CN114573665A - 一种手性止血多肽及其制备方法与应用 - Google Patents

一种手性止血多肽及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种手性止血多肽及其制备方法与应用，该手性止血多肽的结构式如式(Ⅰ)所示。其制备方法包括：树脂的活化，氨基酸的耦联，多肽的切除和沉淀，多肽的分离纯化。本发明制得的手性止血多肽有良好的生物相容性，不会引起伤口部位的炎性反应，具有结合钙离子的功能，且在止血与骨再生等方面表现出优异的效果。
Figure DDA0003478384000000011

Description

一种手性止血多肽及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种手性止血多肽及其制备方法与应用。
背景技术
牙拔除术后出血是口腔临床工作中最常见的并发症，大多因局部因素引起，如处理不及时可导致严重的并发症。填塞法是最常见的拔牙窝出血处理方式，合理使用局部止血材料充填拔牙窝是治疗及预防拔牙后出血的重要措施。传统拔牙窝止血材料-碘仿纱条是早年常用的止血材料，但因其不可降解，需二次手术取出延迟拔牙窝愈合，已逐渐被淘汰。
常用的止血材料包括明胶海绵、纤维蛋白胶和医用胶原蛋白。因明胶海绵价格低廉，是临床上常用的拔牙后止血填充材料。但明胶海绵易软化，不适合用于拔牙窝大量出血，易被血液冲出，无法达到止血效果。纤维蛋白胶是从人或哺乳动物血浆制备而来，主要成分是黏蛋白和凝血酶浓缩物，通过高浓度的纤维蛋白原及凝血因子模拟机体凝血过程形成纤维蛋白膜达到止血作用，且可用于凝血功能障碍的患者，但由于其是血液制品存在诱发免疫反应风险。医用胶原蛋白是胶原蛋白制作的胶原塞，通过吸收水分或血液后可膨胀，能粘附于组织表面，达到止血效果。在出血量较大的情况下，胶原塞也不易软化。尽管上述临床上使用的止血材料充填及覆盖拔牙窝后均有一定的止血效果，然而在预防及快速控制失血方面尚存在不足。
随着研究发现，近年研究人员利用自组装多肽水凝胶在大组织器官损伤止血方面取得一定成效，如肝外伤止血、心脏穿透止血，因其不用缝合且具有良好生物相容性和安全性，作为止血材料具有独特地优势。自组装多肽水凝胶原理是通过多肽在疏水作用、静电作用和氢键结合等非共价弱相互作用的驱动下，自组装多肽可以在出血部位凝胶化，进而显著减少失血。这种由弱相互作用驱动的自我组装成特定的网络纳米结构形成物理屏障，但微弱的闭合体间相互作用使得它们较脆弱。同时，自组装多肽水凝胶能否用于口腔拔牙止血也难以预期。
现有临床上常用拔牙窝止血材料，如明胶海绵和医用胶原蛋白，大都通过机械压迫方式借助材料吸血膨胀，粘附，凝血，达到止血效果。尽管上述材料都具有一定的止血功效，但是部分止血材料对大量出血或凝血功能障碍无效，且止血材料本身缺少与机体相互作用机制，不能达到快速止血效果。而现有的自组装多肽水凝胶，多肽由于其特殊的分子结构，容易被蛋白酶识别和水解，难以兼顾稳定性与功效性。
发明内容
本发明目的在于解决现有的明胶海绵、纤维蛋白胶、医用胶原蛋白、自组装多肽水凝胶等止血材料存在的止血速度缓慢、止血效果不佳、功能相对单一、难以兼顾稳定性与功效性等问题。
基于上述目的，本发明提供了以D型氨基酸为原料的一种手性止血多肽来解决本领域内的这种需要。
一方面，本发明涉及一种手性止血多肽，一种手性止血多肽结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0003478383980000031
另一方面，本发明涉及一种手性止血多肽的制备方法，其包括：
树脂的活化：DMF浸泡溶胀树脂30min，去除液体后，采用DMF和DCM交替洗涤2次，然后用DMF洗涤2次，每次洗涤时间为30s。；
氨基酸的耦联：依照式(Ⅰ)所示多肽结构式的氨基酸序列，将D型氨基酸经HBTU/HOBT、DIEA活化后加入树脂，从C端至N端进行顺序反应得到含多肽的树脂；
多肽的切除和沉淀：将所述含多肽的树脂置于切割液中2～3h，经冰乙醚沉淀，50％乙腈水重悬，0.45μM滤膜过滤，得到多肽粗品；所述切割液以1mL去离子水计，包含1mL去离子水、17.6mL TFA、0.4mL Tips和0.7g苯酚；
多肽的分离纯化：将所述冻干的粗品多肽溶于6M盐酸胍水溶液中，使用制备反相C18液相色谱(HPLC)分离所述多肽粗品，收集主要峰产物。
具体地，在本发明提供的一种手性止血多肽的制备方法中，其包括：
(1)以Rink Amide MBHA树脂为固相载体，称取树脂倒入反应器内，加入10mL DMF浸泡溶胀，上下翻转30min，抽干液体，用DMF，DCM交替洗涤二次，最后用DMF洗涤2次，每次30s。
(2)用含20％哌啶的DMF洗脱Fmoc 2次，分别为5min，10min。2次洗脱中间用DMF洗涤1次，洗涤30s，之后依次用DMF，DCM交替洗涤二次，最后用DMF洗涤2次，每次30s。将DMF溶解的第一个D型氨基酸经HBTU/HOBT、DIEA活化30s后，混合到树脂中，室温上下翻转反应30min。抽滤，用DMF，DCM交替洗涤二次，最后用DMF洗涤2次，每次30s。重复上一流程。按照式(Ⅰ)所示多肽结构式的氨基酸序列顺序从C端至N端依次反应即可得到含手性止血多肽的树脂。
(3)将反应完的树脂用甲醇和DCM依次洗涤4次，干燥树脂，将树脂转移到耐酸碱的20mL玻璃瓶中，瓶中含有17.6mL三氟乙酸,0.4mL Tips、1mL去离子水，0.7g苯酚的切割液，置于磁力搅拌器下，室温下搅拌反应2～3h，转速为550rpm。反应完成后，将切割液缓慢倒入装有冰乙醚的50mL离心管中，析出白色沉淀，离心弃上清(4度，4000rpm，3min)，乙醚洗涤3次。最后用50％乙腈水重悬，0.45μM滤膜过滤，液体收集在50mL离心管中，液氮速冻，获得多肽粗品。
(4)将冻干的多肽粗品溶于6M盐酸胍水溶液中，0.22μM滤膜过滤，使用制备反相C18液相色谱(HPLC)分离粗产物。收集主要峰产物进行电喷雾质谱鉴定，其中液相流速0.1mL/min，流动相为50％CAN(含千分之一甲酸)，在冷冻干燥机上冷冻干燥，得到所述手性止血多肽，多肽样品-20℃保存。
另一方面，本发明涉及一种凝胶，其包括手性止血多肽和钙离子溶液。
进一步地，在本发明提供的一种凝胶中，每100L的1g/L钙离子溶液与0.5～10g所述手性止血多肽混合。
本发明对多肽进行修饰和改造，以D型氨基酸为原料，制备得到一种手性止血多肽，其为钙离子结合肽，在钙离子的作用下，多肽序列自组装为纳米线，兼顾了稳定性与功效性。由本发明提供的由一种手性止血多肽制备的凝胶经试验证明其展现出良好的止血及生物相容性，体内应用不引起局部及全身炎症反应，且机体内降解时间短，已到达促进止血以及伤口愈合和骨再生的功效。由此，本发明进一步请求保护由本发明提供的手性止血多肽制备的凝胶在制备止血材料中的应用和在制备促进骨再生材料中的应用。基于上述应用，本发明进一步请求保护基于本发明在无创造性活动下可得到的一种止血材料、一种止血组合物和一种促进骨再生的组合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果或优点：
本发明提供的由手性止血多肽制备的凝胶经试验证明其展现出良好的止血及生物相容性，体内应用不引起局部及全身炎症反应，且机体内降解时间短，兼具促进止血、伤口愈合和骨再生的功效。
附图说明
图1为手性止血多肽HPLC检测结果图。
图2为手性止血多肽电喷雾质谱鉴定结果图。
图3为由手性止血多肽制备凝胶的体外凝血效果图；其中，Ctrl代表空白对照组，Gelfoam代表明胶海绵组，D代表手性止血多肽凝胶组。
图4为手性止血多肽制备凝胶的体外凝血指数变化图；其中，Ctrl代表空白对照组，Gelfoam代表明胶海绵组，CaDS代表手性止血多肽凝胶组。
图5为大鼠皮下移植明胶海绵或手性止血多肽术后不同时间点皮下HE染色结果图；其中，Gelfoam代表明胶海绵组，D代表手性止血多肽凝胶组。
图6为大鼠皮下移植明胶海绵或手性止血多肽术后1天的血常规检测结果图；其中，Gelfoam代表明胶海绵组，D代表手性止血多肽凝胶组。
图7为大鼠皮下移植明胶海绵或手性止血多肽术后1天的血清生化指标检测结果图；图7A为肝功能检测结果图，图7B为肾功能检测结果图，图7C为心肌酶谱检测结果图；其中，Gelfoam代表明胶海绵组，D代表手性止血多肽凝胶组。
图8为明胶海绵或手性止血多肽对大鼠牙槽窝止血功效评价结果；其中，Ctrl代表空白对照组，Gelfoam代表明胶海绵组，D代表手性止血多肽凝胶组。
图9为明胶海绵或手性止血多肽对大鼠拔牙窝骨新生功效评价结果；图9A为microCT扫描图，图9B为骨体积比分比(BV/TV)，图9C为骨小梁厚度(Tb.Th)，图9D为骨小梁空间(Tb.sp)，图9E为骨小梁数量(Tb.N)；其中，Ctrl代表空白对照组，Gelfoam代表明胶海绵组，D代表手性止血多肽凝胶组。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供了手性止血多肽的合成及制备试验。
利用为FMOC-chemistry SPPS开发的HBTU活化/DIEA原位中和方案的HBTU/HOBt方法，以D型氨基酸为原料，使用CS bio 336X全自动多肽合成仪，在树脂(Rink Amide MBHA，取代率0.46mmol/g)上合成(rada)4-gsvlgyiqir(如式(Ⅰ)所示多肽结构式氨基酸序列的手性止血多肽)。粗品在含有88％TFA、5％苯酚、5％H2O和2％TIPS的试剂中裂解、脱保护后，用冷乙醚(国药)沉淀，用制备型C18反相高效液相色谱(HPLC)纯化至均一，并使用真空冷冻干燥机(冷肼：-80℃，真空计：1pa)将其制成冻干粉末，于-20℃保存备用。
实施例2
本实施例提供了手性止血多肽的合成及制备试验。
(1)以Rink Amide MBHA树脂为固相载体，称取树脂倒入反应器内，加入10mL DMF浸泡溶胀，上下翻转30min，抽干液体，用DMF，DCM交替洗涤二次，最后用DMF洗涤2次，每次30s。
(2)用含20％哌啶的DMF洗脱Fmoc 2次，分别为5min，10min。2次洗脱中间用DMF洗涤1次，洗涤30s，之后依次用DMF，DCM交替洗涤二次，最后用DMF洗涤2次，每次30s。将DMF溶解的第一个D型氨基酸经HBTU/HOBT、DIEA活化30s后，混合到树脂中，室温上下翻转反应30min。抽滤，用DMF，DCM交替洗涤二次，最后用DMF洗涤2次，每次30s。重复上一流程。按照式(Ⅰ)所示多肽结构式的氨基酸序列顺序从C端至N端依次反应即可得到含手性止血多肽的树脂。
(3)将反应完的树脂用甲醇和DCM依次洗涤4次，干燥树脂，将树脂转移到耐酸碱的20mL玻璃瓶中，瓶中含有17.6mL三氟乙酸,0.4mL Tips、1mL去离子水，0.7g苯酚的切割液，置于磁力搅拌器下，室温下搅拌反应2～3h，转速为550rpm。反应完成后，将切割液缓慢倒入装有冰乙醚的50mL离心管中，析出白色沉淀，离心弃上清(4度，4000rpm，3min)，乙醚洗涤3次。最后用50％乙腈水重悬，0.45μM滤膜过滤，液体收集在50mL离心管中，液氮速冻，获得多肽粗品。
(4)将冻干的多肽粗品溶于6M盐酸胍水溶液中，0.22μM滤膜过滤，使用制备反相C18液相色谱(HPLC)分离粗产物，试验结果如图1所示。在冷冻干燥机上冷冻干燥，得到所述手性止血多肽，多肽样品-20℃保存。
(5)收集液相主要峰产物进行电喷雾质谱鉴定，吸取20μL样品于进样瓶内插管，其中液相流速0.1mL/min，流动相为50％ACN(含千分之一甲酸)，运行时间1min；仪器参数脱溶剂气流量Desolvation(L/Hr)：350，锥孔气流量Cone(L/hr)：30，低质量分辨率LMResolution：15，高质量分辨率HM Resolution：15，离子能量lon Energy：0.3，细管电压Capilary(KV)：3.5，锥孔电压Cone(V)：30，脱溶剂气温度Desolvation Temp(℃)：350；m/z范围400～1600，电离模式ES+，运行时间1min。将装有样品的玻璃瓶放入样品盘中，在样品表界面(Sample list)命名样品，设置上样量为5μL以及样品的位置，在液相方法中加载方法，开启液相的泵，保存文件，运行样品列表。待程序结束后，在样品表中点击Chromatogram，导出质谱数据，试验结果如图2所示。对照质谱图中的质荷比m/z数据，计算(MW+Z)/Z是否与图谱中相应的质荷比接近，确定应用该方法制备的多肽分子量为MW：2759.04Da与如式(Ⅰ)所示化合物一致。
实施例3
本实施例提供了由手性止血多肽制备的凝胶试验。
称量0.5mg、10mg手性止血多肽粉末，溶于100mL的1mg/mL的CaCl2水溶液中，超声溶解，即可制备成体积分数为0.5％和10％的手性止血多肽凝胶。
各取30μL配置好的体积分数为0.5％和10％的手性止血多肽凝胶，稀释100倍，于280nm检测其吸光度值，其试验结果如表1所示。2种多肽的消光系数均为1790，其性能无较大差异。
表1，0.5％和10％的手性止血多肽凝胶吸光效果
多肽 体积分数 280nm吸光度 摩尔浓度(mol/L)
D 0.5％ 1.542 8.61
D 10％ 1.344 7.50
实施例4
本实施例提供了手性止血多肽凝胶体外凝血效果评价试验。
实验使用6～8周龄雄性大鼠，体重180～220g。大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，腹腔静脉取血。配制3.2％枸橼酸钠溶液，按全血:枸橼酸钠＝9:1的比例混合，制备成抗凝血液。实验分为空白对照组、明胶海绵组、手性止血多肽凝胶组。0.5％和10％的手性止血多肽凝胶的体外凝血效果无显著差异，示例性的本实施例中手性止血多肽凝胶组选择所用手性止血多肽凝胶的体积分数为10％。抗凝血液复钙后(抗凝血液:0.2M氯化钙＝9:1)缓慢滴在37℃中预热后的水凝胶的表面。将装有血样的培养皿在37℃下分别孵育0.5min、1.5min、2.5min、3.5min、4.5min、5min、5.5min和6min。在相应的时间点，轻轻加入1mL去离子水，在不干扰凝块的情况下释放游离血液，测试结果如图3所示。在542nm波长下测定上清液的吸光度，通过对数方程拟合半血凝时间(BCI50)分析凝血结果，测定结果如图4所示。
由图3可得，体外动态全血凝血实验显示，在0.5min检测手性止血多肽凝胶组较明胶海绵组和对照组启动凝血速度更加迅速，达到快速凝血效果，明胶海绵组在3.5min及对照组在4min与手性止血多肽凝胶0.5min的凝血效果相当。由图4可得，手性止血多肽凝胶组半凝血时间在17.1±0.54s，明胶海绵组半凝血时间在21.5±0.61s，对照组半凝血时间在42.3±0.93s。
实施例5
本实施例提供了手性止血多肽凝胶体内炎症反应评价试验。
实验使用6～8周龄雄性大鼠，体重180～220g。大鼠随机分成明胶海绵组和手性止血多肽凝胶组，每组3只。0.5％和10％的手性止血多肽凝胶的体内炎症反应无显著差异，示例性的本实施例中手性止血多肽凝胶组选择所用手性止血多肽凝胶的体积分数为10％。经戊巴比妥钠麻醉后，背部皮下填充25mm3的明胶海绵或注入50μL手性止血多肽凝胶，分别于1day、3day、7day后取皮肤组织进行HE染色，HE染色试验结果如图5所示；于1day后收集全血与血清，进行血常规及血清生化指标检测，检测结果如图6和图7所示。
由图5可得，皮下移植明胶海绵及手性止血多肽凝胶，术后1day、3day、7day HE染色显示，明胶海绵组和手性止血多肽凝胶组在移植后1day材料周围有明显炎性细胞浸润，但手性止血多肽凝胶组炎症相对较轻。进一步分析图5可得，术后3～7day明胶海绵组炎性细胞浸润仍然非常显著，而手性止血多肽凝胶组明显消退。由此表明手性止血多肽凝胶较临床用明胶海绵具有抑制炎症作用。
由图6可知，血常规检查结果显示明胶海绵组和手性止血多肽凝胶组整体无明显差别。由图7可知，血清生化检测结果提示明胶海绵组和手性止血多肽凝胶组肝功、肾功及心肌酶谱间无显著差异，该结果表明手性止血多肽凝胶和明胶海绵的生物安全性相识，生物相容性良好。
实施例6
本实施例提供了手性止血多肽凝胶体内止血及促进骨愈合再生评价试验。
实验使用6～8周龄雄性大鼠，体重180～220g。0.5％和10％的手性止血多肽凝胶的体内止血及促进骨愈合再生效果无显著差异，示例性的本实施例中手性止血多肽凝胶组选择所用手性止血多肽凝胶的体积分数为10％。大鼠随机分成空白对照组、明胶海绵组和手性止血多肽凝胶组，经戊巴比妥钠麻醉后，拔除上颌右侧切牙，明胶海绵组在拔牙窝填充10mm3的明胶海绵，手性止血多肽凝胶组迅速注入50μL手性止血多肽凝胶，空白对照组不做处理。待完全止血后，记录出血时间，记录结果如图8所示。一个月后，取大鼠上颌组织，经固定后，进行micro CT扫描，观察拔牙窝愈合情况，观察结果如图9所示。
由图8可得，拔除上颌右侧切牙，术后统计出血量和出血时间，结果显示手性止血多肽凝胶组较对照组和明胶海绵组止血时间显著缩短。
止血材料填充拔牙窝术后1个月，取上颌骨进行micro CT分析牙槽窝新骨再生情况。CT影像结果显示手性止血多肽凝胶组拔牙窝的新生骨较对照组和明胶海绵组显著升高(图9A)；对骨量相关指标分析显示骨体积(BV/TV)和骨小梁厚度(Tb.Th)显著升高、骨小梁数量(Tb.N)明显下降，骨小梁空间(Tb.sp)无明显变化(图9B～图9E)，表明手性止血多肽凝胶能显著促进牙槽窝骨再生功能，手性止血多肽凝胶能促进牙槽窝新生骨再生。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种手性止血多肽，其特征在于，所述一种手性止血多肽结构式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0003478383970000011
2.一种手性止血多肽的制备方法，其特征在于，包括：
树脂的活化：DMF浸泡溶胀树脂30min，去除液体后，采用DMF和DCM交替洗涤2次，然后用DMF洗涤2次，每次洗涤时间为30s。；
氨基酸的耦联：依照式(Ⅰ)所示多肽结构式的氨基酸序列，将D型氨基酸经HBTU/HOBT、DIEA活化后加入树脂，从C端至N端进行顺序反应得到含多肽的树脂；
多肽的切除和沉淀：将所述含多肽的树脂置于切割液中2～3h，经冰乙醚沉淀，50％乙腈水重悬，0.45μM滤膜过滤，得到多肽粗品；所述切割液以1mL去离子水计，包含1mL去离子水、17.6mL TFA、0.4mL Tips和0.7g苯酚；
多肽的分离纯化：将所述冻干的粗品多肽溶于6M盐酸胍水溶液中，使用制备反相C18液相色谱(HPLC)分离所述多肽粗品，收集主要峰产物。
3.一种凝胶，其特征在于，包含权利要求1所述手性止血多肽和钙离子溶液。
4.根据权利要求3所述凝胶，其特征在于，每100L的1g/L钙离子溶液与0.5～10g所述手性止血多肽混合。
5.权利要求3所述凝胶在制备止血材料中的应用。
6.权利要求3所述凝胶在制备促进骨再生材料中的应用。
7.一种止血材料，其特征在于，包含权利要求3所述止血凝胶。
8.一种止血组合物，其特征在于，包含权利要求3所述止血凝胶。
9.一种促进骨再生的组合物，其特征在于，包含权利要求3所述止血凝胶。
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