CN112043874B - 一种三相水凝胶及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种三相水凝胶及其制备方法，该方法包括：步骤1，将活化后的乳糖酸溶液加入到第一壳聚糖溶液中，进行反应，并对反应后的体系进行后处理，得到乳糖酸改性壳聚糖；步骤2，按照预设比例，将第二壳聚糖溶液、乳糖酸改性壳聚糖溶液以及甘油磷酸钠溶液在冰水浴下进行混合，并对混合后得到的混合体系进行冷藏处理，得到该三相水凝胶。通过本发明的方法制备的一种由乳糖酸改性壳聚糖/壳聚糖/甘油磷酸钠(CSLA/CS/GP)组成的新型三相水凝胶，具有温敏特性，有较好的机械强度、生物黏附性、良好的细胞相容性、无细胞毒性，不会抑制GES‑1细胞增殖，在酸性环境下对细胞有更好的保护作用等优点，可作为术中生物材料被用于提升病变和促进伤口修复。

Description

一种三相水凝胶及其制备方法
技术领域
本发明属于医药环境化工领域，特别是涉及一种三相水凝胶及其制备方法。
背景技术
内镜下粘膜剥离术(ESD)是一种常用的微创技术，因其简单、安全而被应用于早期胃肿瘤的切除。ESD程序的标准步骤一般包括：确定病变的范围和深度、标记病变边缘、粘膜下注射、粘膜切开、粘膜下剥离和伤口处理。为了便于病变组织的切除，通常采用粘膜下注射来建立垫层以抬高病变区域。然而，由于切除病变的深度至少达到粘膜下层，随着切除病变深度的增加，出血、穿孔等严重并发症的风险增加。另一种生物材料通常用于附着在创面上，促进创面修复。在ESD手术中，使用不同的生物材料来提升病灶并促进创面愈合，延长了手术时间，增加手术复杂性，这也可能增加不良事件的风险。降低风险的一种方法是开发一种既能抬高病变又能促进伤口修复的生物材料。
在ESD术中，粘膜下注射以提升病变部位是安全剥离的关键。生理盐水是最广泛使用的溶液，但它消散迅速，导致需要多次注射。最近，其他液体包括高渗盐水、透明质酸、葡萄糖水、甘油、羟丙基甲基纤维素、自体血液和纤维蛋白原混合物已经被用于粘膜下注射。
然而，上述解决方案都具有局限性。高渗盐水可通过渗透压梯度引起组织损伤和局部炎症反应。透明质酸价格昂贵、由于其高粘度难以注射，并且它可能刺激残留肿瘤组织的生长。使用高浓度葡萄糖水可能引起组织病理学损伤。注射甘油、高渗盐水和葡萄糖水后的坐垫高度在30分钟内降低到50％以下。羟丙基甲基纤维素可能引起抗原-抗体反应。自体血液和纤维蛋白原是增加感染风险的生物材料。另一方面，保护伤口不受腐蚀性胃环境的侵蚀和加速愈合对于防止ESD并发症是至关重要的，而电凝或止血夹等传统方法无法达到这一目的。
因此，在现有技术中的，所使用的生物材料还需要进行改进。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种三相水凝胶及其制备方法，其中，提供的三相水凝胶作为生物材料，不仅可以解决上述生物材料存在的问题，还可以达到提升病变和促进伤口修复的目的。
第一方面，本发明提供了一种三相水凝胶，所述三相水凝胶为由乳糖酸改性壳聚糖/壳聚糖/甘油磷酸钠组成的网状多孔结构的三相水凝胶体系；
所述乳糖酸改性壳聚糖是指：基于乳糖酸对壳聚糖进行改性，得到的所述乳糖酸改性壳聚糖；所述乳糖酸改性壳聚糖用于增强所述三相水凝胶体系的水凝胶前体溶液的水溶性；
所述三相水凝胶中，所述乳糖酸改性壳聚糖和所述壳聚糖的总浓度为1～3％，所述甘油磷酸钠的浓度为4～6％。
优选地，以所述乳糖酸改性壳聚糖和所述壳聚糖的总含量为基准，所述乳糖酸改性壳聚糖的含量为20％～80％。
优选地，所述三相水凝胶包括：去离子水、醋酸以及缓冲溶液。
优选地，所述缓冲溶液包括碳酸氢钠/碳酸钠缓冲溶液、磷酸氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液中的一种。
第二方面，本发明提供了一种三相水凝胶的制备方法，所述制备方法包括：
步骤1，将活化后的乳糖酸溶液加入到第一壳聚糖溶液中，进行反应，并对反应后的体系进行后处理，得到乳糖酸改性壳聚糖；
步骤2，按照预设比例，将第二壳聚糖溶液、乳糖酸改性壳聚糖溶液以及甘油磷酸钠溶液进行混合，并对混合后得到的混合体系进行冷藏处理，得到上述第一方面所述的三相水凝胶。
优选地，在所述步骤1中，所述活化后的乳糖酸溶液的制备步骤包括：
向所述乳糖酸溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺，进行酰胺反应，得到所述活化后的乳糖酸；
其中，所述乳糖酸溶液的质量浓度为2.22％；所述酰胺反应的pH为4～6。
优选地，在所述步骤1中，
所述第一壳聚糖溶液的质量浓度为2％；
所述反应的反应温度为室温，反应时间为15～36小时；
所述后处理包括：
向所述反应后的体系中加入乙醇，得到沉淀物；
将所述沉淀物溶解在去离子水中，得到溶解体系；
对所述溶解体系进行透析，并对所述透析后的溶解体系进行冷冻、干燥，得到所述乳糖酸改性壳聚糖；所述透析的时间为48～72小时。
优选地，在所述步骤2中，所述预设比例根据所述三相水凝胶中所述乳糖酸改性壳聚糖的含量确定；
所述第二壳聚糖溶液的质量浓度为3.33％；所述乳糖酸改性壳聚糖溶液的质量浓度为3.33％；所述甘油磷酸钠溶液的浓度为0.15g/ml；
所述冷藏的温度为-5℃～5℃。
优选地，所述第二壳聚糖溶液的配制方法为：按照质量浓度为3.33％的条件，将CS粉溶于1％醋酸中，配制得所述第二壳聚糖溶液；
所述乳糖酸改性壳聚糖溶液的配制方法为：按照质量浓度为3.33％的条件，将乳糖酸改性壳聚糖溶于去离子水中，配制得所述乳糖酸改性壳聚糖溶液；
所述甘油磷酸钠溶液的配制方法为：按照浓度为0.15g/ml的条件，通过去离子水溶解甘油磷酸钠，得到浓度为0.15g/ml的甘油磷酸钠溶液；将缓冲溶液加入所述浓度为0.15g/ml的甘油磷酸钠溶液中，混合均匀，并对混合后的体系进行冷藏保存，得到所述甘油磷酸钠溶液；其中，所述冷藏保存的温度为0℃～5℃。
本发明实施例提供了一种三相水凝胶及其制备方法，三相水凝胶为由乳糖酸改性壳聚糖/壳聚糖/甘油磷酸钠组成的三相水凝胶。与现有技术相比，本发明的三相水凝胶具有以下优点：
(1)本发明的三相水凝胶，由乳糖酸改性壳聚糖/壳聚糖/甘油磷酸钠(CSLA/CS/GP)组成，其中，CSLA结构中保留了一些氨基，进而保持了该三相水凝胶的温敏特性；并且，CSLA的加入也提高了三相水凝胶的机械强度和生物粘附性，同时使该三相水凝胶具有良好的细胞相容性。
(2)本发明的三相水凝胶中，由于CSLA的加入，使得水凝胶前体溶液的水溶性得到了明显提高，进而使三相水凝胶在ESD过程中可以通过导管注入。其中，水凝胶前体溶液是指水凝胶成胶前的溶液，本发明中，用乳糖酸提高壳聚糖水溶性就是为了提高水凝胶的前体溶液的水溶性，进而提高低温下流动性，实现更好的注射。
(3)本发明的三相水凝胶，采用的原料为壳聚糖、乳糖酸以及甘油磷酸钠，其中，乳糖酸改性壳聚糖和壳聚糖的总浓度为2％，甘油磷酸钠的浓度为6％，以该浓度制备的三相水凝胶具有无细胞毒性的特点，不抑制细胞增殖，在酸性环境下对细胞有更明显的保护作用。
(4)本发明的三相水凝胶是一种热敏水凝胶，其作为三相水凝胶，在内镜黏膜剥离过程中，既能提升病变，又能促进伤口修复。
(5)在本发明的三相水凝胶中，乳糖酸改性壳聚糖和壳聚糖的总浓度范围为1～3％，甘油磷酸钠的浓度范围为4～6％，相对于现有的凝胶，本发明的凝胶中甘油磷酸钠的含量最低可为4％，在确保该凝胶无细胞毒性、不抑制细胞增值、在酸性环境下对细胞有明显的保护作用的前提下，本发明实现了以4％的甘油磷酸钠制备的凝胶，同样具有与以6％的甘油磷酸钠制备的凝胶相同性质的特点，提高了在制备凝胶过程中甘油磷酸钠的可控性，避免了甘油磷酸钠所用量的局限性。
附图说明
图1示出了本发明实施例中的三相水凝胶在内镜下粘膜下层剥离术中提升病变并促进修复的示意图；
图2示出了本发明实施例中三相水凝胶的制备方法的方法流程图；
图3示出了本实施例中CSLA和CS的1H-NMR谱图；
图4示出了本实施例中CSLA和CS的红外光谱；
图5示出了本发明实施例中各组水凝胶初始凝胶化时间和温度；
图6示出了本发明实施例中各组水凝胶的成胶时间；
图7示出了本发明实施例中各组水凝胶在4℃时水凝胶溶液的粘度；
图8示出了本发明实施例中各组水凝胶的pH值；
图9示出了本发明实施例中各组水凝胶在频率为1、2、5Hz时的储能模量值；
图10示出了本发明实施例中各组水凝胶的SEM微观结构图；
图11示出了本发明实施例中各组水凝胶在冲洗后粘附于组织表面的水凝胶残留百分比；
图12示出了本发明实施例中各组水凝胶在组织表面凝胶化后对组织的粘附力；
图13示出了本发明实施例中水凝胶附着在猪胃组织表面；
图14示出了本发明实施例中通过25号针注入水凝胶前体溶液；
图15示出了本发明实施例中采用Transwell培养法研究水凝胶对GES-1细胞的保护作用；
图16示出了本发明实施例中L929细胞与各组水凝胶浸提培养24h的相对增殖率；
图17示出了本发明实施例中接种于各组水凝胶表面的GES-1细胞的吸光度；
图18示出了本发明实施例中酸性条件下(pH＝3)GES-1细胞的相对增殖率；
图19示出了本发明实施例中各组水凝胶表面吸附GES-1细胞的吸光度。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明人发现，在现有技术中，有一些新开发的具有止血和组织保护特性的三相水凝胶可以促进伤口愈合，如聚乳酸(PLA)、聚乙二醇膜和纤维蛋白胶，这些三相水凝胶可能是降低ESD并发症风险的选择。然而，这些三相水凝胶并不能在具有提升病变功能的同时，具有促进伤口的修复的功能。
基于此，本发明人提供一种能同时具有上述两种功能的三相水凝胶，即，乳糖酸改性壳聚糖/壳聚糖/甘油磷酸钠(CSLA/CS/GP)三相水凝胶。本发明提供的该三相水凝胶，具有易注射、生物相容性、无毒、强生物粘附、止血和组织修复的能力。
本发明提供的该三相水凝胶中，壳聚糖(CS)具有良好的生物相容性、生物降解性、生物粘附性、止血和抑菌性；乳糖酸(LA)具有抗氧化、生物降解、生物相容性和螯合特性。因此，在本发明实施例中，通过CS上的氨基和LA上的羧基进行酰胺反应得到了乳酸改性壳聚糖(CSLA)。
本发明中的CSLA保留了一些氨基，这有助于CS-GP水凝胶的温敏特性；进一步地，当CSLA与GP混合时，通过这些氨基可以保持其温敏特性，并且由于分子链的延伸，水凝胶的机械强度可以得到提高。在吸附理论中，生物粘附聚合物通过范德华力、氢键或疏水相互作用附着在组织表面。另一方面，本发明中的CSLA的酰胺键中含有大量的氢键，可以提高水凝胶的生物粘附性能。
在本发明的实施例中，发明人引入LA来提高CS的水溶性，提供了一种CSLA/CS/GP三相水凝胶。通过制备和测试六种不同比例的水凝胶，深入研究了CSLA的加入对凝胶物理化学和生物性能的影响及其机理，从而选择最佳的ESD三相水凝胶配方。在本发明的具体实施例过程如下：
第一方面，本发明实施例中的三相水凝胶，为由乳糖酸改性壳聚糖/壳聚糖/甘油磷酸钠组成的三相水凝胶。在该三相水凝胶中，乳糖酸改性壳聚糖和所述壳聚糖的总浓度为2％，甘油磷酸钠的浓度为6％。并且，以乳糖酸改性壳聚糖和壳聚糖的总含量为基准，乳糖酸改性壳聚糖的含量为20％～80％。另一方面，三相水凝胶还包括：去离子水、醋酸以及缓冲溶液，其中，缓冲溶液包括碳酸氢钠/碳酸钠缓冲溶液、磷酸氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液中的一种。
本发明实施例中的三相水凝胶，在内镜黏膜剥离过程中，能够提升病变并促进伤口修复，其提升病变并促进伤口修复的过程如图1所示。
第二方面，本发明实施例提供了本发明的三相水凝胶的制备方法，下面通过多个实施例对该制备方法进行详细阐述。
实施例1
首先，本实施例中所用的材料包括：壳聚糖(CS)(低分子量，DDA75-85％)和甘油磷酸二钠五水合物C3H7Na2O6P·5H2O(GP)购自Sigma-Aldrich(美国)。乳糖酸C12H22O12(LA)、N-羟基琥珀酰亚胺C4H5NO3(NHS)、碳二亚胺C8H17N3·HCl(EDC)购自上海阿拉丁生化技术有限公司。所有其他使用的化学品都是试剂级的，使用时没有进一步纯化。
本发明实施例提供了一种三相水凝胶的制备方法，如图2所示，该制备方法可以包括以下步骤：
步骤1(S21)，CSLA的制备：
将活化后的乳糖酸溶液加入到第一壳聚糖溶液中，进行反应，并对反应后的体系进行后处理，得到乳糖酸改性壳聚糖。
CSLA的合成：首先，分别制备了2％(w/v)壳聚糖溶液和2.22％(w/v)乳糖酸溶液；然后，在2.22％乳糖酸溶液中加入EDS和NHS，并将pH调至4-6之间的任意值，进行酰胺反应，实现对乳糖酸中羧基的活化；最后，将活化后的乳糖酸溶液与2％壳聚糖溶液进行混合，并在室温下反应24小时，反应结束后，向该反应体系中加入乙醇，使该反应体系中的物料沉淀，沉淀时间为24h，过滤得到沉淀物，再将沉淀物重新溶解在去离子水中，得到溶解体系，对溶解体系进行透析48h，并对透析后的溶解体系进行冷冻、干燥，则得到类似海绵的乳糖酸改性壳聚糖(CSLA)。
本实施例中，CSLA的合成过程如下：
Figure GDA0003162950730000081
CSLA的表征：为了鉴定CSLA，将5mg CSLA和5mg CS分别溶解在0.5mL氘代乙酸中，运行于600MHz的Bruker AV II记录1H NMR波谱。在室温下，进行红外光谱的检测，使用FTIR光谱仪(Nicolet FTIR 6700,USA)上的KBr磁盘记录FTIR光谱。该表征结果如下：
图3示出了本实施例中CSLA和CS的1H-NMR谱。如图2所示，壳聚糖(CS)的氨基对应的峰记录在3.02ppm的区域，当部分氨基与乳酸连接后，在3.02ppm区域的峰面积明显下降，这说明壳聚糖的氨基与乳酸的羧基发生反应，导致氨基减少。与CS相比，CSLA的1H-NMR谱中出现了酰胺峰(气相色谱＝2.75ppm)，表明成功引入了乳糖片段。
图4示出了本实施例中CSLA和CS的红外光谱。如图3所示，在CSLA的红外光谱中，1659cm-1,1560cm-1和1290cm-1的峰值分别对应于酰胺I、酰胺II和酰胺III。CSLA光谱在1591cm-1附近显示了一个宽频带，反映了壳聚糖和连接壳聚糖和乳酸低聚物的酰胺的游离氨基带的峰的重叠。酰胺I峰(1659cm-1)强度的增加表明壳聚糖与乳酸的反应导致酰胺化的增加。
步骤2(S22)，制备CSLA/CS/GP水凝胶：
按照预设比例，将第二壳聚糖溶液、乳糖酸改性壳聚糖溶液以及甘油磷酸钠溶液进行混合，并对混合后得到的混合体系进行冷藏处理，得到三相水凝胶。
本实施例中，第二壳聚糖溶液的质量浓度为3.33％，乳糖酸改性壳聚糖溶液的质量浓度为3.33％，甘油磷酸钠溶液的浓度为0.15g/ml，预设比例根据三相水凝胶中乳糖酸改性壳聚糖的含量确定；冷藏的温度为4℃。
具体实施时，第二壳聚糖溶液的配制方法为：按照质量浓度为3.33％的条件，将CS粉溶于1％醋酸中，配制得第二壳聚糖溶液；乳糖酸改性壳聚糖溶液的配制方法为：按照质量浓度为3.33％的条件，将乳糖酸改性壳聚糖溶于去离子水中，配制得乳糖酸改性壳聚糖溶液；甘油磷酸钠溶液的配制方法为：按照浓度为0.15g/ml的条件，通过去离子水溶解甘油磷酸钠，得到浓度为0.15g/ml的甘油磷酸钠溶液；将缓冲溶液加入浓度为0.15g/ml的甘油磷酸钠溶液中，混合均匀，并对混合后的体系进行冷藏保存，得到甘油磷酸钠溶液；其中，冷藏保存的温度为4℃。
具体实施时，将配制好的3.33％(w/v)第二壳聚糖溶液、3.33％(w/v)乳糖酸改性壳聚糖溶液以及浓度为0.15g/ml得甘油磷酸钠溶液，按照不同的体积比(具体体积比如下表1所示)，进行混合，并对混合后得到的混合体系进行冷藏处理，得到如下表1所示的6种不同CSLA含量的三相水凝胶。
表1.根据不同体积比配制得到的三相水凝胶
Figure GDA0003162950730000091
按表1制备各组水凝胶溶液。在最终三相体系中，CS、CSLA/CS和CSLA的终浓度各为2％，GP的终浓度为6％。各组在冰浴条件下制备，混合搅拌至完全混合。混合溶液保存于4℃。其中，20％CSLA/CS-GP是指：CSLA占CSLA/CS总体积的20％；40％CSLA/CS-GP是指：CSLA占CSLA/CS总体积的40％；60％CSLA/CS-GP是指：CSLA占CSLA/CS总体积的60％；80％CSLA/CS-GP是指：CSLA占CSLA/CS总体积的80％。
步骤3，CSLS/CS/GP三相水凝胶理化性质的表征：
步骤3-1，流变学性能
通过旋转流变仪(Anto Paar MCR-302，奥地利)测量本实施例制备的水凝胶的流变性能，测试几何形状为直径为40mm，间隙为1.0mm。动态应变扫描在400s内，扫描时剪切应变为1％，频率为1Hz。采用集成温度控制器，以0.2℃/s的速度将温度从4℃提高到37℃，并保持37℃。将初始凝胶时间和温度设定为储存模量(G’)等于损失模量(G”)。记录初始凝胶化时间和温度，所有实验重复三次。
本实施例中，6组水凝胶的流变学性能结果如图5所示，由图5可知，CSLA/CS/GP水凝胶保持了原有水凝胶的温敏特性，使其在低温下保持液态，在生理温度下变为凝胶。此外，CSLA的含量影响初始凝胶时间和温度。随着CSLA含量的增加，初始凝胶化温度从37℃下降到8℃。如图6所示，6个实验组凝胶化时间均在5min内，且含CSLA的凝胶化时间较短，尤其是当CSLA/CP中CSLA的百分比大于40％时。
步骤3-2，低温流动性和pH
水凝胶前体溶液在4℃时的粘度表明了水凝胶的低温流动性，通过旋转流变仪(Anto Paar MCR-302,Austria)测定。采用温度控制器将温度控制在4℃，保持剪切速率和剪切应力恒定。所有实验重复三次。
用pH计(BPH-303)测定每一凝胶水凝胶的pH值。所有实验重复三次。
本实施例中，6组水凝胶的低温流动性和pH值的结果如图7所示，水凝胶前体溶液的粘度决定了水凝胶的低温流动性。从图7可以看出，在4℃的低温条件下，随着CSLA的加入，水凝胶前体溶液的粘度显著降低，且CSLA浓度越高，水凝胶的粘度越低。CSLA的加入明显提高了水凝胶前体溶液的低温流动性，使得该水凝胶溶液在ESD手术中可以通过导管注入。如图14所示，使用25号针可以很容易地注射水凝胶前体溶液。
为了进一步研究制备的水凝胶的性质，测定了pH值。如图8所示，六个实验组的pH值均在生理可接受范围6.8-7.2。CSLA的加入提高了水凝胶的pH值。
步骤3-3，动态力学分析(DMA)
将6中三相水凝胶样品均制为圆柱形，直径8毫米，高度2毫米。所有样品在37℃的培养箱中放置30分钟直到完全凝胶化。水凝胶的储能模量(Φ8mmh2毫米)特点是在室温下,采用动态力学分析仪(DMA、TA-Q800、美国),以80毫米的振幅和测试频率的1、2和5赫兹。每个实验组准备3个平行样本。数据以三个独立实验的平均值±标准差(SD)表示(n＝3)，*p<0.05，*p<0.01。
图9示出了本发明实施例中6组水凝胶在频率为1、2、5Hz时的储存模量值；动态力学分析进行评估不同组的CSLA/CS/GP里水凝胶力学性能的影响，不同组的水凝胶的储能模量的结果值如图9所示。由图9可知，不同组的水凝胶的储能模量随着CSLA的增加而增加，CSLA的加入改善了水凝胶的强度；CSLA浓度越高，胶凝后的强度越高。
步骤3-4，微观形貌
用扫描电镜(SEM，日立S-4800，日本)观察了水凝胶的微观结构。将水凝胶在液氮中快速冷冻，在真空冷冻干燥机中冻干48h，将冻干后的样品切片，在离子溅射中涂上一层超薄金，然后用SEM观察切片表面的微观结构。
本实施例中，通过扫描电镜观察6组水凝胶的微观形貌。如图10所示，(A)表示的是CS-GP的微观形貌，(B)表示的是20％CSLA/CS-GP的微观形貌，(C)表示的是40％CSLA/CS-GP的微观形貌，(D)表示的是60％CSLA/CS-GP的微观形貌，(E)表示的是80％CSLA/CS-GP的微观形貌，(F)表示的是CSLA-GP的微观形貌。由图10可知，CSLA/CS-GP水凝胶的结构为多孔网络结构，CSLA的加入影响了水凝胶的微观结构。加入CSLA后，多孔结构的孔径更小，凝胶内部微观结构更加致密均匀。
步骤3-5，水凝胶的组织粘附力
用组织残留法测定了制备的凝胶的组织粘附性。取3只新鲜猪胃，用0.1mol/L盐酸溶液洗涤。切取胃组织面积(3cm×6cm)，用一张滤纸从组织表面吸水后将组织固定在一个斜槽内。然后，2ml(V1)水凝胶溶液从胃组织上缘缓慢均匀地倒出。2min后，用10ml(V2)蒸馏水以1ml/s的速度冲洗组织，收集液体测量体积(V3)。最后，计算每个样品在胃组织中粘附的水凝胶百分比为：
粘附比例％＝[(V1+V2-v3)/(V1+V2)]×100％
水凝胶的附着力用这种方法。将水凝胶平铺在30×20mm2厚1mm的胃组织上，制备双层标本。将另一个组织轻轻压在水凝胶的表面，然后置于37℃凝胶。然后用机械试验机撕裂试件，记录拉动时所需要的最大力。
图11示出了本发明实施例中各组水凝胶在冲洗后粘附于组织表面的水凝胶残留百分比，图12示出了本发明实施例中各组水凝胶在组织表面凝胶化后对组织的粘附力。
发明人通过测量水凝胶在冲洗后粘附在组织表面的数量来表征水凝胶对组织的粘附性。从图11中可以看出，CSLA浓度越高，水凝胶在表面的残留越少，说明水凝胶的粘附性越低。由图12可知，CSLA的加入增加了凝胶与组织之间的粘附，且CSLA浓度越高，凝胶后凝胶对组织表面的粘附越大。
步骤4，CSLS/CS/GP三相水凝胶的生物学性质：
步骤4-1，L929细胞毒性试验
用DMEM高糖完全培养基，浸出浓度0.1g/mL，孵育24h，用完全培养基稀释浸提液至50％和25％。取L929细胞，浓度为20000细胞/mL，在提取液中培养24h，取出提取液，加入10％CCK-8的新鲜无血清培养基1mL，37℃孵育3h。然后使用酶标仪(Multiskan FC,USA)在450nm处测量吸光度。
图16示出了本发明实施例中L929细胞与各组水凝胶浸提培养24h的相对增殖率，由图16可知，当浸提液浓度较低时，L929细胞的增殖更为明显。即使浸提液浓度为100％，6组水凝胶对L929细胞的相对增殖率均在70％以上。因此，本发明提供的水凝胶具有无毒的特点。
步骤4-2，Ges-1细胞增殖实验
本发明人使用GES-1细胞(人胃上皮细胞)评估凝胶存在下的细胞增殖情况。将细胞以2万细胞/mL的浓度接种于水凝胶中，用CCK8测定细胞生长第1、3、5天的增殖率。
图17示出了本发明实施例中接种于各组水凝胶表面的GES-1细胞的增殖率，由图17可知，6种水凝胶的细胞增殖没有差异，而CSLA浓度越高的水凝胶的细胞相容性越好。
步骤4-3，水凝胶对细胞的保护作用
通过Transwell培养实验研究水凝胶对GES-1细胞的保护作用(图15)。首先，在Transwell 12孔板的上室接种10000个细胞，下室加入1ml RPMI-1640完整培养基。细胞贴壁后，在上室室加入400ul水凝胶溶液覆盖细胞表面。水凝胶形成后，加入完全培养基，通过加入HCl将pH值修改为3。将水凝胶覆盖在GES-1细胞上，隔离酸性培养基。用CCK8测定细胞生长第1、3天的增殖率。
图18示出了本发明实施例中酸性条件下(pH＝3)GES-1细胞的相对增殖率，由图18可知，在低pH条件下，水凝胶对GES-1细胞有显著的保护作用。被水凝胶覆盖的细胞生长情况明显好于未被水凝胶覆盖的细胞。此外，CSLA的存在增强了水凝胶的细胞保护能力，特别是对于CSLA超过40％的凝胶。
步骤4-4，凝胶表面粘附GES-1细胞
为评估细胞粘附，将20000个GES-1细胞接种于水凝胶表面，培养12h后让细胞粘附。凝胶表面用介质以1ml/s的流速洗涤20s。然后将凝胶去除，用CCK8测定水凝胶表面维持的细胞数。
图19示出了本发明实施例中各组水凝胶表面吸附es-1细胞的吸光度表征，由图19可知，CSLA的加入显著提高了水凝胶的粘附性，其中以CSLA-GP水凝胶的粘附性最好。
采用统计分析法，对上述各步骤中所得的数据进行处理，进而得到上述各步中的结论，该统计分析法的具体操作为：从实验中获得的定量数据以均数±标准差(SD)表示，并使用SPSS 11.0(SPSS，芝加哥，IL,USA)进行分析。组间差异采用方差分析。*p<0.05组间差异有统计学意义，**p<0.01组间差异极显著。
基于上述实施例中各表征和检测结果，本发明人得出以下结论：
粘膜下注射和伤口处理在ESD手术过程中是至关重要的。临床医生通常使用粘膜下注射来提升病变区域以安全切除，并使用第二种生物材料来促进伤口修复以减少并发症。然而，使用两种不同的生物材料可能增加手术时间和操作复杂性，导致风险增加。因此，开发一种既能抬升病变区域又能促进创面修复的生物材料可以提高这一过程的安全性和效率。目前还没有一种材料能够同时满足两种功能，因此我们在之前的研究工作基础上对材料进行了改进。在本发明中，我们引入了乳糖酸来提高壳聚糖的水溶性，所得材料的1HNMR谱和FTIR谱显示，成功地将乳糖片段接枝到壳聚糖链中；然后，我们发明了一个新的CSLA/CS/GP三相水凝胶，并研究了水凝胶的理化性质和生物性能。
如上所述，CSLA/CS-GP水凝胶应该能够通过粘膜下注射和提起病变。根据所测得的流变特性(图5)，CSLA/CS/GP水凝胶具有温敏特性。CSLA/CS/GP水凝胶可能是通过CSLA链之间的氢键和疏水相互作用形成的，由于甘油部分的存在，疏水相互作用会随着温度的升高而增强。CSLA可以缩短水凝胶的凝胶时间(图6)，这可能反映了大分子之间的相互作用增加，减缓了分子链的运动，使其更容易形成稳定的结构。对低温流动性的测量(图7)表明，在4℃时，由于CSLA具有更好的水溶性，水凝胶前体溶液的粘度显著降低。该水凝胶溶液可以很容易地通过25号针头进行注射，这种针头广泛用于内镜操作中的粘膜下注射(图14)。这些结果表明，CSLA可以显著提高水凝胶的低温流动性，使水凝胶前体溶液适合于粘膜下注射。这与壳聚糖水溶性改性的预期目标是一致的。CSLA的加入可以稍微提高水凝胶的pH值(图8)，这可能会增强水凝胶的抗胃酸能力。水凝胶的强度对粘膜下垫层的高度和持续时间很重要，DMA结果(图9)显示，CSLA浓度越高，凝胶后的强度越高。这可能是因为CSLA分子链被引入乳糖区段延长了。从SEM结果(图10)可以看出，加入CSLA后水凝胶的多孔网络结构更加致密均匀，这也可以解释水凝胶强度增加的原因。以上结果表明，可以将CSLA/CS/GP水凝胶注射到黏膜下层，以抬高病变区域。
病变剥离后，为了使CSLA/CS/GP水凝胶附着在伤口上进行保护和修复，水凝胶需要生物粘附。我们对制备的水凝胶的组织黏附性进行了评估，结果表明，CSLA浓度越高，在表面残留的水凝胶就越少(图11)，通过加入CSLA，凝胶化后的水凝胶与组织表面的黏附力就越强(图12)。这并不矛盾，因为在本实验中，水凝胶溶液在室温下2分钟内可能无法完全凝胶化。由于CSLA可以显著提高水凝胶的低温流动性，因此CSLA含量越高的水凝胶越具有流动性。当水凝胶完全凝胶化时，对组织的生物粘附力增加。胶粘剂的性能与静电相互作用直接相关。粘接能力也与成膜性能良好有关，成膜性能随总分子量的增加而增加。CSLA通过引入乳糖片段来增加水凝胶的分子量，作用是增加凝胶后的附着力。水凝胶能很好地粘附在猪胃组织表面(图13)，表明CSLA修饰的水凝胶对组织的粘附性有所提高。改善水凝胶的组织黏附力可能对预防ESD术后并发症有较好的效果。
重要的是，CSLA/CS/GP温敏水凝胶不具有细胞毒性，也不抑制GES-1细胞的增殖(图16和图17)。此外，在酸性环境下，CSLA/CS/GP水凝胶对GES-1细胞具有明显的保护作用(图18)。一种解释可能是pH缓冲效应。CSLA/CS-GP水凝胶的pH值接近中性，CSLA可以稍微提高水凝胶的pH值，因此水凝胶中的羟基和氨基可以确保细胞周围较低的酸性环境。覆盖在GES-1细胞上的水凝胶可以起到保护作用，保证抵抗酸性溶液的流动。CSLA也显著提高了细胞黏附，其中CSLA-GP水凝胶的黏附性能最好(图19)。SEM结果表明，CSLA的加入使水凝胶的多孔网络结构更加致密均匀，增加了表面积，使细胞更容易附着在材料表面。这说明CSLA/CS/GP水凝胶具有良好的细胞相容性和明显的保护作用，是促进伤口修复的关键因素。
理想的术中生物材料应在低温下保持液体状态，并在注射到粘膜下区域后立即形成凝胶状态。但是80％CSLA/CS-GP水凝胶和CSLA-GP水凝胶的初始凝胶温度很低，在室温下可以形成凝胶。
综上所述，60％CSLA/CS-GP水凝胶具有较好的综合性能，即，适当比例的CSLA/CS-GP热敏水凝胶可以满足粘膜下注射和伤口治疗的大部分要求，是ESD中很有前景的提升病变和促进修复的术中生物材料。总的来说，结果表明，适当比例的CSLA/CS-GP热敏水凝胶可以作为术中生物材料，在ESD过程中提升病变并促进修复。该水凝胶还为消化系统的其他应用提供了策略，未来的研究将进一步优化该水凝胶的性能。
实施例2
在本发明施例中，CSLA的制备过程与实施例1中的方法相似，不同之处为：反应时间为15小时，透析时间为60小时，最后也得到了类似海绵的乳糖酸改性壳聚糖(CSLA)。
制备CSLA/CS/GP水凝胶的实施步骤包括：
第二壳聚糖溶液(3.33％CS溶液)的制备过程：将CS粉溶于1％醋酸中，室温搅拌3h至完全溶解，0℃保存，配制得3.33％(w/v)CS溶液。
乳糖酸改性壳聚糖溶液(3.33％(w/v)的CSLA溶液)的制备过程：将CSLA溶解在去离子水中，制备3.33％(w/v)CSLA溶液，储存于0℃的无菌环境中。
甘油磷酸钠溶液(0.15g/ml的GP溶液)的制备过程：用去离子水溶解甘油磷酸钠(GP)，浓度为0.15g/ml，再将碳酸氢钠(0.1g/ml)和碳酸钠(5mg/ml)溶解于该GP溶液中，混合均匀，并对混合后的体系进行冷藏保存，冷藏保存的温度为0℃。
实施例3
在本发明施例中，CSLA的制备过程与实施例1中的方法相似，不同之处为：反应时间为36小时，透析时间为72小时，最后也得到了类似海绵的乳糖酸改性壳聚糖(CSLA)。
制备CSLA/CS/GP水凝胶的实施步骤包括：
第二壳聚糖溶液(3.33％CS溶液)的制备过程：将CS粉溶于1％醋酸中，室温搅拌3h至完全溶解，5℃保存，配制得3.33％(w/v)CS溶液。
乳糖酸改性壳聚糖溶液(3.33％(w/v)的CSLA溶液)的制备过程：将CSLA溶解在去离子水中，制备3.33％(w/v)CSLA溶液，储存于5℃的无菌环境中。
甘油磷酸钠溶液(0.15g/ml的GP溶液)的制备过程：用去离子水溶解甘油磷酸钠(GP)，浓度为0.15g/ml，再将碳酸氢钠(0.1g/ml)和碳酸钠(5mg/ml)溶解于该GP溶液中，混合均匀，并对混合后的体系进行冷藏保存，冷藏保存的温度为5℃。
实施例4
本发明实施例中，采用与上述实施例1-3中任意一实施例的操作步骤，制备了乳糖酸改性壳聚糖和壳聚糖的总浓度为3％，甘油磷酸钠的浓度为6％的三相水凝胶。采用与上述实施例1中步骤3-步骤4相同的操作方式，对该三相水凝胶进行表征和检测，所得的数据结果与实施例1中的相同或相似，在本实施例中就不再重复列出。
实施例5
本发明实施例中，采用与上述实施例1-3中任意一实施例的操作步骤，制备了乳糖酸改性壳聚糖和壳聚糖的总浓度为1％，甘油磷酸钠的浓度为6％的三相水凝胶。采用与上述实施例1中步骤3-步骤4相同的操作方式，对该三相水凝胶进行表征和检测，所得的数据结果与实施例1中的相同或相似，在本实施例中就不再重复列出。
实施例6
本发明实施例中，采用与上述实施例1-3中任意一实施例的操作步骤，制备了乳糖酸改性壳聚糖和壳聚糖的总浓度为2％，甘油磷酸钠的浓度为5％的三相水凝胶。采用与上述实施例1中步骤3-步骤4相同的操作方式，对该三相水凝胶进行表征和检测，所得的数据结果与实施例1中的相同或相似，在本实施例中就不再重复列出。
实施例7
本发明实施例中，采用与上述实施例1-3中任意一实施例的操作步骤，制备了乳糖酸改性壳聚糖和壳聚糖的总浓度为2％，甘油磷酸钠的浓度为4％的三相水凝胶。采用与上述实施例1中步骤3-步骤4相同的操作方式，对该三相水凝胶进行表征和检测，所得的数据结果与实施例1中的相同或相似，在本实施例中就不再重复列出。
对于方法实施例，为了简单描述，故将其都表述为一系列的动作组合，但是本领域技术人员应该知悉，本发明并不受所描述的动作顺序的限制，因为依据本发明，某些步骤可以采用其他顺序或者同时进行。其次，本领域技术人员也应该知悉，说明书中所描述的实施例均属于优选实施例，所涉及的动作和部件并不一定是本发明所必须的。
以上对本发明所提供的一种三相水凝胶及其制备方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (9)

1.一种三相水凝胶，其特征在于，所述三相水凝胶为由水凝胶乳糖酸改性壳聚糖/壳聚糖/甘油磷酸钠组成的网络多孔结构的三相水凝胶；所述三相水凝胶具有抬升病变并促进伤口修复的功能；
所述乳糖酸改性壳聚糖是指：基于乳糖酸对壳聚糖进行改性，得到的所述乳糖酸改性壳聚糖；所述乳糖酸改性壳聚糖用于增强所述三相水凝胶的水凝胶前体溶液的水溶性。
2.根据权利要求1所述的三相水凝胶，其特征在于，以所述乳糖酸改性壳聚糖和所述壳聚糖的总含量为基准，所述乳糖酸改性壳聚糖的含量为20％～80％。
3.根据权利要求1所述的三相水凝胶，其特征在于，所述三相水凝胶包括：去离子水、醋酸以及缓冲溶液。
4.根据权利要求3所述的三相水凝胶，其特征在于，所述缓冲溶液包括碳酸氢钠/碳酸钠缓冲溶液、磷酸氢钠/磷酸氢二钠缓冲溶液中的一种。
5.一种三相水凝胶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
步骤1，将活化后的乳糖酸溶液加入到第一壳聚糖溶液中，进行反应，并对反应后的体系进行后处理，得到乳糖酸改性壳聚糖；
步骤2，按照预设比例，将第二壳聚糖溶液、乳糖酸改性壳聚糖溶液以及甘油磷酸钠溶液进行混合，并对混合后得到的混合体系进行冷藏处理，得到上述权利要求1-4中任意一项所述的三相水凝胶。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤1中，所述活化后的乳糖酸溶液的制备步骤包括：
向所述乳糖酸溶液中加入N-羟基琥珀酰亚胺和碳二亚胺，进行酰胺反应，得到所述活化后的乳糖酸；
其中，所述乳糖酸溶液的质量浓度为2.22％；所述酰胺反应的pH为4～6。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤1中，
所述第一壳聚糖溶液的质量浓度为2％；
所述反应的反应温度为室温，反应时间为15～36小时；
所述后处理包括：
向所述反应后的体系中加入乙醇，得到沉淀物；
将所述沉淀物溶解在去离子水中，得到溶解体系；
对所述溶解体系进行透析，并对所述透析后的溶解体系进行冷冻、干燥，得到所述乳糖酸改性壳聚糖；所述透析的时间为48～72小时。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述步骤2中，所述预设比例根据所述三相水凝胶中所述乳糖酸改性壳聚糖的含量确定；
所述第二壳聚糖溶液的质量浓度为3.33％；所述乳糖酸改性壳聚糖溶液的质量浓度为3.33％；所述甘油磷酸钠溶液的浓度为0.15g/ml；
所述冷藏的温度为-5℃～5℃。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第二壳聚糖溶液的配制方法为：按照质量浓度为3.33％的条件，将CS粉溶于1％醋酸中，配制得所述第二壳聚糖溶液；
所述乳糖酸改性壳聚糖溶液的配制方法为：按照质量浓度为3.33％的条件，将乳糖酸改性壳聚糖溶于去离子水中，配制得所述乳糖酸改性壳聚糖溶液；
所述甘油磷酸钠溶液的配制方法为：按照浓度为0.15g/ml的条件，通过去离子水溶解甘油磷酸钠，得到浓度为0.15g/ml的甘油磷酸钠溶液；将缓冲溶液加入所述浓度为0.15g/ml的甘油磷酸钠溶液中，混合均匀，并对混合后的体系进行冷藏保存，得到所述甘油磷酸钠溶液；其中，所述冷藏保存的温度为0℃～5℃。
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