CN113398004A - 大鲵肽-玻尿酸混合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于复合物技术领域，特别是涉及一种大鲵肽‑玻尿酸混合物及其制备方法和应用。本发明提供了一种大鲵肽‑玻尿酸混合物，所述大鲵肽‑玻尿酸混合物包括大鲵活性肽‑玻尿酸复合物A和大鲵肽‑玻尿酸复合物B。本发明提供的大鲵肽‑玻尿酸混合物是通过特定的大鲵活性肽和特定分子量的玻尿酸制备得到的。经由实施例可知，本发明提供的大鲵肽‑玻尿酸复合物相较于单独使用大鲵活性肽、玻尿酸或JYDB‑5多肽，具有显著的提高模型小鼠皮肤中胶原蛋白含量的技术效果；还能够提高经由紫外线照射后人皮肤成纤维细胞的成活率；并有效提升人皮肤角质层的含水量。

Description

大鲵肽-玻尿酸混合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于复合物技术领域，特别是涉及大鲵肽-玻尿酸混合物及其制备方法和应用。

背景技术

人的皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成。真皮由胶原纤维、弹力纤维、基质、细胞成分、皮肤附属器及血管、神经组成。纤维母细胞的代谢作用是维持真皮层胶原纤维、弹力纤维数量和质量的关键，也是皮肤皱纹发生的关键内在因素。

在皮肤衰老过程中，最显著的现象就是皮肤变薄、失去弹性、皮肤松弛、皱纹增多等。皮肤老化主要是由遗传因素和紫外线照射引起的，也就是机体的内在因素和外界的环境因素。皮肤皱纹的产生是由于皮肤表皮层不均一的塌陷引起的。皮肤填充术是治疗皮肤皱纹的主要手段。目前，医学美容界多采用玻尿酸、胶原蛋白及自体脂肪源性干细胞等填充手段进行治疗，但是存在注射后患者组织出现再次塌陷的情况，并且效果并不理想。其他号称具有抗衰老的活性物质效果有限，因此，现有市场亟需一种可以从根本上改变皮肤的质地，对皱纹有预防作用，对人纤维母细胞的代谢具有促进作用的活性物质。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了大鲵肽-玻尿酸混合物及其制备方法和应用。本发明提供的大鲵肽-玻尿酸混合物具有能够提高人皮肤成纤维细胞的成活率、提高皮肤中胶原蛋白的含量和提高皮肤角质层含水量的技术效果。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种大鲵肽-玻尿酸混合物，所述大鲵肽-玻尿酸混合物包括大鲵活性肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B；

所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物A包括大鲵活性肽A和玻尿酸；所述大鲵活性肽A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物B包括大鲵活性肽B和玻尿酸；所述大鲵活性肽B的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述玻尿酸的分子量为42.5～145kDa；

所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B的质量比为1:2。

本发明还提供了上述大鲵肽-玻尿酸混合物的制备方法，包括以下步骤：

将大鲵活性肽混合物的溶液与玻尿酸混合，得到混合液；

将浓度为0.15mol/L的氯化锌水溶液加入混合液中得到混合物，在所述加入的过程中，检测混合物中钠离子的浓度；当混合物中钠离子的浓度不再变化后，停止加入氯化锌水溶液，得到大鲵肽-玻尿酸混合物；

或者包括以下步骤：

将大鲵活性肽A溶液或大鲵活性肽B溶液分别与玻尿酸混合，得到对应的混合液；

将浓度为0.15mol/L的氯化锌水溶液分别加入对应的混合液中得到对应的混合物；当对应的混合物中钠离子的浓度不再变化后，停止加入氯化锌水溶液，得到大鲵肽-玻尿酸复合物A或大鲵肽-玻尿酸复合物B；将所述大鲵肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B混合，得到大鲵肽-玻尿酸混合物。

优选的，所述大鲵活性肽混合物的溶液的pH值为5.00～7.00。

优选的，所述大鲵活性肽混合物的溶液中，大鲵活性肽混合物的质量浓度为1％～10％。

优选的，所述大鲵活性肽混合物的溶液和玻尿酸的质量比为(1～8):1。

本发明提供了上述大鲵肽-玻尿酸混合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备抗皱效果产品中的应用。

本发明提供了上述大鲵肽-玻尿酸混合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备提高皮肤中胶原蛋白含量产品中的应用。

本发明提供了上述大鲵肽-玻尿酸混合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备预防和/或修复紫外线对人皮肤成纤维细胞的伤害产品中的应用。

本发明提供了上述大鲵肽-玻尿酸混合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备提高皮肤角质层含水量产品中的应用。

本发明提供了一种大鲵肽-玻尿酸混合物，所述大鲵肽-玻尿酸混合物包括大鲵活性肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B；所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物A包括大鲵活性肽A和玻尿酸；所述大鲵活性肽A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物B包括大鲵活性肽B和玻尿酸；所述大鲵活性肽B的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明提供的大鲵肽-玻尿酸混合物通过特定氨基酸序列的大鲵活性肽和玻尿酸制备得到的。经由实施例可知，本发明提供的大鲵肽-玻尿酸复合物相较于单独使用大鲵活性肽、玻尿酸或JYDB-5多肽，具有显著的提高模型小鼠皮肤中胶原蛋白含量的技术效果；还能够提高经由紫外线照射后人皮肤成纤维细胞的成活率；并有效提升人皮肤角质层的含水量。

附图说明

图1为本发明大鲵肽-玻尿酸混合物的红外光谱图；

图2为实施例1制备得到的大鲵肽混合物的高效液相色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种大鲵肽-玻尿酸混合物，所述大鲵肽-玻尿酸混合物包括大鲵活性肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B；

所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物A包括大鲵活性肽A和玻尿酸；所述大鲵活性肽A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物B包括大鲵活性肽B和玻尿酸；所述大鲵活性肽B的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在本发明中，所述玻尿酸的分子量优选为42.5～145kDa，进一步优选为100kDa；所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B的质量比优选为1:2。

本发明提供的大鲵肽-玻尿酸混合物具有显著的提高皮肤中胶原蛋白含量、提高经由紫外线照射后人皮肤成纤维细胞的成活率、皮肤中的含水量和含油量的作用，而且长期使用未出现不良反应，是一种安全的活性物质。

本发明还提供了所述大鲵肽-玻尿酸混合物的制备方法。

在本发明中，所述大鲵肽-玻尿酸混合物的制备方法包括两种；

第一种制备方法优选包括：将含有大鲵活性肽A和大鲵活性肽B的混合溶液(即大鲵活性肽混合物的溶液)与玻尿酸进行反应制备所述大鲵肽-玻尿酸混合物。

在本发明中，所述第一种制备方法进一步优选包括：

将大鲵活性肽混合物的溶液与玻尿酸混合，得到混合液；

将浓度为0.15mol/L的氯化锌水溶液加入混合液中得到混合物，在所述加入的过程中，检测混合物中钠离子的浓度；当混合物中钠离子的浓度不再变化后，停止加入氯化锌水溶液，得到大鲵肽-玻尿酸混合物。

在本发明中，所述大鲵活性肽混合物的溶液优选包括大鲵活性肽A和大鲵活性肽B，在本发明中，所述大鲵活性肽A和大鲵活性肽B的质量比优选为1:2。

在本发明中，所述大鲵活性肽A和大鲵活性肽B的制备方法优选包括人工合成或直接对大鲵进行提取。本发明对所述人工合成的方法没有具体限定，采用本领域技术人员所熟知的方式即可，如委托生物公司进行氨基酸的人工合成。

当采用直接大鲵提取的制备方法时，所述制备方法优选包括如下步骤：

(1)将大鲵血与磷酸缓冲液和复合酶混合后酶解，得到酶解液；

(2)对所述酶解液进行离心处理取上清液，采用截留分子量为2000Da的超滤膜分离器分离上清液，取透过超滤膜的液体；

(3)将液体加入树脂中进行震荡，震荡结束后加入乙醇，再次进行震荡，得到解析液；

(4)去除解析液中的乙醇，得到含有大鲵活性肽A和大鲵活性肽B的混合物。

本发明优选将大鲵血与磷酸缓冲液和复合酶混合后酶解，得到酶解液。在本发明中，所述磷酸缓冲液与大鲵血的体积比优选为(1～4):1，进一步优选为(1～2):1，最优选为1:1，磷酸缓冲液的pH值优选为4～5，进一步优选为4，摩尔浓度优选为0.01～0.1M，进一步优选为0.01M。

在本发明中，所述复合酶优选包括海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶和木瓜蛋白酶，上述酶优选按照活力单位比优选为(4～6):(3～5):(1～3):(1～3)混合，活力单位比进一步优选为5:4:2:2；所述复合酶的用量优选为大鲵血质量比的0.5％～10％，进一步优选为5％。

在本发明中，所述酶解的时间优选为1～12h，进一步优选为2h。在本发明中，所述酶解优选在超声条件下进行；所述酶解时的超声频率优选为15～25kHz，进一步优选为20kHz；所述酶解时的温度优选为30℃～60℃，进一步优选为37℃。

得到酶解液后，本发明优选对酶解液进行离心处理取上清液，采用截留分子量为2000Da的超滤膜分离器分离上清液，取透过超滤膜的液体。离心的条件为本领域的常规方法。

得到液体后，本发明优选将液体加入树脂中进行震荡过滤，震荡过滤结束后加入乙醇，再次进行震荡，得到解析液。在本发明中，所述液体优选加入大孔吸附树脂DA201中，所述大孔吸附树脂DA201与液体的质量体积比优选为1g:10mL；当液体加入大孔吸附树脂DA201后，优选调节pH值至5～8，进一步优选为5；震荡的转速优选为150r/min，温度优选为室温，时间优选为6～12h，进一步优选为6h；所述乙醇的体积浓度为60％～95％，进一步优选为70％；所述乙醇的体积与液体的质量比优选为70:100；本发明经过树脂过滤后，再加入乙醇能够获得含有大鲵活性肽的解析液。

得到含有大鲵活性肽的解析液后，本发明优选去除解析液中的乙醇，并进行梯度洗脱得到大鲵活性肽；所述去除乙醇的方法优选为旋转蒸发。在本发明中，所述大鲵活性肽的分子量小于等于2000Da，所述大鲵活性肽中谷氨酸的摩尔百分比优选为17.4％；

所述梯度洗脱的方法优选包括：将去除了乙醇的解析液与去离子水制备成大鲵活性肽浓度为10～50mg/ml的水溶液，在8000rpm、4℃的条件下离心10min，用0.22μm水膜过滤，得到上清液；使用ddH₂O配制甲醇的质量百分含量为5％的甲醇水溶液，通过孔径0.45μm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A；使用ddH₂O配制甲醇的质量百分含量为95％的甲醇水溶液，通过孔径0.45μm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B对上清液进行梯度洗脱；所述梯度洗脱的洗脱条件优选为：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0～20min，流动相A 100％；20.5～40min，流动相A50％，流动相B 50％；40.5～60min，流动相B 100％；将上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长为280nm的吸收峰的物质，得到大鲵活性肽混合物(含大鲵活性肽A和大鲵活性肽B)。

得到人工合成或是直接制备得到的含有大鲵活性肽A和大鲵活性肽B的混合溶液(即大鲵活性肽混合物的溶液)，本发明将所述大鲵活性肽的混合溶液与玻尿酸混合，得到混合液。

得到混合物后，本发明将浓度为0.15mol/L的氯化锌水溶液加入混合液中得到混合物，在所述加入的过程中，检测混合物中钠离子的浓度；当混合物中钠离子的浓度不再变化后，停止加入氯化锌水溶液，得到大鲵肽-玻尿酸混合物。在本发明中，获得所述氯化锌溶液后，本发明优选静置0.5h再取氯化锌溶液的上清液进行后续操作；所述氯化锌水溶液的加入方法优选为滴加；在加入过程中优选利用钠离子检测仪实时检测溶液中的钠离子浓度，当混合物中钠离子的浓度不再变化后，停止滴加氯化锌水溶液，得到大鲵肽-玻尿酸混合物。在实际运用中，向混合液中逐滴加入上清液的作用是为了让大鲵活性肽进行充分反应。

在本发明中，制备得到大鲵肽-玻尿酸混合物优选还包括透析处理，待大鲵肽-玻尿酸混合物透析至混合物中无游离的锌离子后，进行冷冻干燥，得到大鲵肽-玻尿酸混合物。本发明对所述透析处理的方式和冷冻干燥的处理方法没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的方式即可。

对冷冻干燥所得大鲵肽-玻尿酸混合物进行元素分析，得到所述大鲵肽-玻尿酸混合物中锌离子的质量百分含量为12％；大鲵活性肽中的谷氨酸通过与锌离子结合与玻尿酸形成大鲵肽-玻尿酸复合物。本发明提供的制备方法简单易操作，同时还有复合效率高的优势。

在本发明中，当采用第一种制备方法时，所述大鲵活性肽混合物的溶液和玻尿酸的质量比优选为(1～8):1，最优选为1:1。在本发明中，所述大鲵活性肽混合物的溶液中大鲵活性肽A和大鲵活性肽B的总质量浓度优选为1％～10％，进一步优选为10％。在本发明中，所述大鲵活性肽混合物的溶液的pH值优选为5.00～7.00，进一步优选为5.00。本发明以活性肽溶液的形式与玻尿酸混合，便于二者充分结合，所述溶液进一步优选为水溶液；并且本发明使用上述条件的大鲵活性肽混合物的溶液，能够有效促进与玻尿酸的复合形成复合物。

本发明还提供了第二种大鲵肽-玻尿酸混合物的制备方法，所述第二种制备方法优选包括：将大鲵活性肽A溶液和大鲵活性肽B的溶液分别与玻尿酸进行反应得到大鲵肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B，将大鲵肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B按照特定的质量比混合得到大鲵肽-玻尿酸混合物。

在本发明中，所述第二种大鲵肽-玻尿酸混合物的制备方法进一步优选包括：

将大鲵活性肽A溶液或大鲵活性肽B溶液分别与玻尿酸混合，得到对应的混合液；

将浓度为0.15mol/L的氯化锌水溶液分别加入对应的混合液中得到对应的混合物；当对应的混合物中钠离子的浓度不再变化后，停止加入氯化锌水溶液，得到大鲵肽-玻尿酸复合物A或大鲵肽-玻尿酸复合物B；将所述大鲵肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B混合，得到大鲵肽-玻尿酸混合物。

具体的，所述大鲵肽-玻尿酸的复合物A与大鲵肽-玻尿酸复合物B优选以1:2的质量比进行混合。

在第二种制备方法中，所述氯化锌水溶液的加入以及与玻尿酸反应后的透析、冷冻干燥等处理与前述第一种制备方法中的一致，在此就不再赘述。

如无特殊说明，本发明对上述涉及到的材料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。

本发明提供了上述大鲵肽-玻尿酸混合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备抗皱效果产品中的应用。本发明提供的大鲵肽-玻尿酸混合物能够有效促进真皮组织中胶原蛋白的合成、提高紫外线照射条件下人皮肤成纤维细胞的活性、提高皮肤中的水分和油脂的含量，从而起到抗皱的技术效果。

本发明提供了上述大鲵肽-玻尿酸混合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备提高皮肤中胶原蛋白含量产品中的应用。本发明提供的大鲵肽-玻尿酸混合物能够有效促进真皮组织中胶原蛋白的合成，当大鲵肽-玻尿酸混合物进行灌胃时，皮肤中的胶原蛋白含量高达79.8±4.7％。

本发明提供了上述大鲵肽-玻尿酸混合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备预防和/或修复紫外线对人皮肤成纤维细胞的伤害产品中的应用。本发明提供的大鲵肽-玻尿酸混合物能够提高紫外线照射条件下人皮肤成纤维细胞的活性，当大鲵肽-玻尿酸混合物的浓度为2.0mg/ml时，紫外线照射过的人皮肤成纤维细胞的活性为89.65±3.91％。

本发明提供了上述大鲵肽-玻尿酸混合物或上述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备提高皮肤角质层含水量产品中的应用。本发明提供的大鲵肽-玻尿酸混合物能够提高皮肤角质层含水量，当持续使用大鲵肽-玻尿酸混合物8粥后，角质层的含水量可高达36.9±6.3％。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种大鲵肽-玻尿酸混合物及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1、大鲵活性肽的制备

(1)向大鲵血中加入pH 4的0.01M磷酸缓冲液(磷酸缓冲液的体积为大鲵血的4倍)和复合酶(海洋酸性蛋白酶、胃蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶按活力单位比为5:4:2:2，复合酶的质量为大鲵血质量的5％)，在超声频率20kHz、温度37℃的条件下，酶解2h得到酶解液；

(2)将酶解液离心取上清，采用截留分子量为2000Da的超滤膜分离器分离，取透过超滤膜的液体；

(3)将液体按照1g:10mL的比例加入大孔吸附树脂DA201中，调节pH为5，以150r/min室温震荡6h后，加入体积浓度为70％的乙醇，再以150r/min室温震荡6h进行解析，得到含有大鲵活性肽的解析液。将含有大鲵活性肽的解析液进行旋转蒸发除去乙醇，得到去除了乙醇的解析液，所述去除了乙醇的解析液中的大鲵活性肽分子量小于2000Da，含谷氨酸的摩尔百分比为17.4％。

将去除了乙醇的解析液制备成10～50mg/ml的去离子水溶液，8000rpm、4℃条件下离心10min，用0.22μm水膜过滤，得到上清液；使用ddH₂O配制质量百分含量为5％的甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45μm水膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相A；使用ddH₂O配制质量百分含量为95％的甲醇缓冲溶液，通过孔径0.45μm油膜抽滤，通过超声波除气作为高效液相色谱柱流动相B；使用流动相A和流动相B对上清液进行梯度洗脱。

洗脱条件：流速为1ml/min，洗脱梯度分配：0～20min，流动相A100％；20.5～40min，流动相A 50％，流动相B 50％；40.5～60min，流动相B 100％；将上清液注入C18柱高效液相色谱仪进样口，收集紫外检测波长为280nm的吸收峰的物质；得到大鲵活性肽的混合物。对大鲵活性肽的混合物进行高效液相色谱检测，检测结果如图2所示，由图2可知混合物中大鲵活性肽A和大鲵活性肽B的的质量比为1:2。

2、大鲵肽-玻尿酸混合物的制备

取步骤1制备得到的大鲵活性肽混合物，配制成质量浓度为10％、pH 5的混合溶液，将大鲵活性肽混合物与分子量为100kDa的玻尿酸按质量比为1:1混合成混合液。

取0.15mol/L氯化锌溶液，静置0.5h后取上清，然后逐滴加入到混合液中。利用钠离子检测仪检测溶液中的钠离子浓度，待钠离子浓度数值不再变化时，停止添加氯化锌溶液的上清液。对上清液进行透析处理，去除多余的游离锌离子。

对上清液冷冻干燥得到大鲵肽-玻尿酸混合物。

对所得大鲵肽-玻尿酸混合物进行红外光谱测试，结果如图1所示，在锌离子存在的条件下，-NH₂的吸收峰位3311cm^-1，酰胺I带C＝O的特征峰为1622cm^-1，-COO^-的特征峰为1372cm^-1。由上述吸收峰可知，大鲵活性肽A和大鲵活性肽B分别与玻尿酸进行了复合，经由上述制备方法制备获得了大鲵肽-玻尿酸复合物的混合物。

将大鲵肽-玻尿酸混合物制成5～10mg/ml的去离子水溶液，使用液相色谱串联四级杆飞行时间质谱仪，经过一级质谱测定，二级质谱测定，分别获得m/z为1185.5592的物质和m/z为1517.7805的物质，经由分析可得，m/z为1185.5592的物质中肽的氨基酸序列为EQDTSAHLER，由此可知m/z为1185.5592的物质是大鲵肽-玻尿酸复合物A；m/z为1517.7805的物质中肽的氨基酸序列为KIAEQELLDSSER，由此可知m/z为1517.7805的物质是大鲵肽-玻尿酸复合物B。

实施例2

大鲵肽-玻尿酸混合物对小鼠皮肤胶原蛋白合成的影响

取健康雄性小鼠60只(辽宁长生生物技术有限公司，SCXK(辽)2020-0001)，随机分为正常组、模型组、实施例1提供的大鲵肽-玻尿酸混合物组和JYDB-5多肽组。

正常组：灌胃羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，1次/d，125mg/kg；每天皮下注射生理盐水0.25ml/10g；

模型组：灌胃羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，1次/d，125mg/kg；每天皮下注射5％D-半乳糖0.25ml/10g；

大鲵肽-玻尿酸混合物组：灌胃实施例1提供的大鲵肽-玻尿酸混合物，1次/d，125mg/kg；每天皮下注射5％D-半乳糖0.25ml/10g；

大鲵肽组：灌胃实施例1制备的大鲵肽，1次/d，125mg/kg；每天皮下注射5％D-半乳糖0.25ml/10g；

玻尿酸组：灌胃实施例1所用的玻尿酸，1次/d，125mg/kg；每天皮下注射5％D-半乳糖0.25ml/10g；

JYDB-5多肽组：灌胃发明专利ZL2020109116028公开的方法获得的JYDB-5多肽，1次/d，125mg/kg；每天皮下注射5％D-半乳糖0.25ml/10g。

上述描述中，灌胃和给药同时进行。

实验连续6周，最后1d灌胃和注射D-半乳糖2h后，处死小鼠。取小鼠背部皮肤，8％硫化钠脱毛，用体积比2:1的氯仿：乙醇溶液脱脂24h，取出清洗后真空干燥，取0.1g放入试管中，各样品管中加入6mol/L盐酸10mL进行水解，加入0.5ml 0.05mol/L氯胺T溶液，25℃氧化10min后，加入高氯酸1mL，放置10min，最后加入二甲基氨基甲醛显色剂(取无水乙醇20mL慢慢加入浓硫酸2.74mL作为A液；取对二甲基氨基苯甲醛12.0g，慢慢加入无水乙醇40ml，水浴加热完全溶解并冷却至室温，作为B液。然后将A液慢慢加入B液，混合均匀)利用分光光度法在560nm处测定羟脯氨酸的含量，通过羟脯氨酸的含量换算成胶原蛋白的含量，检测结果如表1所示。

在实验期间，所有涉及动物的程序均严格按照中国有关实验动物的相关饲养规范和法律规定进行。

表1不同组别小鼠皮肤中胶原蛋白的含量

组别	皮肤中胶原蛋白含量(％)
		正常对照组(10只)	61.2±3.6
模型组(10只)	53.6±4.4
		大鲵肽-玻尿酸混合物组(10只)	79.8±4.7*
大鲵肽组(10只)	66±8.7
		玻尿酸组(10只)	56.7±5.2
JYDB-5多肽组(10只)	72.6±3.8

注：*表示大鲵肽-玻尿酸混合物组与模型组相比差异显著，p<0.05。

由表1可知，D-半乳糖导致的皮肤衰老模型造成了胶原蛋白的流失，表明利用D-半乳糖能够有效制备得到胶原蛋白流失的模型。大鲵肽-玻尿酸混合物组与模型组相比，具有显著性区别，且小鼠皮肤中胶原蛋白的含量优于JYDB-5多肽组的，说明大鲵肽-玻尿酸混合物能有效缓解衰老所致的皮肤胶原流失，促进真皮中胶原蛋白合成。

实施例3

大鲵肽-玻尿酸混合物对中波紫外线(UVB)照射致人成纤维细胞损伤的预防和修复作用。

人皮肤成纤维细胞(HFF-1，购于中国科学院细胞库)，用含有10％胎牛血清的DMEM高糖培养液，在37℃，5％CO₂环境中培养，取对数生长期细胞，用胰蛋白酶EDTA消化，制成细胞密度为5×10⁵个/ml的悬液，按照100μl/孔接种至96孔板，培养24h。将大鲵肽-玻尿酸混合物溶于不含胎牛血清DMEM基础培养液，将96孔板中的细胞分组，每组设6个复孔。

孵育24h的人皮肤成纤维细胞，用UVB照射，能量密度为300ml/cm²，高度10cm，照射24h后，换培养液培养24h。使用实施例1提供的大鲵肽-玻尿酸混合物的组别作为实验组，为照射后的人皮肤成纤维细胞，分别加入大鲵肽-玻尿酸混合物溶液100μl，使其终浓度分别为0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1.0mg/ml、2.0mg/ml，孵育细胞24h；设置空白对照组(只含有生理盐水)，每组5个复孔，24h后MTT法在570nm测定吸光度，检测细胞的相对活率，检测结果如表2所示。

相对成活率＝(An-Ao)/(Ax-Ao)×100％

An：实验组吸光度值；

Ax：阴性对照组吸光度值(未经过紫外线照射的细胞组，即表2中的正常对照组)；

Ao：空白对照组吸光度值。

表2经UVB照射后，不同药物处理后的的细胞活性(％)

由表2可知，该实验结果表明，UVB照射后细胞相对成活率为55.46％。加入组合物后均使UVB照射后的成纤维细胞成活率提高。所以，大鲵肽-玻尿酸混合物对UVB照射而导致的细胞损伤具有修复作用。

实施例4

取30位光敏性皮肤患者，男女患者性别比例1:1，年龄在22岁至60岁之间，随机分成三组。

患者纳入标准：①确诊为光敏性皮肤病；②签署知情同意书；③不存在全身性疾病。

实验组采用涂抹质量百分含量为1％实施例1提供的大鲵肽-玻尿酸混合物的软膏，基质为冷霜；对照组1涂抹复方氧化锌软膏；对照组2涂抹1％他克莫司软膏。

用量用法：在患处皮肤涂抹一薄层，轻轻擦匀，并完全覆盖，一天两次。

疗效性指标观察：利用角质层含水量检测仪(Corneometer CM825)测量水分，皮肤油脂含量检测仪(Sebumeter SM815)测量油脂。结果如表3所示。

表3不同组别患者用药后皮肤中水分和油脂的含量(％)

成人光敏性皮肤病是皮肤对光线敏感引起的皮肤病，具有反复发作和慢性持久的特点，随着病情的发展，还可能出现皮肤萎缩、局部灼烧感、皮肤刺痛等症状。由表3可知，实验组能够显著改善患者的临床症状，提高皮肤中的水分和油脂的含量，结合实施例2可知，大鲵肽-玻尿酸混合物还会促进胶原蛋白的合成，因此对于治疗成人光敏性皮肤病具有较高的临床价值。

实施例5

皮肤含水量的改善

将40位30岁～40岁女性分成两组，每组20人，以市售保湿水为对比组，实验组为含有10mg/mL的大鲵肽-玻尿酸混合物的保湿水，每天早晚两次在脸上施用，持续8周，利用角质层含水量检测仪(Corneometer CM825)测量皮肤水分含量。皮肤水分含量如表4。

表4不同保湿水对皮肤含水量的影响(％)

组别	0周	8周
			对比组	20.1±4.3	22.4±3.8
实验组	20.5±5.4	36.9±6.3

由表4可知，本发明实施例1提供的大鲵肽-玻尿酸混合物能够有效提高皮肤中的含水量，并且提升效果显著优于市售产品。

实施例6

安全性评价结果

通过对实施例5的人体试用实验来观察本发明对人体皮肤安全性，受试者回访时，仔细询问，检查并记录受试者在使用样品期间所发生的任何不良事件。结果显示，实验例5中的40名受试者在8周的人体实验研究过程中，未见任何皮肤不良反应，表明实验组与测试组样品均具有良好的安全性。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 四川原石科技有限公司

<120> 大鲵肽-玻尿酸混合物及其制备方法和应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Gln Asp Thr Ser Ala His Leu Glu Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Lys Ile Ala Glu Gln Glu Leu Leu Asp Ser Ser Glu Arg

1 5 10

Claims (10)

1.一种大鲵肽-玻尿酸混合物，其特征在于，所述大鲵肽-玻尿酸混合物包括大鲵活性肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B；

所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物A包括大鲵活性肽A和玻尿酸；所述大鲵活性肽A的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物B包括大鲵活性肽B和玻尿酸；所述大鲵活性肽B的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的大鲵肽-玻尿酸混合物，其特征在于，所述玻尿酸的分子量为42.5～145kDa；

所述大鲵活性肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B的质量比为1:2。

3.权利要求1或2所述的大鲵肽-玻尿酸混合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将大鲵活性肽混合物的溶液与玻尿酸混合，得到混合液；

将浓度为0.15mol/L的氯化锌水溶液加入混合液中得到混合物，在所述加入的过程中，检测混合物中钠离子的浓度；当混合物中钠离子的浓度不再变化后，停止加入氯化锌水溶液，得到大鲵肽-玻尿酸混合物；

或者包括以下步骤：

将大鲵活性肽A溶液或大鲵活性肽B溶液分别与玻尿酸混合，得到对应的混合液；

将浓度为0.15mol/L的氯化锌水溶液分别加入对应的混合液中得到对应的混合物；当对应的混合物中钠离子的浓度不再变化后，停止加入氯化锌水溶液，得到大鲵肽-玻尿酸复合物A或大鲵肽-玻尿酸复合物B；将所述大鲵肽-玻尿酸复合物A和大鲵肽-玻尿酸复合物B混合，得到大鲵肽-玻尿酸混合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述大鲵活性肽混合物的溶液的pH值为5.00～7.00。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述大鲵活性肽混合物的溶液中，大鲵活性肽混合物的质量浓度为1％～10％。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述大鲵活性肽混合物的溶液和玻尿酸的质量比为(1～8):1。

7.权利要求1或2所述大鲵肽-玻尿酸混合物或权利要求3～5任一项所述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备抗皱效果产品中的应用。

8.权利要求1或2所述大鲵肽-玻尿酸混合物或权利要求3～5所述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备提高皮肤中胶原蛋白含量的产品中的应用。

9.权利要求1或2所述大鲵肽-玻尿酸混合物或权利要求3～5所述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备预防和/或修复紫外线对人皮肤成纤维细胞的伤害的产品中的应用。

10.权利要求1或2所述大鲵肽-玻尿酸混合物或权利要求3～5所述制备方法制备得到的大鲵肽-玻尿酸混合物在制备提高皮肤角质层含水量的产品中的应用。

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