CN1929849A - 包括含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物的内窥镜手术用粘膜膨胀液组合物 - Google Patents

包括含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物的内窥镜手术用粘膜膨胀液组合物 Download PDF

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CN1929849A CNA2004800383427A CN200480038342A CN1929849A CN 1929849 A CN1929849 A CN 1929849A CN A2004800383427 A CNA2004800383427 A CN A2004800383427A CN 200480038342 A CN200480038342 A CN 200480038342A CN 1929849 A CN1929849 A CN 1929849A
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林琢也
石原雅之
由良洋文
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KIYATSU AQUATIC PRODUCT CHEMICAL CO Ltd
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Abstract

本发明提供一种用于内窥镜手术的粘膜膨胀液组合物，其特征在于它包括含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物。将本发明的组合物用作内窥镜手术用的粘膜膨胀液时，可确保粘膜长时间隆起并防止穿孔，从而提高了内窥镜手术的可靠性。进一步，本发明组合物具有防止/抑制手术部分出血的效果。通过将光反应性基团引入上述含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物，可通过光交联容易地形成水凝胶，使保持隆起能力和止血能力进一步提高。

Description

包括含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物的内窥镜手术用 粘膜膨胀液组合物
技术领域
本发明涉及一种包括含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物的组合物。具体而言，涉及一种适合在EMR中局部注射到粘膜下，使包含病变部的粘膜膨胀的组合物。
背景技术
由于近来内窥镜技术的发展，病变部的内窥镜切除术已经适用于包括食道、胃和肠在内的消化道的息肉或早期癌(被认为没有淋巴结转移的表层癌)。虽然内窥镜粘膜切除术作为一种侵入性程度较低的手术方法，主要用于外科开腹手术困难的高龄者或具有严重并发症的患者等，但从QOL层面考虑，其已成为应用于普通患者的第一选择。
EMR一般包括下述手术：标记病变部及其周围区域、通过向包括标记的病变部的粘膜下层注射高渗食盐水溶液使病变部隆起，把持住要切除的部分并将其勒住，利用高频电流切开包括病变部的组织，并回收切开的组织进行组织检查(非专利文献1)。
为了在EMR中安全进行粘膜切开，必需使病变部与固有肌层分离。为此，将高渗食盐水溶液等液体(以下，在本文中称作“粘膜膨胀液(或局部注射液)”)局部注射到粘膜下层。如果包括病变部的粘膜隆起不充分，则难以在目标部位通过勒除进行切开，不能可靠地切除升高病变部，或存在于粘膜下的固有肌层也被切开而发生穿孔。因此，需要所需粘膜隆起水平可维持到切割完成的粘膜膨胀液。
此外，除穿孔外，在EMR中容易发生的其他并发症是出血。因此，通常向高渗食盐水溶液等中加入具有血管收缩作用的肾上腺素，以抑制出血量(非专利文献2)。但是，即使通过加入肾上腺素抑制了出血量，麻烦的止血操作却不可避免。此外，当使用食盐水溶液等低粘度液体作为粘膜膨胀液体时，有粘膜膨胀液体会通过局部注射针的进入部或切开的第一刀产生的间隙等漏出，而不能维持注射时的隆起水平的问题。
近来，为了解决上述问题，尝试将葡萄糖或透明质酸钠等加入粘膜膨胀液体中来维持隆起。据报道，在用猪食道进行的动物实验中，当使用透明质酸钠时，膨胀持续时间延长至平均23分钟左右(非专利文献3)。然而，在实践中，完成EMR所需的时间在1小时或以上，且有时需要数小时，因此，需要可进一步延长膨胀持续时间的粘膜膨胀液。而且，在正取代勒除法而成为主流的应用、IT刀等的切开剥离法(ESD)中，在切开第一刀时的膨胀液体的流出是不可避免的。此外，即使可通过加入透明质酸来延长膨胀持续时间至某种程度，但为了防止出血也需要另外添加肾上腺素等止血剂。
非专利文献1：林琢也等，“临床与研究”，第72卷，笫5号，第52-55页，1995年。
非专利文献2：《Endoscopic Surgery切开·剥离EMR》，小山恒男著，日本Medical Center发行，第30-31页，2003年。
非专利文献3：Massimo Conio等，Gastrointestinal Endoscopy，Vol.56，p513-516(2002)。
发明内容
本发明提供一种粘膜膨胀液体(局部注射液)，与现有的膨胀液相比，其可在更长时间保持粘膜隆起，并可防止穿孔，提高了EMR的可靠性。本发明还提供一种可有效防止手术中或手术后的出血的粘膜膨胀液体。
为了解决上述问题，本发明人进行了深入研究，结果发现，使用包括含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物的组合物作为内窥镜手术的粘膜膨胀液体，可极长时间地维持粘膜隆起，同时得到了防止和抑制出血的效果。
即，本发明提供一种用于内窥镜手术的粘膜膨胀液体(局部注射液)组合物，其特征在于，包括含有糖链的脱乙酰壳多糖衍生物。
发明效果
根据本发明的粘膜膨胀液组合物，由于含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物的粘性，可长时间(24小时或更长)保持粘膜隆起。而且，由于残留的脱乙酰壳多糖衍生物包围出血灶，还可明显减少出血量。结果，本发明可同时解决EMR治疗中的两个主要问题：穿孔和出血。
鉴于上述优点，可将本发明的组合物在例如大肠息肉(内窥镜的大肠息肉切除术)、腹腔镜下的胃切除术、食道动脉瘤的处理等将内窥镜或腹腔镜组合进行的远程手术中，可应用于除胃粘膜以外的消化道。因此，在本说明书中，术语内窥镜手术不限于包括EMR和ESD的胃粘膜切除术、还包括与内窥镜或腹腔镜结合进行的所有远程手术。
附图说明
图1是表示局部注射粘膜膨胀液体的粘膜周围组织横截面的简图。
图2是表示将含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物水溶液(a)和食盐水溶液(b)局部注射于粘膜下组织30分钟后，粘膜周围组织横截面的显微照片。
图3是表示将含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物(a)和食盐水溶液(b)局部注射到粘膜下层中，接着切割粘膜后，出血(失血)累积量的时间依赖性变化曲线图。
图4是表示局部注射(a)食盐水溶液和(b)透明质酸食盐水溶液(b)30分钟后，和局部注射含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物水溶液(c)并光照射24小时后粘膜周围组织横截面的显微照片。
图5是表示局部注射(a)食盐水溶液、(b)透明质酸水溶液、(c)含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物水溶液(无光交联)和(d)含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物水溶液(有光交联)后，接着切割粘膜后的出血量变化曲线图。符号注释
1：粘膜，2：病变部，3：粘膜膨胀液；4：固有肌层
具体实施方式
混合到本发明粘膜膨胀液中的含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物优选通过向脱乙酰壳多糖骨架中导入乳糖等糖链而使其在中性pH下的水溶性提高的脱乙酰壳多糖衍生物。例如，作为本发明中优选使用的含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物，例如国际专利公开WO00/27889小册子中记载的那些。具体而言，这些衍生物具有在通常被称作壳多糖/脱乙酰壳多糖的高分子骨架中导入了糖链和任选的光反应性基团而成的结构。其中，优选至少一部分构成脱乙酰化的壳多糖/脱乙酰壳多糖的葡糖胺单元的至少一部分2-位氨基导入具有还原性末端的糖链、并优选至少另外一部分2-位氨基导入光反应性基团所形成的脱乙酰壳多糖衍生物。
通常，壳多糖/脱乙酰壳多糖是通过碱处理来源于蟹壳的壳多糖(聚-N-乙酰基葡糖胺)而获得的脱乙酰化的酸可溶性部分，且通常具有下式(1)和(2)表示的构成单元：
[化1]
在壳多糖/脱乙酰壳多糖中，一些人将脱乙酰化程度低(通常低于40％)的那些称作“壳多糖”，将脱乙酰化程度高(通常40％或更高)的那些称作“脱乙酰壳多糖”，但在本说明书中，将至少一部分脱乙酰化的壳多糖/脱乙酰壳多糖总称为“脱乙酰壳多糖”。此外，在本发明中，脱乙酰壳多糖不限于天然来源的，还可以具有化学或基因工程合成的相似结构的化学修饰的糖链。
这里，“脱乙酰化程度”是指构成脱乙酰壳多糖(或聚-N-乙酰基葡糖胺)的糖单元2-位的乙酰氨基通过脱乙酰化转化成游离氨基的基团的比例。在本说明书中，脱乙酰化程度是利用《健康食品规格标准集(4)》，财团法人日本健康·营养食品协会(1996年)第55页中记载的“胶体滴定法”定量的。
本发明使用的含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物通过进一步化学修饰其脱乙酰壳多糖骨架而进行了功能化，且用作原料的脱乙酰壳多糖的脱乙酰化程度至少为40％，特优选在60-100％的范围，进一步优选在65-95％的范围。脱乙酰化程度为100％的脱乙酰壳多糖只包括上式(1)的构成单元，而不包括式(2)的构成单元。
此外，对脱乙酰壳多糖的分子量没有特别限制，可以根据脱乙酰壳多糖衍生物的最终使用目的，在很宽的范围变化，但通常数均分子量在5,000-2,000,000，优选在10,000-1,800,000，更优选在40,000-1,500,000的范围的合适的。
导入脱乙酰壳多糖骨架中的具有还原性末端的糖链包括，来自醛糖和酮糖的糖链，其中，优选使用构成糖单元个数为20个或以下，特别优选1-7个的那些。具体地，可列举例如戊糖或己糖如葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、赤藓糖、庚酮糖和己酮糖等；氨基糖如葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺和半乳糖胺等；糖衍生物如糖醛酸、脱氧糖等；由结合上述单糖而成的糖链构成的二糖或三糖如麦芽糖、异麦芽糖、乳糖、蜜二糖和麦芽三糖等；和各种寡糖等，其中中性二糖如麦芽糖、乳糖和蜜二糖等是优选的。
还可用聚醚、多元醇等有机化合物替代上述糖链而导入脱乙酰壳多糖，考虑到生物适合性等，优选使用天然糖链。
将糖链导入到脱乙酰壳多糖上式(1)的葡糖胺单元的2-位氨基本身可使用已知方法进行。包括例如，将糖的还原性末端羧基化，然后通过酰胺键与葡糖胺单元的2位氨基键合的方法(参照例如日本特开平10-120705号公报)，或将糖的还原性末端醛化或羰基化，然后通过利用Schiff碱的还原烷基化法将其与葡糖胺单元的2位氨基键合的方法(参照例如壳多糖/脱乙酰壳多糖研究会编《壳多糖/脱乙酰壳多糖的应用》53-56页，1990年2月20日，技法堂出版发行)等。
在本发明中，导入脱乙酰壳多糖骨架中的糖不仅限于一种，还可将2种或以上组合而导入。
构成本发明含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物的糖侧链的具体例子可列举下列糖链，但不限于这些。
(i)由乳糖衍生的糖链：
[化2]
Figure A20048003834200091
(ii)由麦芽糖衍生的糖链：
[化3]
(iii)由蜜二糖衍生的糖链：
[化4]
(iv)由纤维素二糖衍生的糖链：
[化5]
(v)由昆布二糖衍生的糖链：
[化6]
Figure A20048003834200101
(vi)由甘露二糖衍生的糖链：
[化7]
(vii)由N-乙酰基壳二糖衍生的糖链：
[化8]
在上述(i)-(vii)的糖侧链中，左侧记载的为利用糖的羧基与脱乙酰壳多糖的2位氨基的缩合而导入的残基，而右侧记载的为通过Schiff碱键合的残基。
这样，通过将脱乙酰壳多糖的葡糖胺单元的2位氨基用糖链取代，缓和了脱乙酰壳多糖依赖于酸的溶解性，实现了在中性区的溶解。
可根据最终脱乙酰壳多糖衍生物所需的物性等，改变糖侧链对脱乙酰壳多糖的葡糖胺单元的2位氨基的取代程度，但取代程度通常在0.1-80％的范围，特别优选在0.5-60％的范围，更优选在1-40％的范围。在此，糖侧链的“取代程度”是构成脱乙酰壳多糖的糖单元2位氨基被糖侧链取代的程度，以取代氨基相对于构成脱乙酰壳多糖的糖单元2位的游离氨基与取代氨基之和的比例表示。在本说明书中，糖侧链的取代程度是通过“苯酚-硫酸法”测定的，其中所述“苯酚-硫酸法”是检测糖链在硫酸中与苯酚反应所致的特征发色在490nm的吸光度(参照J.E.Hodge，B.T.Hofreiter，“Methods in Carbohydrate Chemistry”，ed.by R.L.Whistler，M.L.Wolfrom，vol.1，p.388，Academic Press，NewYork(1962))。
本发明使用的含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物优选构成脱乙酰壳多糖的上式(1)的葡糖胺单元的2-位氨基的至少一部分另外导入光反应性基团，由此使其具有光照射引发自交联性质。即，将其注射到粘膜下层后，通过紫外线等光照射形成不溶性水凝胶，从而进一步提高形状保持性(维持粘膜膨胀能力)。
用于化学修饰脱乙酰壳多糖骨架的光反应性基团包括通过紫外线，特别是包括约200-380nm的近紫外区的紫外线照射，该光反应性基团彼此和/或与脱乙酰壳多糖中存在的氨基或羟基等反应，形成交联键的基团。可列举例如由二苯酮、肉桂酸、叠氮化物、二烯和双-蒽这样的环状不饱和化合物等衍生的那些，其中优选具有羰基叠氮基、磺酰基叠氮基和芳香叠氮基的那些。
导入本发明含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物中的光反应性基团的具体例子可列举例如，为紫外线时，下式(A)-(D)表示的那些。式(A)的基团是由对叠氮基苯甲酸衍生的，式(B)的基团是由对叠氮基苯甲醛衍生的，式(C)的基团是由对苯甲酰基苯甲酸衍生的，式(D)的基团是由肉桂酸衍生的，式(E)的基团是由1-甲基-4-[2-甲酰基苯基]乙烯基]吡啶衍生的。
[化9]
Figure A20048003834200121
光反应性基团可以是通过用约400-500nm左右的可见光照射而反应的取代基。这种可见光反应性基团包括，例如如下式表示的且在Journal of Polymer Science：Polymer Chemistry Edition，Vol.20，1419-1432(1982)中记载的甲酰基苯乙烯基化合物等。
[化10]
(上式中，Ar表示吡啶、烷基吡啶盐、喹啉、烷基喹啉盐等杂环)
光反应性基团的导入本身可通过已知方法进行，可通过例如在缩合剂存在下，使具有羧基的叠氮化物与该2-位氨基键合的方法(参照日本特开平H10-120705号公报)；或通过酰氯基、醛基、N-羟基琥珀酰亚胺酯基或环氧基使叠氮化物与该2位氨基反应的方法(参照壳多糖/脱乙酰壳多糖研究会编《壳多糖/脱乙酰壳多糖的应用第》45-65页，1990年2月20日，技报堂出版发行)等方法进行。可通过使上述甲酰基苯乙烯基化合物的甲酰基与脱乙酰壳多糖的氨基偶联而顺利地导入。
可根据最终脱乙酰壳多糖衍生物中所需的基于交联反应的胶凝化(不溶性)程度等而改变这些光-反应性官能团的取代程度，但希望光反应性基团的取代程度在0.1％-80％，特别优选在0.5-50％，进一步优选在1-30％的范围内。这里，光反应性基团的“取代程度”是用光反应性感应基团取代构成脱乙酰壳多糖的糖单元2位氨基的程度，以取代氨基相对于构成脱乙酰壳多糖的糖单元2位游离氨基与取代氨基之和的比例。在本说明书中，光反应性基团如叠氮基的取代程度可根据由4-叠氮基苯甲酸在270nm的特征吸收获得的校正曲线确定。
对本发明脱乙酰壳多糖衍生物中糖侧链和光反应性基团总的取代程度没有特别限制，可在一个较大范围变化，但通常在0.2-80％的范围内，优选在1.5-65％的范围内，更优选在3-50％的范围内。
此外，对于本发明使用的含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物，可进一步将两亲基团导入构成脱乙酰壳多糖骨架的上述式(1)糖单元的2-位氨基、式(1)或(2)糖单元的3位或6位羟基的至少一部分，由此可使交联后的水凝胶的含水性大大提高。这些两亲基团是具有含疏水基团的疏水部分及含亲水基团的亲水部分的基团，且常具有表面活性剂功能。在这些中，优选使用疏水单元(X)与亲水部分(Y)的分子量比X∶Y＝1∶5-5∶1的那些，更优选使用没有解离性离子基团的非离子性基团。特别优选由疏水性烷基部分和亲水性聚氧化亚烷基部分构成的分子量至少为90或以上的、更优选为500-10,000的聚氧化亚烷基烷基醚。也可使用没有疏水部分的聚醚，考虑到提高含水性，优选同时具有疏水部分和亲水部分的聚氧化亚烷基烷基醚。
将所述两亲基团导入脱乙酰壳多糖中可通过下列方法进行：例如，将具有能够与氨基反应形成共价键的基团，如醛基或环氧基等的化合物导入两亲基团的亲水部分或疏水部分的任意一方的末端，然后与脱乙酰壳多糖的葡糖胺2位氨基反应的方法、在缩合剂存在下，具有羧基的聚氧化亚烷基烷基醚衍生物和脱乙酰壳多糖反应的方法、或具有酰氯基的聚氧化亚烷基烷基醚衍生物与脱乙酰壳多糖的羟基或氨基反应的方法。
例如，当把末端具有环氧基的聚氧化亚烷基烷基醚基或末端具有醛基的聚氧化亚烷基烷基醚基导入脱乙酰壳多糖的氨基时，键合于脱乙酰壳多糖的侧链由下式(a)或(b)表示。此外，当将末端具有酰氯基的聚氧化亚烷基烷基醚基与脱乙酰壳多糖的3位或6位羟基键合时，键合于脱乙酰壳多糖骨架的侧链由下式(c)表示。其中，在下式(a)-(c)中，n和m为1或以上的重复单元数。
[化11]
Figure A20048003834200141
    CH3-(CH2)n-O-(CH2CH2O)m-CH2-CONH-     (b)
    CH3-(CH2)n-O-(CH2CH2O)m-CH2-CO-CH2-  (c)
对在本发明脱乙酰壳多糖衍生物中导入两亲基团的程度没有特别限制，但根据导入后脱乙酰壳多糖衍生物的重量变化，通常在5-70％，优选在15-55％的范围内。
本发明的粘膜膨胀液组合物可通过将上述含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物溶解于生理上可接受的介质，如水或水-醇混合溶剂等中而制备为液体制剂。
通常，粘膜膨胀液体用23G左右的不锈钢针局部注射于粘膜下层。因此，必须可容易通过针注射。此外，粘膜膨胀液体优选具有足以抵抗因血流等导致的流散的粘度。此外，优选通过EMR或ESD切除粘膜后，保留于粘膜下层。鉴于这些条件，本发明的组合物含有0.5-8.0重量％，优选1.0-5.0重量％，更优选2.0-3.0重量％，最优选约2.5重量％含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物(分子量为1,000,000左右)。使用例如市售的旋转粘度计(例如B型粘度计，TOKIMEC INC.(Tokyo，Japan))测定可知，以这样的比例制备的膨胀液体具有约300cps(mPa·s)或更小，进一步约200cps或更小，或约100cps或更小的低粘度。
通过引入糖链，本发明优选使用的含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物在中性区的水溶性好，可通过生理缓冲液等进行制剂，且可在不使药物，例如蛋白质等因酸或碱变性失活的情况下添加。
例如，本发明的组合物本身具有足够的止血作用，但也可配合肾上腺素等具有止血作用的其他药物使止血能力进一步提高，也可添加抗癌剂而使其具有促进治愈(或防止复发)作用。
此外，当使用导入光反应性基团的含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物时，将制造的膨胀液注射粘膜下层后，通过光照射，其立即形成不溶性凝胶，粘膜膨胀可维持出乎意料的、很长一段时间。此外，通过光交联形成的水凝胶可用作使配合的药物等缓释的基质。
光交联的条件可根据下述条件而变化，即导入所用光交联性脱乙酰壳多糖衍生物中的光反应性基团的种类和取代程度、溶解于组合物中的脱乙酰壳多糖衍生物的量、注射的组合物的量以及所需硬度等。通常，当使用30μl左右含约2.5mg/ml左右可光交联性的脱乙酰壳多糖衍生物的组合物时，用距离约2cm左右的光源的光照射约0.01-100秒，优选约0.02-60秒，更优选约0.1-30秒，最优选数秒左右，由此形成具有足够硬度的凝胶。对交联反应程度没有特别限制，通常，有交联反应程度越高，所形成的水凝胶越硬的倾向。
光照射可以在注射本发明的膨胀液体组合物之后，切割病变部之前进行，也可在切开病变部之后，对暴露的组合物进行照射，使其凝胶化。在前者的情况下，可通过与注射膨胀液的针一体化的或单独的光纤照射光而使组合物胶凝化。在后者的情况下，通过导入内窥镜的管道的光纤照射暴露的组合物。
由于物理化学引发，使局部注射的膨胀液体具有不溶化(固体化)的性质(例如光交联性)，通过注射后使其不溶化(固体化)从而提高在组织内的置留性的概念目前还未提出，是由本发明首次完成的。
我们发现本发明的组合物在不用光照射的状态也具有抑制出血的效果。认为这是源自组合物的粘性和脱乙酰壳多糖的特性。另外，通过光照射形成的水凝胶显示更好的止血效果。例如，在因肝素而使得正常止血变得困难的情况下，出血在10分钟以内停止。这意味着本发明的组合物，在不使用肾上腺素等止血剂时，在EMR中的抑制和防止出血的效果也很好。
此外，当引入了两亲基团如聚氧化亚烷基烷基醚等时，光交联的水凝胶的吸水性明显提高(自身重量的100倍左右)，因此，其可吸收由伤口流出的血液，从而加速止血及愈合。
本发明的膨胀液组合物优选以高压釜灭菌的溶液形态提供。高压釜灭菌也称作高压蒸汽灭菌，是一种使用具有规定温度和压力的饱和水蒸汽加热的灭菌方法。例如，在《日本药局方》中，列举了115℃下30分钟、121℃下20分钟和126℃下15分钟的灭菌条件。
本发明的组合物在以填充在容器中的溶液的状态进行高压釜灭菌时，它的性能不会变差，但粘度降低，由此提高了作为内窥镜手术用膨胀液的使用性。例如，即使在含有具有光反应性基团的脱乙酰壳多糖衍生物时，也未发现光反应性基团由于高压釜灭菌而变性，且通过光照射而良好地凝胶化。因此，本发明的粘膜膨胀液体可以以现成的灭菌溶液的状态提供。
下面，通过具体例更详细说明本发明。但这些具体例不限定本发明的范围。
实施例
(实施例1)
光交联性含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物的制备
按照WO00/27889所述方法合成光交联性含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物(称作“Az-CH-LA”)。具体而言，使用具有300-600kDa分子量、80％脱乙酰化程度的脱乙酰壳多糖(烧津水产化学工业(株)制)作为原料。通过与氨基的缩合作用将叠氮化物(对叠氮基苯甲酸)和乳糖(乳糖酸)导入上述脱乙酰壳多糖分子。所得脱乙酰壳多糖衍生物氨基的2.5％和2％分别被对叠氮基苯甲酸和乳糖酸取代。由于导入乳糖，所得衍生物在中性pH下是水溶性的。
制备Az-CH-LA的水溶液(20-30mg/ml)。用距离2cm的灯照射UV约10秒(UV-照射系统：Spot Cure ML-251C/A，with a guide fiber unit(SF-101BQ)和250W灯(240-380nm)；Ushlo Electrics Co.Ltd.)，通过光交联反应，形成不溶性的水凝胶。
(实施例2)
粘膜下层厚度的测量
实验使用Sprague-Dawley大鼠(15-18周，均为雄性，平均体重325±15g；SLC Japan)。整夜禁食后，用戊巴比妥(25mg/kg)麻醉大鼠，并在开腹手术后通过胃前壁造口术使腺胃粘膜暴露出来。通过25G不锈钢针将2.5％的Az-CH-LA水溶液(0.3ml)或食盐水溶液(0.3ml)注射到后壁粘膜下层中。注射后，观察粘膜表面30分钟，且通过施与过量麻醉剂处死每组各5只大鼠。对于其它大鼠，处理30分钟后，将10ml生理食盐水注射至皮下以防止干燥，并缝合胃部和腹部。在6小时(各组n＝5)和24小时后(各组n＝5)处死这些大鼠。然后，取出组织并在10％福尔马林中固定2天。之后，通过显微镜观察固定样品的横截面来测量粘膜下层的厚度。并将样品用石蜡包埋、切片，并用苏木精-曙红(HE)试剂染色。
注射Az-CH-LA和食盐水溶液后，粘膜表面同程度地隆起。但30分钟后，注射Az-CH-LA的组隆起区域显示与刚注射后同样的大超度起伏，但注射食盐水溶液的组30分钟内起伏显著收缩(图2)。经过规定时间后的粘膜下层厚度如表1所示。表1的结果以平均值±S.E.表示，并使用显著性水平为P＜0.05的Mann-Whitney U-检测分析数据。
表1
  30min   6h   24h
  Az-CH-LA-注射组   3.8±0.1   4.0±0.1   4.1±0.1
  盐水注射组   2.0±0.2   1.9±0.3   1.8±0.3
数值是平均值±S.E.(mm)(各组n＝5)
在24小时内的任意时间点，注射Az-CH-La的粘膜下层明显比注射食盐水溶液的那些厚。由注射食盐水溶液组厚度在30分钟后没有变化、说明30分钟内所有食盐水溶液都流出了。组织学试验表明Az-CH-LA，被曙红均匀染色的A2-CH-La保留在粘膜下组织中。
(实施例3)
出血量的测量
在用与实施例2同样的方法注射2.5％Az-CH-LA水溶液或食盐水溶液之前，静脉注射肝素(300单元)。用外科手术刀切开粘膜膨胀区域顶点周围的粘膜(直径5-6mm)。在Az-CH-La组中，使用上述UV-照射系统立即向切开的伤口照射UV光30秒(各组n＝10)。使用手术棉签吸收从各大鼠胃部流出的血液，并根据棉签重量的增加评价出血体积(各组n＝10)。出血量每5分钟测量4次，然后通过过量施与麻醉剂处死动物。切除胃部进行组织学试验。将取出的组织用10％福尔马林固定2天，用石蜡包埋，切片，并用苏木精-曙红(HE)试剂染色。
在注射Az-CH-LA的组中，从切开的粘膜边缘或粘膜边缘与Az-CH-LA之间的空隙观察到出血(照射前)。但是UV照射5-10分钟后，出血完全停止，形成的凝胶起到堵塞开口部的浆糊的作用。在注射食盐水溶液的组中，切开后经过20分钟仍在出血。
注射Az-CH-LA组的粘膜切开后前5分钟的血液损失为63.1±14.2mg，与此相对，注射食盐水溶液组为922.9±143.6mg(P＜0.01)(图3)。注射Az-CH-LA组的累积体积在10分钟时为93.2±10.5mg，15分钟时为106.4±15.2mg，20分钟时为113.0±15.5mg。注射食盐水溶液组的相应值分别为1268.0±105.5mg、1537.2±125.4mg、1682.3±95.2mg。将这些值(血液损失)对时间作图，如图3所示。注射Az-CH-LA组的血液损失明显少于注射食盐水溶液的组。样品组织学观察表明在注射Az-CH-LA组中，出血灶被脱乙酰壳多糖水凝胶完全包围。
(实施例4)
使用配合透明质酸钠的膨胀液进行与实施例2和3相同的测量。将其结果与实施例2和3的结果一起示于图4和5。如图4所示，即使使用含透明质酸的膨胀液的情况(b)，注射30分钟后已经观察到粘膜隆起缩小，而在使用本发明膨胀液的情况(c)中，24小时后仍然保持明显的隆起形状。此外，使用本发明的膨胀液时获得了极佳的出血抑制效果(图5)。
(实施例5)
高压釜灭菌导致的组合物粘度变化
制备市售的Az-CH-LA(通过GPC测定的分子量约为10,000)的水溶液(浓度：0.5重量％和1.0重量％的2种)。将这些溶液填充到15ml锥形试管中(FALCON公司制)，在下列条件下，进行高压釜灭菌。
(1)121℃×20分钟。
(2)118℃×30分钟。
将灭菌后的各水溶液与未处理的水溶液比较，发现在所有溶液中均没有观察到沉淀，观察到轻微可见程度的着色(淡黄色)。
使用单圆筒型旋转粘度计，测定未处理和灭菌后水溶液的粘度，结果在下列表2中给出。
表2
  灭菌条件   粘度(mPa·s)
  Az-CH-La浓度：0.5重量％   Az-CH-La浓度：1.0重量％
  没有灭菌   32.8   284.0
  121℃×20min.   12.8   46.0
  118℃×30min.   14.0   51.0
由上述结果可知，通过高压釜灭菌，水溶液的粘度显著降低，从而使其更适于局部注射。
此外，通过UV光谱测定和FT-IR测定算出来处理和灭菌后样品的叠氮基的量。结果，在灭菌后未观察到光反应性基团(叠氮基)分解，且残存有与未处理样品相同含量的叠氮基。
此外，当对各样品进行光照射使其固化时，所有样品均可良好地胶凝化。
产业实用性
用于本发明粘膜膨胀液组合物中的含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物，以及通过光交联得到的水凝胶在对人皮肤成纤维细胞、人上皮细胞和人平滑肌细胞的培养试验中未显示任何细胞毒性。此外，针对生物的毒性试验，包括诱变性和细胞毒性的那些，已经证实了脱乙酰壳多糖衍生物及其水凝胶的安全性。因此，本发明的组合物特别适合作为EMR或ECD等内窥镜手术如中使用的粘膜膨胀液体(局部注射液)。
此外，由于使用高压釜灭菌，可以提供在手术现场直接使用的产品。
此外，除了内窥镜手术，在切除组织表层的癌肿瘤或止血等普通的外科处理中，当然也可使用本发明的膨胀液。

Claims (10)

1.一种内窥镜手术用粘膜膨胀液组合物，其包括含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，它包括0.5-8.0重量％含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物。
3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，该含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物是通过将具有还原性末端的糖链导入至少一部分壳多糖/脱乙酰壳多糖的葡糖胺单元2-位氨基形成的高分子，所述壳多糖/脱乙酰壳多糖含下式(I)表示的葡糖胺单元
[化1]
4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，该含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物是通过将具有还原性末端的糖链导入壳多糖/脱乙酰壳多糖的葡糖胺单元的至少一部分2-位氨基，并将光反应性基团导入至少另一部分2-位氨基而成的高分子：
[化2]
Figure A2004800383420002C2
5.根据权利要求3或4所述的组合物，其特征在于，该糖链选自包括葡萄糖、果糖、半乳糖、岩藻糖、甘露糖、阿拉伯糖、木糖、赤藓糖、庚酮糖和己酮糖等戊糖或己糖在内的糖类；包括葡糖胺、N-乙酰基葡糖胺和半乳糖胺的氨基糖类；包括糖醛酸和脱氧糖的糖衍生物；由这些单糖组合而成的糖链构成的包括麦芽糖、异麦芽糖、乳糖、蜜二糖和麦芽三糖的二糖或三糖，和低聚糖。
6.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，该光反应性基团选自羰基叠氮基、磺酰基叠氮基、芳香叠氮基、和甲酰基苯乙烯基。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的组合物，其特征在于，该含糖链的脱乙酰壳多糖衍生物还含有两亲基团。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的组合物，其特征在于，其用高压釜灭菌。
9.一种内窥镜系统，其特征在于，其具有将权利要求1-8中任意一项所述的组合物局部注射到靶部位的装置。
10.根据权利要求9所述的内窥镜系统，其还具有对局部注射的组合物进行光照射的装置。
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