CN112321741A - 一种植物源成分及其抗皮肤光老化、提高皮肤更新修复能力进而制备相关化妆品的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物源成分及其抗皮肤光老化、提高皮肤更新修复能力进而制备相关化妆品的用途。本发明提供了一种金缕梅多糖,其多糖含量为(97.6±1.3)%,纯度高。活性测试表明,该金缕梅多糖可以有效抵抗皮肤光老化造成的弹性降低,有效抵抗皮肤光老化造成的皮肤胶原纤维损失,具有抗皮肤光老化的活性;该金缕梅多糖还可以促进人皮肤成纤维细胞增殖,促进皮肤更新,具有提高皮肤更新修复能力的活性。
Description
技术领域
本发明属于化妆品领域,涉及植物源成分在化妆品中的应用,具体涉及一种植物源成分及其抗皮肤光老化、提高皮肤更新修复能力进而制备相关化妆品的用途。
背景技术
皮肤是人体最大、最复杂的器官,是人体与外界环境隔离的第一道屏障,起着保护身体、调节体温、感觉、分泌、排泄和免疫等诸多方面的作用。
皮肤老化包括内在因素和外在因素,内在因素即自然衰老,而外在因素主要是由紫外线照射引起,即光老化。研究表明,光老化占面部老化的80%以上。光老化指过度的紫外线照射于人体皮肤引起以下特征性改变的过程,主要表现为暴露部位皮肤质地粗糙、皱纹加深、色素沉着斑、皮革样外观等,甚至可发展为癌前病变及皮肤恶性肿瘤等。由于近年来人们对于光老化的认知不断深化,关于光老化的研究已经逐渐成为世界范围内的热点。
皮肤更新修复能力与皮肤成纤维细胞的增殖能力有关。年轻时,人皮肤成纤维细胞增殖活力高,皮肤更新修复能力强;随着年龄的增长,皮肤营养下降,皮肤成纤维细胞的增殖活力下降,导致皮肤的更新修复能力下降。
目前,一些具有抗皮肤光老化和/或提高皮肤更新修复能力作用的天然植物源成分受到了人们的广泛关注,因其安全性更高、功能性更突出以及更易被皮肤吸收等优点逐渐成为人们开发和研究的热点。
发明内容
本发明旨在提供一种植物源成分及其抗皮肤光老化、提高皮肤更新修复能力进而制备相关化妆品的用途。
本发明目的通过下面的技术方案实现:
一种植物源成分,为一种金缕梅种子多糖,该多糖通过如下方法制备:
总多糖提取:将干燥的金缕梅种子粉碎,取适量粉末,加入适量超纯水,加热浸提,过滤;将滤液减压浓缩,Sevage法脱除蛋白后加入4倍体积无水乙醇,低温静置过夜后离心,收集沉淀,用适量超纯水复溶,透析,冷冻干燥,得到金缕梅种子总多糖;
纤维素柱层析分离:称取适量总多糖,用适量超纯水复溶,上样于DEAE-52纤维素层析柱,依次用不同浓度的NaCl溶液(0、0.5、1.5mol/L)洗脱,每个浓度洗脱10个柱体积,收集1.5mol/L NaCl溶液洗脱液,透析,冷冻干燥,得到金缕梅种子分段多糖;
葡聚糖凝胶纯化:称取适量分段多糖,用适量超纯水复溶,上样于Sephadex G-100层析柱(内径2.5cm,柱床高度80cm),超纯水洗脱,流速0.8mL/min,每管收集15mL,收集 9~18管洗脱液,合并,冷冻干燥即得。
优选地,所述加热浸提步骤具体为80℃水浴下恒温浸提3h。
优选地,所述低温静置过夜后离心步骤具体为于4℃静置过夜后以4000r/min离心10min。
优选地,透析步骤均为透析72h。
优选地,葡聚糖凝胶纯化步骤中称取100mg分段多糖用10mL超纯水复溶。
上述植物源成分用于抗皮肤光老化的用途。
上述植物源成分用于提高皮肤更新修复能力的用途。
上述植物源成分用于制备抗皮肤光老化和/或提高皮肤更新修复能力的化妆品的用途。
优选地,所述化妆品为面霜,配方如下:
有益效果:
1、本发明提供了一种金缕梅多糖,其多糖含量为(97.6±1.3)%,纯度高。
2、本领域技术人员知道,皮肤光老化过程中,皮肤弹性会逐渐降低,胶原纤维含量逐渐减少,这通常与MMPs升高有关,MMP1能水解Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维,这两种胶原纤维被MMP1 切断后,MMP3可以继续降解断裂的胶原纤维,并且MMP3还能激活其他的基质金属蛋白酶,从而降解真皮中的胶原纤维等多种细胞外基质,导致正常皮肤结构发生改变。本发明提供的金缕梅多糖可以有效抵抗皮肤光老化造成的弹性降低,有效抵抗皮肤光老化造成的皮肤胶原纤维损失,这可能与其能有效抑制皮肤光老化造成的MMPs升高有关。可见,本发明提供的金缕梅多糖具有抗皮肤光老化的活性。
3、本领域技术人员知道,随着年龄增长和外界环境的刺激,人皮肤成纤维细胞的增殖活力会逐渐降低,就会导致皮肤更新缓慢,修复能力变差。本发明提供的金缕梅多糖可以促进人皮肤成纤维细胞增殖,促进皮肤更新,具有提高皮肤更新修复能力的活性。
附图说明
图1为葡聚糖凝胶纯化洗脱曲线。
图2为各组大鼠皮肤弹性测定结果。与空白组相比,模型组皮肤弹性显著降低,说明造模成功;与模型组相比,给药A组皮肤弹性显著升高,说明金缕梅多糖Ⅳ可以有效抵抗皮肤光老化造成的弹性降低;与模型组相比,给药B组皮肤弹性无明显差异。
图3中A为各组大鼠皮肤胶原纤维含量测定结果。与空白组相比,模型组皮肤中Ⅰ型胶原 (COL1)和Ⅲ型胶原(COL3)含量显著降低,说明造模成功;与模型组相比,给药A组皮肤中Ⅰ型胶原(COL1)和Ⅲ型胶原(COL3)含量显著升高,说明金缕梅多糖Ⅳ可以有效抵抗皮肤光老化造成的皮肤胶原纤维损失;与模型组相比,给药B组皮肤中Ⅰ型胶原(COL1)和Ⅲ型胶原(COL3)含量无明显差异。
图3中B为各组大鼠皮肤基质金属蛋白酶MMP1和MMP3的Western blot图。与空白组相比,模型组皮肤中MMP1和MMP3含量显著升高,说明造模成功;与模型组相比,给药A 组皮肤中MMP1和MMP3含量显著降低,说明金缕梅多糖Ⅳ可以有效抑制皮肤光老化造成的MMPs升高;与模型组相比,给药B组皮肤中MMP1和MMP3含量无明显差异。
图4为各组人皮肤成纤维细胞HSF的增殖活力。与对照组相比,金缕梅多糖Ⅳ组HSF细胞的增殖活力显著升高,说明金缕梅多糖Ⅳ可以有效提高人皮肤成纤维细胞HSF的增殖活力。金缕梅多糖Ⅴ无明显促进HSF细胞增殖的活性。
具体实施方式
以下实施例是为了具体本发明的实质性技术内容,不能以下实施例记载的具体常规细节限定本发明的保护范围。
实施例1:金缕梅多糖Ⅳ的制备
一、试验材料
金缕梅种子:在秋季金缕梅果实成熟后,连果枝采集回来,放在阳光下晒2~3天,果壳开裂,取出种子,55℃烘干,备用。
提取溶剂和分离介质均为常规的溶剂和介质,分离介质按常规方法预处理后使用。
二、方法和结果
1、提取和分离纯化
总多糖提取:将干燥的金缕梅种子粉碎过40目筛,取200g粉末,加入2L超纯水,80℃水浴下恒温浸提3h,过滤。将滤液减压浓缩至100mL,Sevage法脱除蛋白后加入4倍体积无水乙醇,于4℃静置过夜后以4000r/min离心10min,收集沉淀,用100mL超纯水复溶,透析72h,冷冻干燥,得到金缕梅种子总多糖。
纤维素柱层析分离:称取500mg总多糖,用50mL超纯水复溶,上样于DEAE-52纤维素层析柱(内径8cm,柱床高度80cm),依次用不同浓度的NaCl溶液(0、0.5、1.5mol/L) 洗脱,流速2.5mL/min,每个浓度洗脱10个柱体积,收集1.5mol/L NaCl溶液洗脱液,透析 72h,冷冻干燥,得到金缕梅种子分段多糖。
葡聚糖凝胶纯化:称取100mg分段多糖,用10mL超纯水复溶,上样于Sephadex G-100 层析柱(内径2.5cm,柱床高度80cm),超纯水洗脱,流速0.8mL/min,每管收集15mL,苯酚-硫酸法跟踪检测,以管号为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制纯化洗脱曲线。
纯化洗脱曲线如图1所示,合并9~18管洗脱液,冷冻干燥得到金缕梅多糖Ⅳ;合并25~35 管洗脱液,冷冻干燥得到金缕梅多糖Ⅴ。
2、多糖含量测定
采用苯酚-硫酸法测多糖含量。配制浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液,分别取标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL于试管内,用蒸馏水补至1mL。加入5%苯酚1mL和浓硫酸5mL,涡旋振荡,置于30℃金属浴中反应30min,冷却到室温,在490nm处检测吸光值。绘制葡萄糖溶液浓度与吸光值的标准曲线。准确配制浓度为0.1mg/mL待测多糖溶液,用苯酚- 硫酸法测量其吸光值,根据标准曲线测定其多糖含量。重复三次,计算均值±标准差。
金缕梅种子总多糖的多糖含量为(93.7±2.5)%,金缕梅多糖Ⅳ、Ⅴ的多糖含量分别为(97.6 ±1.3)%、(96.8±1.6)%,多糖含量均很高。
实施例2:抗皮肤光老化试验
一、实验材料
金缕梅多糖Ⅳ、Ⅴ按照实施例1方法制备,常温干燥保存,备用。
雌性SD大鼠购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场,体重180~200g。
二、实验方法
1、溶液配制
金缕梅多糖的甘油溶液:分别称取适量实施例1制备的金缕梅多糖Ⅳ、Ⅴ用甘油45℃超声溶解配制成浓度为2mg/mL的金缕梅多糖甘油溶液。
2、造模和给药
大鼠适应性喂养一周后,于造模前24h用松香石蜡拔毛法除去大鼠背部毛发,范围为 2cm×3cm。随机分为空白组、模型组和给药A组(金缕梅多糖Ⅳ)、给药B组(金缕梅多糖Ⅴ),每组5只。模型组和给药组按如下方案行UVB照射:照射5次/周,总计8周;第1~2 周:60mJ/cm2剂量照射;第3周:120mJ/cm2剂量照射;第4周:180mJ/cm2剂量照射;第 5~8周:240mJ/cm2剂量照射;UVB照射仪距大鼠约15cm处。给药A组每次照射前1h于拔毛区域均匀涂抹1mL金缕梅多糖Ⅳ的甘油溶液,给药B组每次照射前1h于拔毛区域均匀涂抹1mL金缕梅多糖Ⅴ的甘油溶液,模型组每次照射前1h于拔毛区域均匀涂抹1mL甘油溶液,空白组同模型组涂抹1mL甘油溶液但是不光照。所有大鼠涂后以保鲜膜覆盖涂抹区1h。
3、指标测定
大鼠存活状态下测定皮肤弹性。皮肤弹性测定结束后,处死,立即取下背部拔毛区域全层皮肤,去除皮下脂肪,在冰生理盐水中漂洗,-80℃冻存备用。
3.1皮肤弹性测定
最后一次照射24h后,根据说明书采用FC1502菲斯凯尔皮肤分析仪对各组大鼠拔毛区域的皮肤弹性进行测定。
3.2胶原纤维含量测定(RT-PCR)
冻存状态下,取皮肤组织研磨至粉末状,取适量粉末加入适量TRIzol试剂裂解细胞提取总RNA,纯化后逆转录为cDNA,稀释10倍后按20μL反应体系扩增,引物序列如下。95℃预变性5min,随后95℃变性15s,60℃退火20s,72℃延伸40s,40个循环,72℃充分延伸10min。以GAPDH为内参,法计算COL1a1和COL3a1 mRNA的相对表达量,并以空白组的相对表达量计为1。
COL1a1上游引物:5’-CAGGCAAACCTGGTGAACA-3’
COL1a1下游引物:5’-CTCGCCAGGGAAACCTCT-3’
COL3a1上游引物:5’-CTGGACCCCAGGGTCTTC-3’
COL3a1下游引物:5’-GACCATCTGATCCAGGGTTTC-3’
GAPDH上游引物:5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’
GAPDH下游引物:5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’
3.3基质金属蛋白酶含量测定(Western blot)
冻存状态下,将剩余皮肤组织粉末加入适量TRIzol试剂裂解细胞,BCA法测定蛋白浓度,取适量蛋白进行SDS-PAGE电泳,并转移至PVDF膜上,用脱脂奶粉封闭,4℃下一抗MMP1、 MMP3、β-actin孵育过夜,洗涤后加入二抗室温孵育1h,化学发光显色试剂孵育曝光,通过化学发光成像系统进行分析。
4、统计学处理
所有数据使用SPSS 19.0进行分析处理,计量资料以均数±标准差表示,采用方差分析。 P<0.05认为差异有统计学意义。
三、实验结果
1、皮肤弹性测定结果
各组大鼠皮肤弹性测定结果如表1和图2所示,与空白组相比,模型组皮肤弹性显著降低,说明造模成功;与模型组相比,给药A组皮肤弹性显著升高,说明金缕梅多糖Ⅳ可以有效抵抗皮肤光老化造成的弹性降低;与模型组相比,给药B组皮肤弹性无明显差异。
表1 各组大鼠皮肤弹性
2、胶原纤维含量测定结果
各组大鼠皮肤胶原纤维含量测定结果如表2和图3中A所示,与空白组相比,模型组皮肤中Ⅰ型胶原(COL1)和Ⅲ型胶原(COL3)含量显著降低,说明造模成功;与模型组相比,给药A组皮肤中Ⅰ型胶原(COL1)和Ⅲ型胶原(COL3)含量显著升高,说明金缕梅多糖Ⅳ可以有效抵抗皮肤光老化造成的皮肤胶原纤维损失;与模型组相比,给药B组皮肤中Ⅰ型胶原 (COL1)和Ⅲ型胶原(COL3)含量无明显差异。
表2 各组大鼠皮肤胶原纤维含量测定结果
3、基质金属蛋白酶含量测定结果
各组大鼠皮肤基质金属蛋白酶(MMPs)含量测定结果如图3中B所示,与空白组相比,模型组皮肤中MMP1和MMP3含量显著升高,说明造模成功;与模型组相比,给药A组皮肤中MMP1和MMP3含量显著降低,说明金缕梅多糖Ⅳ可以有效抑制皮肤光老化造成的 MMPs升高;与模型组相比,给药B组皮肤中MMP1和MMP3含量降低不明显。
本领域技术人员知道,皮肤光老化过程中,皮肤弹性会逐渐降低,胶原纤维含量逐渐减少,这通常与MMPs升高有关,MMP1能水解Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维,这两种胶原纤维被MMP1切断后,MMP3可以继续降解断裂的胶原纤维,并且MMP3还能激活其他的基质金属蛋白酶,从而降解真皮中的胶原纤维等多种细胞外基质,导致正常皮肤结构发生改变。上述试验结果说明,金缕梅多糖Ⅳ可以有效抵抗皮肤光老化造成的弹性降低,有效抵抗皮肤光老化造成的皮肤胶原纤维损失,这可能与其能有效抑制皮肤光老化造成的MMPs升高有关。因此,金缕梅多糖Ⅳ具有抗皮肤光老化的活性。
实施例3:提高皮肤更新修复能力试验
一、试验材料
人皮肤成纤维细胞HSF的品牌为ATCC,购自上海雅吉生物科技有限公司。
胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司。
金缕梅多糖Ⅳ、Ⅴ按照实施例1方法制备,常温干燥保存,备用。
MTT、DMSO购自美国Sigma公司。
二、试验方法
1、细胞培养
将人皮肤成纤维细胞HSF接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基(完全培养基)中,于37℃、5%CO2、相对饱和湿度条件培养,2~3d传代一次。
2、细胞增殖活力测定
取对数生长期的人皮肤成纤维细胞HSF,消化,用完全培养基重悬制成细胞浓度为5×104/mL的细胞悬液,接种于96孔板中,每孔100μL。24h后,药物组更换为含有5μg/mL、 10μg/mL金缕梅多糖Ⅳ或金缕梅多糖Ⅴ的完全培养基继续培养,对照组为不加药的完全培养基培养,另设置不含细胞的培养液作为空白组,于37℃、5%CO2、相对饱和湿度条件继续培养48h,每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液继续培养4h,吸弃上清,每孔加150μL DMSO,振荡10min,在酶标仪490nm波长下测定各孔光吸收值OD490,以对照组增殖活力为100%计,根据公式计算各药物组人皮肤成纤维细胞HSF的增殖活力(%)。每组5个复孔。
增殖活力(%)=(OD药物组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%
3、统计学处理
所有数据使用SPSS 19.0进行分析处理,计量资料以均数±标准差表示,采用方差分析。 P<0.05认为差异有统计学意义。
三、试验结果
各组人皮肤成纤维细胞HSF的增殖活力如表3和图4所示,与对照组相比,金缕梅多糖Ⅳ组HSF细胞的增殖活力显著升高,说明金缕梅多糖Ⅳ可以有效提高人皮肤成纤维细胞HSF 的增殖活力。金缕梅多糖Ⅴ无明显促进HSF细胞增殖的活性。
表3各组人皮肤成纤维细胞HSF的增殖活力
本领域技术人员知道,随着年龄增长和外界环境的刺激,人皮肤成纤维细胞的增殖活力会逐渐降低,就会导致皮肤更新缓慢,修复能力变差。上述试验结果说明,金缕梅多糖Ⅳ可以促进人皮肤成纤维细胞增殖,促进皮肤更新,具有提高皮肤更新修复能力的活性。
实施例4:一种抗皮肤光老化、提高皮肤更新修复能力的面霜
一种抗皮肤光老化、提高皮肤更新修复能力的面霜,配方如下:
上述实施例是为了具体本发明的实质性技术内容,不能以上述实施例记载的具体常规细节限定本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种植物源成分,为一种金缕梅种子多糖,其特征在于,该多糖通过如下方法制备:
总多糖提取:将干燥的金缕梅种子粉碎,取适量粉末,加入适量超纯水,加热浸提,过滤;将滤液减压浓缩,Sevage法脱除蛋白后加入4倍体积无水乙醇,低温静置过夜后离心,收集沉淀,用适量超纯水复溶,透析,冷冻干燥,得到金缕梅种子总多糖;
纤维素柱层析分离:称取适量总多糖,用适量超纯水复溶,上样于DEAE-52纤维素层析柱,依次用不同浓度的NaCl溶液(0、0.5、1.5mol/L)洗脱,每个浓度洗脱10个柱体积,收集1.5mol/LNaCl溶液洗脱液,透析,冷冻干燥,得到金缕梅种子分段多糖;
葡聚糖凝胶纯化:称取适量分段多糖,用适量超纯水复溶,上样于Sephadex G-100层析柱(内径2.5cm,柱床高度80cm),超纯水洗脱,流速0.8mL/min,每管收集15mL,收集9~18管洗脱液,合并,冷冻干燥即得。
2.根据权利要求1所述的植物源成分,其特征在于:所述加热浸提步骤具体为80℃水浴下恒温浸提3h。
3.根据权利要求1所述的植物源成分,其特征在于:所述低温静置过夜后离心步骤具体为于4℃静置过夜后以4000r/min离心10min。
4.根据权利要求1所述的植物源成分,其特征在于:透析步骤均为透析72h。
5.根据权利要求1所述的植物源成分,其特征在于:葡聚糖凝胶纯化步骤中称取100mg分段多糖用10mL超纯水复溶。
6.权利要求1所述的植物源成分用于抗皮肤光老化的用途。
7.权利要求1所述的植物源成分用于提高皮肤更新修复能力的用途。
8.权利要求1所述的植物源成分用于制备抗皮肤光老化和/或提高皮肤更新修复能力的化妆品的用途。
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