CN103937014A

CN103937014A - 壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶及其制备方法

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Publication number: CN103937014A
Application number: CN201410141716.3A
Authority: CN
Inventors: 简军; 李睿智
Original assignee: BEIJING AIMEIKE BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: Limited by Share Ltd technology development
Priority date: 2014-04-10
Filing date: 2014-04-10
Publication date: 2014-07-23
Anticipated expiration: 2034-04-10
Also published as: CN103937014B

Abstract

本发明涉及一种壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶及其制备方法。它是以壳聚糖或壳聚糖的衍生物和甘油磷酸钠为原料，以及双醛类化合物或双环氧类化合物为交联剂制备而成；壳聚糖与甘油磷酸钠的质量比为1:0.5~10；交联剂与壳聚糖的质量比为0.01~1:1。将壳聚糖的盐酸水溶液在-1~5℃的环境下与甘油磷酸钠溶液均匀混合，得到pH=7-7.2的溶液，再与交联剂溶液在35-37℃下混合均匀。本发明在特定条件下可以快速地完成溶胶状态至凝胶状态的转变，该过程不可逆，转变时间可控。本发明具有反应条件简单，响应时间短，凝胶的热稳定性较好且机械强度较高，生物相容性好等优点。本发明应用于组织填充与修复，生物支架，抗瘢痕防粘连，生物胶，以及快速成型或三维打印材料等领域。

Description

壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶及其制备方法。将温度敏感型凝胶与化学交联方法并用，制备壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶。通过该方法，所得到的壳聚糖双网络快速响应型凝胶，在特定条件下可以快速地完成溶胶状态至凝胶状态的转变，该过程不可逆，转变时间可控。本发明具有反应条件简单，响应时间短，凝胶的热稳定性较好且机械强度较高，生物相容性好等优点。本发明涉及组织填充与修复，生物支架，抗瘢痕防粘连，生物胶，以及快速成型或三维打印材料等领域。

背景技术

壳聚糖(chitosan, CS)是甲壳素经脱乙酰化处理后的产物，即脱乙酰基甲壳素。壳聚糖是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖单体通过β-l,4-糖苷键连接起来的直链状高分子化合物。壳聚糖具有良好的生物相容性和生物降解性，无毒，物理和化学性质相对稳定，粘合性好，成纤成膜性优良，是一种可降解吸收的天然高分子材料。并且壳聚糖具有非常高的医用价值：壳聚糖可降低体内的胆固醇；还具有良好的抗菌效果，能够抑制细菌生长；壳聚糖可以吸附和排泄体内重金属；还有能预防高血压，提高人体免疫力等功效。研究表明溶菌酶（一种人体体液中含量较高的抗菌物质，泪液中的含量最多，大约占人体泪液蛋白含量的40 %），可以催化水解壳聚糖的 β-1,4-氨基葡萄糖苷键成为氨基葡萄糖，因此壳聚糖在体内可降解。此外，体内的活性氧簇自由基与甲壳素酶、葡萄糖酶、蛋白酶、脂酶、纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶等30多种酶制剂也可降解壳聚糖。酶对多糖的水解具有高度的选择性，而无其它副反应。因此，壳聚糖作为一种非常安全的天然高分子多糖，已经广泛的应用在生物医药，组织工程等领域。

壳聚糖温敏凝胶由壳聚糖与甘油磷酸钠(GP)组成。最初由Chenite等人于2000年发现并报道，其常温下为溶液，具有较好的流动性能，当环境温度上升至37℃的生理环境时，能在一定的时间内原位固化形成凝胶而丧失流动性能。其表现出温敏特性的主要原因是：在生理环境中，CS/GP体系能够发生相变的机理主要涉及的是一种亲水—疏水的过程。首先，CS分子呈现碱性，仅在酸性条件下通过其氨基与酸溶液中的氢离子结合而溶于水，在接近中性环境即会发生沉淀；另外，GP作为一种弱碱性物质，它的加入可使pH值略升高至7.0-7.3左右，同时其磷酸根与CS的氨基形成静电吸引而不至发生沉淀；然后，在温度升高的过程中，脱水作用使CS链间的聚合态被打破，使 CS链间形成多量氢键，完成CS/GP体系由液态向凝胶态的转变。但壳聚糖温敏凝胶的缺点在于响应时间较长，其在37℃生理环境下的固化时间不短于8分钟（吴广升等，牙体牙髓牙周病学杂志，2010, 20(11), 614）；且温敏凝胶的机械性能较差，是因为其凝胶网络的形成是依靠的是壳聚糖之间的氢键以及静电吸引等物理作用，并无化学键的交联。

而采用化学交联制得的壳聚糖凝胶，虽然机械强度较高，但反应时间过长，以经典交联剂戊二醛为例，其成胶时间不低于一小时（李湛勇等，离子交换与吸附，1999, 15(5), 425），成胶时间过长，不利于快速成型。

在本发明中得到的壳聚糖双网络快速响应型凝胶，集中了温敏凝胶与化学交联凝胶的优点，该双网络凝胶的第一层网络的形成依靠的是壳聚糖温敏凝胶中的静电吸引以及氢键的相互作用，而外加的化学交联剂所产生的化学键合作用则形成了凝胶的第二层网络，在双网络的共同作用下，凝胶的机械强度更强，而且成胶时间更短，可在120秒内迅速成胶，最短成胶时间可达30秒。增加壳聚糖溶液的浓度，增加交联剂戊二醛的用量以及提高反应温度均可以缩短成胶时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶及其制备方法。将温度敏感型凝胶与化学交联方法并用，制备壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶的工艺方法。该方法先将壳聚糖与甘油磷酸钠在低温下混合制得壳聚糖温敏凝胶，再用双组份注射器将壳聚糖温敏凝胶与化学交联剂水溶液混合推入至高温环境中，使其迅速地从溶胶转变为凝胶。通过该方法，所得到的壳聚糖双网络快速响应型凝胶，在特定条件下可以快速地完成溶胶状态至凝胶状态的转变，该过程不可逆，转变时间可控。本发明具有反应条件简单，响应时间短，凝胶的热稳定性较好且机械强度较高，生物相容性好等优点。本发明涉及组织填充与修复，生物支架，抗瘢痕防粘连，生物胶，以及快速成型或三维打印材料等领域。

本发明提供的一种壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶具有双重交联的网络结构，即本发明中的双网络凝胶是以壳聚糖或壳聚糖的衍生物和甘油磷酸钠为原料，以及双醛类化合物或双环氧类化合物为交联剂制备而成；壳聚糖与甘油磷酸钠的质量比为1:0.5~10，优选1:1；交联剂与壳聚糖的质量比为0.01~1:1，优选0.02:1；制备方法：将壳聚糖的盐酸水溶液在-1~5℃的环境下与甘油磷酸钠溶液均匀混合，得到pH=7-7.2的溶液，再与交联剂溶液在35-37℃下混合均匀。

所述的壳聚糖的脱乙酰度在65%~99%的范围以内；分子量范围在10kDa~3000kDa范围以内。

所述的壳聚糖的衍生物为羧甲基壳聚糖、季铵盐壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖等壳聚糖侧基改性的衍生物。对于壳聚糖的衍生物，其侧基的取代度为20%~80%。

本发明中的甘油磷酸钠，作为壳聚糖温敏凝胶的添加剂以及pH调节剂来使用，包括α-甘油磷酸钠与β-甘油磷酸钠，其中β-甘油磷酸钠为壳聚糖温敏凝胶的主要添加剂（其中β-甘油磷酸钠占甘油磷酸钠总质量的90%），α-甘油磷酸钠为辅助添加剂，甘油磷酸钠的纯度均不低于99%。

本发明中所采用的交联剂为水溶性的双醛类化合物：丁二醛、戊二醛等；以及水溶性的双环氧类化合物：1,4-丁二醇二缩水甘油醚、1,2,7,8-二环氧辛烷等。

本发明提供的一种壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶的制备方法包括以下几个步骤：

1）将壳聚糖溶解于0.01~1mol/L的盐酸溶液中，优选0.1mol/L，配置成0.5~10%（质量分数）的壳聚糖水溶液，优选6%，在-1~5℃的环境下滴加10~60%（质量分数）甘油磷酸钠溶液至pH至达到7-7.2，优选50%，其中在甘油磷酸钠的固体粉末中，β-甘油磷酸钠占70~100%（质量分数），优选90%。此溶液放入A管中作为A液4℃的环境下保存。

2）将交联剂（如戊二醛）溶解于水中，此溶液放入B管中作为B液保存。交联剂与壳聚糖的质量比为0.01~1:1，优选0.02:1。

3）将A管与B管安装在双组份注射器中，将A液与B液同时推入到35-37℃的水浴环境中，在60秒内混合均匀，使其快速从溶胶状态转变为凝胶状态。

本发明提供的一种壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶成胶过程的检测方法包括的步骤：

1）将A管与B管安装在双组份注射器中，将A液与B液同时推入到35-37℃的水浴环境中，在此过程中A液与B液已经在双组份注射器的针头中混合均匀，当混合液进入到水浴环境中时开始计时，通过倒置观察法检测凝胶的成胶过程，实验时将样品注入预热的试管中，并将试管置于水浴中恒温保持，观察时采取将试管导致的方法，若10秒内试管中样品无明显流动现象则确定凝胶成型，同时记录成胶时间。或

2）将A管与B管安装在双组份注射器中，将A液与B液同时推入到35-37℃恒温的锥板式旋转流变仪的检测平台上，在此过程中A液与B液已经在双组份注射器的针头中混合均匀，通过检测凝胶弹性模量G’与粘性模量G”随时间的变化值确定凝胶的成胶时间。其中旋转流变仪设定的应力应变值不超过20%，优选5%~10%，频率最优选择1Hz，对于非牛顿流体，设定剪切率为0.1s^-1。

本发明提供的壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶具有双重交联的网络结构，其中第一层网络的形成依靠的是壳聚糖温敏凝胶中的静电吸引以及氢键的相互作用，而外加的化学交联剂所产生的化学键合作用则形成了凝胶的第二层网络，在双网络的共同作用下，凝胶的机械强度更强，而且成胶时间更短，可在120秒内迅速成胶，最短成胶时间可达30秒。本发明所得到的壳聚糖双网络快速响应型凝胶，在特定条件下可以快速地完成溶胶状态至凝胶状态的转变，该过程不可逆，转变时间可控。本发明具有反应条件简单，响应时间短，凝胶的热稳定性较好且机械强度较高，生物相容性好等优点。本发明应用于组织填充与修复，生物支架，抗瘢痕防粘连，生物胶，以及快速成型或三维打印材料等领域。

附图说明

图1：壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶在反应过程中弹性模量与粘性模量随时间变化关系图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：凝胶的成胶方法与倒置法检测成胶时间

称取壳聚糖粉末3.0g（脱乙酰度96%，分子量100kDa），溶解于50mL 0.1mol/L的盐酸溶液中，得到质量分数为6%的壳聚糖溶液。取出9mL该溶液，于0℃的冰水浴中滴加1mL质量分数为50%的甘油磷酸钠溶液（其中β-甘油磷酸钠占甘油磷酸钠固体粉末的90%），滴加完全后，此时溶液pH值为7.2左右，溶液放置于4℃的环境下保存，此溶液作为A液。称取0.11g的戊二醛（与A液中壳聚糖的质量比为0.02:1）溶解于1mL的水中，此溶液作为B液。

将A液与B液分别对应地装入A管与B管中，其中A管最大装液量为10mL，B管的最大装液量为1mL，且A管与B管的长度相同。再将AB管安装在无菌双联混药包（上海米沙瓦医科工业有限公司，3mL）上，同时将A液与B液推入到37℃的水浴环境中，在此过程中A液与B液已经在双组份注射器的针头中混合均匀，当混合液进入到水浴环境中时开始计时，通过倒置观察法检测凝胶的成胶过程，实验时将样品注入预热的试管中，并将试管置于水浴中恒温保持，观察时采取将试管倒置的方法，若10秒内试管中样品无明显流动现象则确定凝胶成型，同时记录成胶时间。经倒置法检测，凝胶的成胶时间在60s左右。

实施例2：锥板式旋转流变仪检测成胶时间

将A液与B液分别对应地装入A管与B管中，其中A管最大装液量为10mL，B管的最大装液量为1mL，且A管与B管的长度相同。再将A管与B管安装在双组份注射器上，将A液与B液同时推入到37℃恒温的锥板式旋转流变仪（沃特斯中国有限公司DHR-1）的检测平台上，在此过程中A液与B液已经在双组份注射器的针头中混合均匀，通过检测凝胶弹性模量G’与粘性模量G”随时间的变化值确定凝胶的成胶时间。检测时固定应力应变值为10%，频率值为1Hz。检测结果详见说明书附图1，图：壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶在反应过程中弹性模量与粘性模量随时间变化关系图。

从图中可以看出，当混合液刚从双组份注射器中推出时呈液体状态，因此样品的粘性模量大于弹性模量；但随着温敏凝胶与化学交联的共同作用下，样品的弹性模量增长明显，在63s左右时，样品的弹性模量超过了粘性模量，说明样品已经完成了由溶胶至凝胶的一个转变过程，说明该凝胶的凝胶化响应时间为63s。而且在110s之内凝胶的弹性模量增长至3000Pa以上，5分钟时凝胶的弹性模量已经增长至50kPa左右，说明了该壳聚糖双网络快速响应型可注射水凝胶具有相当高的机械强度。

Claims

1.一种壳聚糖可注射水凝胶，其特征在于：它是以壳聚糖或壳聚糖的衍生物和甘油磷酸钠为原料，以及双醛类化合物或双环氧类化合物为交联剂制备而成；壳聚糖与甘油磷酸钠的质量比为1:0.5~10，优选1:1；交联剂与壳聚糖的质量比为0.01~1:1；制备方法：将壳聚糖的盐酸水溶液在-1~5℃的环境下与甘油磷酸钠溶液均匀混合，得到pH=7-7.2的溶液，再与交联剂溶液在35-37℃下混合均匀。

2.按照权利要求1中所述的壳聚糖可注射水凝胶，其特征在于：所述的壳聚糖与甘油磷酸钠的质量比为1:1；交联剂与壳聚糖的质量比为0.02:1。

3.按照权利要求1中所述的壳聚糖可注射水凝胶，其特征在于：所述的壳聚糖的脱乙酰度在65%~99%的范围以内；分子量范围在10kDa~3000kDa范围以内。

4.按照权利要求1中所述的壳聚糖可注射水凝胶，其特征在于：所述的壳聚糖的衍生物为羧甲基壳聚糖、季铵盐壳聚糖、羟丙基壳聚糖、羟丁基壳聚糖等壳聚糖侧基改性的衍生物，其侧基的取代度为20%~80%。

5.按照权利要求1中所述的壳聚糖可注射水凝胶，其特征在于：所述的甘油磷酸钠包括α-甘油磷酸钠与β-甘油磷酸钠，其中β-甘油磷酸钠占甘油磷酸钠总质量的70-100%。

6.按照权利要求1中所述的壳聚糖可注射水凝胶，其特征在于：所述的β-甘油磷酸钠占甘油磷酸钠总质量的90%。

7.按照权利要求1中所述的壳聚糖可注射水凝胶，其特征在于：所述的交联剂为丁二醛、戊二醛、1,4-丁二醇二缩水甘油醚或1,2,7,8-二环氧辛烷。

8.一种权利要求1中所述的壳聚糖可注射水凝胶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将壳聚糖溶解于0.01~1mol/L的盐酸溶液中，配置成质量分数为0.5~10%的壳聚糖水溶液，在-1~5℃下滴加质量分数10~60%的甘油磷酸钠溶液至pH至达到7-7.2，其中在甘油磷酸钠的固体粉末中，β-甘油磷酸钠占70~100%，此溶液放入A管中作为A液4℃的环境下保存；

2）将交联剂溶解于水中，此溶液放入B管中作为B液保存；交联剂与壳聚糖的质量比为0.01~1:1；

3）将A管与B管安装在双组份注射器中，将A液与B液同时推入到35-37℃的水浴环境中，混合均匀60-63秒，使其快速从溶胶状态转变为凝胶状态。

9.按照权利要求8中所述的制备方法，其特征在于所述的甘油磷酸钠的中β-甘油磷酸钠占90%。

10.按照权利要求8所述的制备方法，其特征在于所述的壳聚糖可注射水凝胶成胶过程的检测方法包括以下步骤：

1）将A管与B管安装在双组份注射器中，将A液与B液同时推入到35-37℃的水浴环境中，当混合液进入到水浴环境中时开始计时，通过倒置观察法检测凝胶的成胶过程，实验时将样品注入预热的试管中，并将试管置于水浴中恒温保持，观察时采取将试管导致的方法，若10秒内试管中样品无明显流动现象则确定凝胶成型，同时记录成胶时间；或

2）将A管与B管安装在双组份注射器中，将A液与B液同时推入到35-37℃恒温的锥板式旋转流变仪的检测平台上，在此过程中A液与B液已经在双组份注射器的针头中混合均匀，通过检测凝胶弹性模量G’与粘性模量G”随时间的变化值确定凝胶的成胶时间；其中旋转流变仪设定的应力应变值不超过20%，频率选择1Hz，对于非牛顿流体，设定剪切率为0.1s^-1。