CN101283979B - 促进伤口愈合的透明质酸小片段药膏的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进伤口愈合的透明质酸小片段药膏的制备方法。首先制备透明质酸寡糖并通过鉴定分离纯化，获取4～20mers透明质酸小片段寡糖o-HA；取单硬脂酸甘油酯、地蜡、白凡士林，加热溶化后再加液状石蜡并保持80℃作为油相；取4～20mers透明质酸小片段寡糖、对羟基苯甲酸乙酯、OP乳化剂、司盘-80，并加蒸馏水70-80℃保温作为水相；将水相缓缓加入油相中，边加边搅拌，直至乳化完成、冷凝，即得透明质酸小片段药膏。本发明所得的透明质酸小片段药膏，能有效延缓o-HA在伤口局部的释放，促进伤口局部血管新生，同时促进伤口愈合。

Description

促进伤口愈合的透明质酸小片段药膏的制备方法

技术领域

本发明涉及一种透明质酸小片段(Hyaluronan oligosaccharides，o-HA)药膏的制备方法，用于促进伤口愈合。

背景技术

组织损伤与修复是目前外科领域研究的热点课题，在临床上修复障碍主要表现为愈合迟缓性皮肤伤口，如糖尿病溃疡、小腿溃疡和压迫性溃疡等，由于其发病率高，致残率高，成为临床治疗的难题之一。伤口愈合迟缓这一临床常见难治病，一直困绕着医学界，如何有效促进伤口愈合是当今医学亟待解决的热点问题。

随着对创伤愈合分子机制研究的日益深入，近年来临床上开始使用多肽生长因子治疗各种软组织损伤，并取得了良好的效果。大量动物实验和临床应用证明，基因重组牛碱性成纤维细胞生长因子(rbFGF)可以促进急性损伤，如烧伤、供皮区、手术切口等创面愈合。对慢性难愈合创面也有明显的促伤口愈合作用。此外，血管内皮生长因子(VEGF)在多种动物模型实验中具有促进血管形成作用，进而促进伤口愈合。但是目前上述多肽生长因子均尚未进入临床应用，原因很多，其中之一可能包括这类因子均为蛋白质，直接应用于伤口局部，容易被体内蛋白酶快速分解，作用不持久。目前唯一应用于临床的促血管因子是血小板衍生化生长因子(PDGF)，作为辅助药物用于糖尿病的伤口愈合治疗。

一些中药治疗慢性创面有良好的疗效，除了内服中药以外，外用中药的应用在伤口愈合的不同阶段发挥着重要作用。然而，目前对外用中药的研究仍处于起步阶段，从药效到中药的物质基础研究正在进行初步的探索。目前外用中药对血管内皮细胞增殖的影响的文献报道尚少。

透明质酸(Hyaluronan，HA)是酸性粘多糖，由(1-3)-2-乙酸氨基-2-脱氧-β-D葡萄糖-(1-4)-o-β-D-葡萄糖醛酸双糖重复单位组成，是线型大分子聚合物，分子量约为50-200kDa。HA在体内一般与蛋白结合在一起，习惯称为蛋白多糖。糖生物学是当今生命科学中的新前沿之一。有学者预示，基因组学、蛋白组学后的时代是糖生物组学，目前，关于糖类分子的研究及开发明显落后于蛋白与核酸，已经引起医学界的重视。

HA是生物体细胞外基质结构(ECM)中含量最多的糖分子，是ECM的主要支撑结构。除此以外，已经证明HA具有非常广泛的生物学活性，参与机体各种生理及病理活动，如组织修复、血管形成、防止伤口粘连以及肿瘤转移等等。1985年，West DC等首次在“Science”上报道：HA大分子被分解成小片断后，具有强烈促血管生成作用。随后几年，陆续有报道认为透明质酸寡糖分子(Hyaluronan oligosaccharides，o-HA)在体内外条件下，可促进新生血管形成。Rooney等直接将o-HA涂抹到大鼠后背上，观察o-HA对皮肤血管促进作用，以及o-HA浸入皮肤深层的厚度。结果发现，o-HA不仅在皮肤表层直接促进新生血管形成，而且可以浸入表皮层下达800μm深度。提示o-HA如果作为外用药物，很容易浸入皮下组织。Lees等则研究了o-HA对大鼠冻伤伤口愈合中，血管运行的影响。采用Doppler流变仪及免疫组化分析手段，发现o-HA明显促进液氮所致大鼠伤口的血流运行及血管增生程度。这种寡糖片断一般为3～50mer双糖分子，其促进新生血管形成的机理目前还不清楚。

由于o-HA具有促进新生血管形成(angiogenesis)的作用，因此有不少学者开始关注o-HA与伤口愈合的关系，但是至今尚无突破，多局限于体外研究。截止目前尚无直接观察o-HA促进伤口模型愈合的报道，不排除与o-HA药物持续时间、给药剂量等难度有关。如果未来o-HA作为促血管生成药物进入临床应用，唯一要关注的是，采用必要手段，使o-HA在局部应用时，缓慢释放而避免被快速吸收。另外，o-HA的制备和鉴定方法较为复杂等因素可能是在HA与伤口愈合的研究领域中我国远远落后于发达国家的原因之一。一般来说，o-HA的制备与鉴定较为繁琐，涉及到高压液相、质谱仪等超大型设备，不仅昂贵而且复杂。

如果未来o-HA作为促血管生成药物进入临床应用，则可能成为革命性的突破。因为o-HA是消化较彻底的HA糖分子，不像蛋白类促血管生成因子(如VEGF、bFGF等)，如果局部应用不会再被消化灭活。因此o-HA有可能避免了这类蛋白性质的血管生长因子作用不能持久的弊端。另外，o-HA属于内源性因子，不易产生耐药作用。因此，一旦开发出o-HA治疗伤口的潜力，则将对临床外科伤口治疗产生巨大的影响。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种促进伤口愈合的透明质酸小片段药膏的制备方法，制备一种膏状外用药物，能有效促进血管生成，并延长药物在伤口局部的存在时间，缓慢释放而避免被快速吸收，为临床伤口愈合治疗提供一剂良药。

为实现这样的目的，本发明采用一种新的、简便的鉴定分离纯化透明质酸寡糖分子的方法--FACE电泳，并通过进一步的实验验证了所获得o-HA复合体(4～20mer)的生物学活性。进而将o-HA水溶液乳化，制备o-HA缓式释放乳膏，使药物在伤口局部缓慢释放。首先制备透明质酸寡糖并通过鉴定分离纯化，获取4～20mers透明质酸小片段寡糖o-HA；取单硬脂酸甘油酯、地蜡、白凡士林，加热溶化后再加液状石蜡并保持80℃作为油相；取4～20mers透明质酸小片段寡糖、对羟基苯甲酸乙酯、OP乳化剂、司盘-80，并加蒸馏水70-80℃保温作为水相；将水相与油相搅拌混合，乳化完成冷凝，即得透明质酸小片段药膏。

本发明的方法包括如下具体步骤：

1、制备透明质酸小片段寡糖复合体(o-HA，4～20mer)：纯化及分子量鉴定：

将透明质酸溶解后加入4wt％的牛睾丸透明质酸酶，酶解16小时后沸水浴煮沸以去除牛睾丸透明质酸酶；离心后取上清液过Bio-Gel P10凝胶柱，咔唑法检测每管糖醛酸含量；将含有糖醛酸的溶液过Sephadex G25柱脱盐后，用荧光标记高压电泳、高效液相色谱及静电喷雾质谱鉴定o-HA聚合度；取4～20mers透明质酸小片段寡糖o-HA稀释成1mg/ml，4℃保存备用。

2、制备油相：按质量百分数计，取单硬脂酸甘油酯12.8～19.2％、地蜡3～7％、白凡士林5.6～10.4％，80℃水浴加热溶化，再加液状石蜡64～72％补足至100％为油相，80℃保温备用。

3、制备水相：按质量百分数计，取对羟基苯甲酸乙酯0.13～0.53％、OP乳化剂0.53～1.33％、司盘-80  1.33～2.67％、4～20mers透明质酸小片段寡糖0.13～1.33％、用蒸馏水补足至100％为水相，70～80℃保温备用。

4、将1份水相缓缓加入1.67份油相中，边加边依同一方向不断搅拌，直至乳化完成、冷凝，即得透明质酸小片段药膏。

本发明方法简单，取材容易且成本价格低廉。本发明制备所得的透明质酸小片段药膏色泽均匀、质地细腻、稳定性高。实验研究结果表明，本发明制备的透明质酸小片段药膏在体内、体外实验中均表现出具有较强的促进伤口愈合的作用。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下实施例的作用应被理解为是对本发明的诠释而非对本发明任何方式的限制。

实施例1

1.制备透明质酸小片段寡糖(o-HA)：纯化及分子量鉴定。

参照论文：(Gao F，et al.Preparation and characterization of hyaluronanoligosaccharides for angiogenesis study.J Biomed Mater Res 2006；78(2)：385-392.)。

1)将500mg透明质酸溶解在5ml 1mol/L的氯化钠中，加入20mg牛睾丸透明质酸酶(500U/mg)37℃酶解，16小时后沸水浴10分钟以去除牛睾丸透明质酸酶，获得透明质酸小片段寡糖(o-HA)

2)1455G相对离心力离心5分钟，取上清液过Bio-Gel P10凝胶柱(柱尺寸：1.5×100厘米；洗脱液：1mol/L氯化钠含10％(v/v)乙醇；流速：0.5ml/分钟)每6分钟收集1管，共100管。

3)咔唑法检测每管糖醛酸含量。

4)将含有糖醛酸的收集管脱盐(Sephadex G25；柱长1×50厘米；洗脱液：去离子水；流速：1ml/分钟；)后，用荧光标记高压电泳、高效液相色谱及静电喷雾质谱鉴定o-HA聚合度。

5)将4～20mers o-HA稀释成1mg/ml，真空浓缩干燥后4℃保存备用。

2.取单硬脂酸甘油酯0.5g、地蜡0.25g、白凡士林0.25g 80℃水浴加热溶化、加液状石蜡2.125g，并保持80℃为油相。

3.取对羟基苯甲酸乙酯5mg、OP乳化剂15mg、司盘-80 35mg、透明质酸小片段寡糖5mg、蒸馏水1.815g作为水相，70-80℃保温备用。

4.将水相缓缓加入油相中，边加边依同一方向不断搅拌，直至乳化完成、冷凝，即得。最终得到5g的药膏。

将制备所得的透明质酸小片段药膏应用于伤口愈合模型小鼠背部的伤口上，实验测定伤口的愈合速度及伤口局部新生血管形成的情况。结果表明，2天伤口愈合率：3.56％；4天伤口愈合率：18.14％；6天伤口愈合率：44.06％；8天伤口愈合率：89.45％。本发明的药膏有效延缓了o-HA在伤口局部的释放，保证了持久的药效作用；促进了伤口局部血管新生，同时促进了伤口愈合。

实施例2

1.按实施例1方法制备透明质酸小片段寡糖(o-HA)。

2.取单硬脂酸甘油酯0.56g、地蜡0.3g、白凡士林0.3g 80℃水浴加热溶化、加液状石蜡1.965g，并保持80℃为油相。

3.取对羟基苯甲酸乙酯7.5mg、OP乳化剂25mg、司盘-80 50mg、透明质酸小片段寡糖15mg、蒸馏水1.7775g作为水相，70-80℃保温备用。

4.将水相缓缓加入油相中，边加边依同一方向不断搅拌，直至乳化完成、冷凝，即得。最终得到5g的药膏。

按实施例2的方法制备的透明质酸小片段药膏，将该药膏应用于伤口愈合模型小鼠背部的伤口上，实验测定伤口局部新生血管形成的情况及伤口的愈合速度。结果表明，2天伤口愈合率：6.38％；4天伤口愈合率：29.83％；6天伤口愈合率：58.78％；8天伤口愈合率：96.55％。本发明的药膏有效延缓了o-HA在伤口局部的释放，促进了伤口局部血管新生，进而促进了伤口愈合。

实施例3

1.制备透明质酸小片段寡糖(o-HA)。

2.取单硬脂酸甘油酯0.35g、地蜡0.175g、白凡士林0.175g 80℃水浴加热溶化、加液状石蜡2.425g，并保持80℃为油相。

3.取对羟基苯甲酸乙酯75mg、OP乳化剂75mg、司盘-80  175mg、透明质酸小片段寡糖10mg、蒸馏水1.540g作为水相，70-80℃保温备用。

4.将水相缓缓加入油相中，边加边依同一方向不断搅拌，直至乳化完成、冷凝，即得。最终得到5g的药膏。

按实施例3的方法制备的透明质酸小片段药膏，将该药膏应用于伤口愈合模型小鼠背部的伤口上，实验测定伤口局部新生血管形成的情况及伤口的愈合速度。结果表明，；2天伤口愈合率：4.56％；4天伤口愈合率：21.14％；6天伤口愈合率：50.03％；8天伤口愈合率：92.74％。本发明的药膏有效延缓了o-HA在伤口局部的释放，促进了伤口局部血管新生，进而促进了伤口愈合。

Claims (1)

1. 一种促进伤口愈合的透明质酸小片段药膏的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

1)将透明质酸溶解后加入4wt％的牛睾丸透明质酸酶，酶解16小时后沸水浴煮沸以去除牛睾丸透明质酸酶；离心后取上清液过Bio-Gel P10凝胶柱，咔唑法检测每管糖醛酸含量；将含有糖醛酸的溶液过Sephadex G25柱脱盐后，用荧光标记高压电泳、高效液相色谱及静电喷雾质谱鉴定o-HA聚合度；取4～20mers透明质酸小片段寡糖o-HA稀释成1mg/ml，真空浓缩干燥后4℃保存备用；

2)按质量百分数计，取单硬脂酸甘油酯12.8～19.2％、地蜡3～7％、白凡士林5.6～10.4％，80℃水浴加热溶化，再加液状石蜡64～72％补足至100％为油相，80℃保温备用；

3)按质量百分数计，取对羟基苯甲酸乙酯0.13～0.53％、OP乳化剂0.53～1.33％、司盘-80  1.33～2.67％、4～20mers透明质酸小片段寡糖0.13～1.33％、用蒸馏水补足至100％为水相，70～80℃保温备用；

4)将1份水相缓缓加入1.67份油相中，边加边依同一方向不断搅拌，直至乳化完成、冷凝，即得透明质酸小片段药膏。