溶液的密度（密度计1.1测定）	15	14	13	12
					纯度（HPLC）	98.4%	97.1%	94.7%	95.8%
收率	23.15%	21.5%	18.2%	16.8%

实验例2影响因素试验

将本发明实施例3制备得到的硫酸软骨素钙盐，按照常规制备方法制备成冻干粉针，模拟上市包装，进行稳定性试验。

1.高温试验

取实施例3制备的硫酸软骨素钙盐的三个批次10001、10002、10003，按常规制备方法制备冻干粉针后，置密封洁净容器中，于40℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，试验结果与0天比较。

2.强光照射试验

取硫酸软骨素钙盐的三个批次10001、10002、10003，按常规方法制备成冻干粉针后，置密封洁净容器中，置于照度为4500lx的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，结果与0天比较。

试验结果如表4所示。

表4：硫酸软骨素钙盐的影响因素试验结果

结果表明：本发明的硫酸软骨素钙盐冻干粉针剂，在模拟上市包装的条件下，在光照、高温条件下放置10天，各项指标无明显变化。

对本发明其它实施例制备得到的硫酸软骨素钙盐也进行了相同的试验，获得了相似的结果。

实施例3影响因素试验

将本发明实施例1制备得到的硫酸软骨素钙盐，常规方法制备冻干粉针，模拟上市包装，进行稳定性试验。

1.高温试验

取实施例1制备的硫酸软骨素钙盐的三个批次10004、10005、10006，按常规方法制备冻干粉针后，置密封洁净容器中，于40℃温度下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，试验结果与0天比较。

2.高湿度试验

取硫酸软骨素钙盐的三个批次10004、10005、10006，按常规方法制备成冻干粉针后，置恒湿密闭容器中，在25℃、95%RH的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，试验结果与0天比较。

3.强光照射试验

取硫酸软骨素钙盐的三个批次10004、10005、10006，按常规方法制备成冻干粉针后，置密封洁净容器中，置于照度为4500lx的条件下放置10天，于第5天和第10天取样，按稳定性重点考察项目进行检测，结果与0天比较。

试验结果如表5所示。

表5：硫酸软骨素钙盐影响因素试验结果

结果表明：本发明的硫酸软骨素钙盐制备的冻干粉针剂，在模拟上市包装的条件下，在光照、高温、高湿条件下放置10天，各项指标无明显变化。

实验例4加速实验

将本发明实施例2制备得到的硫酸软骨素钙盐的三个批次10007、10008、10009，按照常规方法制备冻干粉针，模拟上市包装，进行如下稳定性试验：于42℃、80%RH条件下放置6个月，在试验期间分别于1、2、3、6个月末取样一次，对各稳定性重点考察项目进行检验。实验结果如表6所示。

表6：硫酸软骨素钙盐加速试验结果

由加速试验结果可知，本发明的硫酸软骨素钙盐，经加速试验6个月考察，有关物质和含量略有变化，其余各项指标未发生明显变化。证实本发明的硫酸软骨素钙盐的稳定性能良好。

对本发明其它实施例制备得到的硫酸软骨素钙盐也进行了相同的试验，其获得的结果相似。

实验例5：加速试验的比较实验

将本发明制备实施例3得到的硫酸软骨素钙盐的三个批次10001、10002、10003，按照常规方法制备冻干粉针，进行稳定性加速试验；

同时按照文献“硫酸软骨素钙制备研究”（于兹东等，青岛大学学报，2003年9月）公开的制备方法制备硫酸软骨素钙，作为对比药物，取3个批次Y1、Y2、Y3，按照同样的方法制备冻干粉针，进行稳定性加速试验；

同时按照文献“硫酸软骨素钙的制备工艺”（史大勇等，青岛化工学院学报，2002年6月）公开的制备方法制备硫酸软骨素钙，作为对比药物，取3个批次S1、S2、S3，按照同样的方法制备冻干粉针，进行稳定性加速试验；

模拟上市包装，同时置密封洁净容器中，于45℃、80%RH条件下放置6个月，在试验期间分别于1、2、3、6个月末取样一次，对各稳定性重点考察项目进行检验。实验结果如表7所示。

表7：硫酸软骨素钙盐与对比药物加速试验结果

由加速比较试验结果可知，本品经加速试验6个月考察，有关物质和含量均无明显变化。而对比药品的有关物质、含量则发生了显著的变化，对比实验证实，本发明的硫酸软骨素钙盐制备得到的冻干针剂的稳定性要优于现有技术。

对本发明其它实施例制备得到的硫酸软骨素钙盐也进行了相同的试验，得到了相同的实验结果。

Claims

1.一种硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取动物软骨放入反应釜内，加水后蒸煮2～5小时；

(2)碱解提取：加入质量百分比浓度为10～15％的NaOH；调节pH为12～14，30～48℃提取1～5小时；

(3)酶解：将步骤(2)中得到的提取液用质量百分比浓度为25～30％盐酸调pH值9.5～10.0，加入质量为提取液5～8‰的干料胰酶，搅拌6～7小时；用质量百分比浓度为20％NaOH调pH值8.0～9.5，搅拌6～7小时后加质量百分比浓度为25～30％的盐酸调pH值6.0～7.0，升温至60～70℃，静置1～2小时，过滤；

(4)吸附和洗涤：将步骤(3)得到的过滤液注入吸附罐内，加水调节至密度计1.1的读数为22～23，用阴离子树脂吸附1～2小时；再将滤液注入第二吸附罐，加水调至密度计1.1的读数为14～15，用阴离子树脂吸附1～2小时，弃去滤液；吸附后的树脂洗涤，弃去洗涤液；所述的洗涤为将所述的树脂加入到40～55℃的水中，洗涤1～3次，每次20～30分钟；所用树脂的总重量为动物软骨原料重量的4～7倍；

(5)洗脱：将步骤(4)得到的阴离子树脂加入质量百分比浓度为15％～17％CaCl₂溶液，搅拌1～2小时进行洗脱，洗脱液进行超滤处理后得到浓缩液；所述的超滤处理的条件为：温度为35～42℃，膜的压力为0.6～0.9Mpa，膜截留相对分子量为5000～10000道尔顿，浓缩至总液量的1/3～1/2；

(6)脱色：步骤(5)得到的浓缩液加入过氧化氢溶液中进行脱色；

(7)沉淀：将步骤(6)得到的溶液升温至60～70℃，过滤；再将得到的滤液降温至20～30℃，边搅拌边加入质量百分比浓度为20～30％的浓盐酸调pH5.5～6.5，用85～90％乙醇沉淀2～4小时；

(8)干燥：把沉淀物用95～100％的乙醇脱水，60℃～70℃烘干，得到硫酸软骨素钙成品。

2.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，在步骤(1)中，加水的与软骨的重量比为1：1～2。

3.根据权利要求2所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，加水的与软骨的重量比为1：1.2～1.8。

4.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，在步骤(2)中，加入质量百分比浓度为10～12％的NaOH。

5.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，在步骤(2)中，温度为30～45℃，提取时间为1～2小时。

6.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，在步骤(2)中，NaOH溶液的添加量为动物软骨蒸煮后固液混合液体积的0.5～2％。

7.根据权利要求6所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，NaOH溶液的添加量为动物软骨蒸煮后固液混合液体积的0.8～1.2％。

8.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，在步骤(5)中，所述的超滤处理的条件为：温度为38～40℃。

9.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，在步骤(5)中，所述的超滤处理的条件为：膜的压力为0.7～0.9Mpa。

10.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，在步骤(5)中，所加入CaCl₂溶液的重量为动物软骨原料的8～10％。

11.根据权利要求1所述的硫酸软骨素钙盐的制备工艺，其特征在于，将制备得到的硫酸软骨素钙成品溶解后，重复步骤(7)和步骤(8)进行提纯。