CN113730430B - 小分子天山雪莲多糖在脂联素分泌调节方面的用途及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途及其制备方法。该产品能提高脂肪细胞中脂联素的含量，提高脂肪细胞脂联素表达。所述小分子天山雪莲多糖的分子量小于等于100kDa。制备方法以天山雪莲干制品为起始原料，经过五个步骤制得到小分子天山雪莲多糖，具有提取率高，且得到的天山雪莲多糖的分子量低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及脂联素技术领域，特别涉及小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途、促进脂联素表达的方法及其制备方法。
背景技术
近年来，糖尿病、高血压症、高血脂症、或者动脉硬化症等所谓生活习惯病的增加成了社会的重大问题之一。生活习惯病除了患者遗传因素之外，同时也与体内各种内分泌因子的调控密切相关。脂联素(Adiponectin或ADIPOQ)是内分泌因子之一，其分子量约30kDa，由244个氨基酸残基构成，大量存在于脂肪组织和血液中，作为一种防止动脉硬化的有益脂肪细胞因子，此外脂联素还具有能改善高血压、改善脂质代谢、改善胰岛素敏感性、抗炎、抑制肝纤维化、抑制癌细胞转移等功效。
近年来研究发现脂联素能够促进角质细胞的增殖，能够促进丝聚蛋白(FLG)、透明质酸和细胞外基质的表达，从而执行着肠道口腔粘膜修复、伤口愈合、抑制纤维化等功能。
已知的具有促进脂联素产生的药剂有噻唑烷衍生物，但是会伴有腹泻恶心等副作用。此外，促进脂联素产生的活性物有N-乙酰半胱氨酸，夹竹桃麻素，姜辣素，酵母提取物等。
天山雪莲主要分布于我国西部，在海拔4200m以上的高原地区，是我国名贵药用植物。天山雪莲具有抗炎镇痛、抗氧化、清除自由基等功效，目前国内对雪莲中黄酮类化合物研究报道较多，而对其药效起到独有作用的水溶性多糖研究较少，主要是由于雪莲多糖的提取率普遍较低。现有技术中，天山雪莲多糖提取工艺制备天山雪莲多糖，其多糖提取率不高于7.08％。此外，现有技术中，所提取的天山雪莲多糖以大分子多糖成分为主，其中分子量大于100kDa的多糖超过80％。多糖分子量较大时难以透过肠道粘膜及皮肤屏障，难以发挥对应功效。
因此，针对现有技术不足，提供小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途、促进脂联素表达的方法及其制备方法以解决现有技术不足甚为必要。
发明内容
本发明目的之一在于避免现有技术的不足之处而提供一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途，该用途能提高细胞中脂联素的含量。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
提供一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途。
优选的，上述小分子天山雪莲多糖的分子量小于等于100kDa。
进一步的，上述小分子天山雪莲多糖的分子量的范围为1.0kDa～70kDa。
更进一步的，上述小分子天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDaa。
优选的，所述产品用于抑制炎症的表达；或者
所述产品用于促进丝聚蛋白的表达；或者
所述产品用于促进出皮肤中脂联素的表达；或者
所述产品用于改善脂质代谢；或者
所述产品用于改善胰岛素代谢；或者
所述产品用于抑制肝纤维化；或者
所述产品用于改善高血压；或者
所述产品用于改善粘膜；或者
所述产品用于修复皮肤屏障。
优选的，所述产品为具有脂联素分泌调节作用的日化产品形态；或者
所述产品为具有脂联素分泌调节作用的药品形态；或者
所述产品为具有脂联素分泌调节作用的食品形态。
本发明的第二个目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种促进脂联素表达的方法。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
提供一种促进脂联素表达的方法，通过上述小分子天山雪莲多糖促进脂联素表达。
本发明的一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途及一种促进脂联素表达的方法，能提高脂肪细胞中脂联素的含量，提高脂肪细胞脂联素表达。
本发明的第三个目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，能制得分子量小的天山雪莲多糖，且该制备方法具有天山雪莲多糖产率高的特点。
本发明的上述目的通过以下技术措施实现：
提供一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、获取滤渣；
步骤二、获取天山雪莲匀浆液；
步骤三、亚临界提取步骤二得到的天山雪莲匀浆液，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa的多糖滤液；
步骤四、向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液加入水解酶，酶解处理得到酶解液，然后升温，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后加热浓缩，加入溶剂后沉降得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得分子量小于等于100kDa的多糖。
优选的，上述步骤三具体是：将步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为90℃～200℃、提取压力为2.0Mp～4.0Mpa的条件进行亚临界提取，亚临界提取0.1h～3.0h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa的多糖滤液。
上述步骤四具体是：按照水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的0.1％～3.0％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至4.0～7.0，酶解温度为50℃～60℃，酶解处理0.5h～5h后得到酶解液，然后升温至大于70℃后处理0.2h～4.0h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ。
上述步骤五具体是：将步骤三得到的分子量小于等于100kDa的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度55℃以上浓缩，浓缩至相对密度为1.10～1.50，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为65％～92％，搅拌均匀后，静置沉降4h～15h，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
进一步的，上述步骤三具体是：取步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为100℃～180℃、提取压力为2.5Mp～3.5Mpa的条件进行亚临界提取，亚临界提取0.3h～2.5h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液。
上述步骤四具体是：按照水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的0.5％～2.8％量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至4.3～6.5，酶解温度为53℃～56℃，酶解处理1h～3h后得到酶解液，然后升温至大于80℃后处理0.8h～2.5h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ。
上述步骤五具体是：将步骤三得到的分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度60℃以上浓缩，浓缩至相对密度为1.20～1.35，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为70％～90％，搅拌均匀后，静置沉降8h～12h，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖；
优选的，上述水解酶为纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、β-(1→3)葡聚糖水解酶中的至少一种。
本发明的小分子天山雪莲多糖的制备方法，采用亚临界结合酶水解处理天山雪莲匀浆得到小分子多糖，以天山雪莲干制品为起始原料，经过五个步骤制得小分子天山雪莲多糖。该小分子天山雪莲多糖的制备方法具有提取率高、且制得的天山雪莲多糖分子量低的优点。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1。
小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途。
其中，本发明所指的小分子天山雪莲多糖是指分子量小于等于100kDa的天山雪莲多糖。分子量小于等于100kDa的小分子天山雪莲多糖能有效提供高脂肪细胞中脂联素的含量。当小分子天山雪莲多糖的分子量小于等于70kDa时，提高脂肪细胞中脂联素含量的效果较好。当小分子天山雪莲多糖的分子量进一步小于等于50kDa时，在提高脂肪细胞中脂联素含量方面的效果更佳。
一、验证天山雪莲多糖促进脂联素生成的实验步骤：
步骤(1)、3T3-L1细胞的培养诱导分化
将3T3-L1细胞(小鼠成纤维细胞)接种于12孔板中，待细胞长满至80％左右，加入成脂诱导培养液(向培养基中加入地塞米松、胰岛素、异丁基甲基黄嘌呤，使其最终浓度分别为：1μM、10μM和0.5mM)，同时加入样品溶液。培养2d后，吸除原培养液，加入含10μM胰岛素的培养液及样品溶液培养2d。2d后吸除原培养液，加入样品溶液，每2d用样品溶液换液一次。直至培养至第9d，收集细胞，用于后续ELISA测试脂联素的含量。
其中，空白组全程加入完全培养基培养；模型组在诱导剂诱导过程结束后加入正常培养基；样品组在诱导剂诱导过程中同时加入样品，诱导过程结束后继续用含样品的培养基培养。
样品组组成如下：
对比样1：传统水提天山雪莲多糖，天山雪莲多糖的分子量为12.00～1105.00kDa，且配制成天山雪莲多糖浓度为0.05wt％水溶液；
样品1：天山雪莲多糖的分子量小于等于100kDa，且配制成天山雪莲多糖浓度为0.05wt％水溶液；
样品2：天山雪莲多糖的分子量的范围为1.0kDa～70kDa，且配制成天山雪莲多糖浓度为0.05wt％水溶液；
样品3-1：天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa，且配制成天山雪莲多糖浓度为0.01wt％水溶液；
样品3-2：天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa，且配制成天山雪莲多糖浓度为0.05wt％水溶液；
样品3-3：天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa，且配制成天山雪莲多糖浓度为0.25wt％水溶液。
通过本发明实施例16至实施例25制备得到的小分子天山雪莲多糖经过分子量筛选，分别得到分子量小于等于100kDa天山雪莲多糖，分子量的范围为1.0kDa～70kDa天山雪莲多糖和分子量的范围为1.5kDa～50kDa天山雪莲多糖，以这些不同分子量范围分布的天山雪莲多糖对应配置本实施例的样品1、样品2、样品3，样品3具体包括样品3-1、样品3-2和样品3-3。对比样1中的天山雪莲多糖通过本发明对比例1的方法制备得到。
步骤(2)、通过qPCR检测脂联素在mRNA水平表达
步骤S1、总RNA抽提，其中所使用的枪头和离心管均经过湿热灭菌，且无RNA酶。
取匀浆管，加入1ml的Trizol Reagent，置冰上预冷。取收集的样品，加入到匀浆管中。匀浆仪充分研磨。12000rpm离心10min取上清。加入250μl三氯甲烷，颠倒离心管15s，充分混匀，静置3min。4℃下12000rpm离心10min。将上清液转移到一新的离心管中，加入0.8倍体积的异丙醇，颠倒混匀。-20℃放置15min。4℃下12000rpm离心10min，管底的白色沉淀即为RNA。吸除液体，加入75％乙醇1.5ml洗涤沉淀。4℃下以12000rpm离心5min。将液体吸除干净，将离心管置于超净台上吹3min。加入15μl无RNA酶的水溶解RNA。55℃孵育5min。使用Nanodrop 2000仪器，将仪器空白调零后取2.5μl待测RNA溶液于检测基座上，放下样品臂，使用电脑上的软件开始吸光值检测，得到RNA浓度。将浓度过高(高于200ng/μl)的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200ng/μl。
步骤S2、反转录，其中所使用的枪头和PCR均经过湿热灭菌，且无RNA酶。
取一PCR管，加入含2μg RNA的溶液。加入1μl oligo(dT)18。用无核糖核酸酶的去离子水补足至12μl。于PCR仪上65℃保温5min，迅速置冰上冷却。依次加入4μl 5×ReactionBuffer，2μl 10mM dNTP Mix，1μl RiboLockRNAase抑制剂(20U/μl)和1μl RevertAi M-MuLV逆转录酶(200u/μl)，用枪抽吸混匀。于PCR仪上42℃保温60min，结束后70℃保温5min灭活反转录酶。
步骤S3、定量PCR
步骤S3.1、取0.2ml PCR管，配制如下反应体系，每个反转录产物配制3管。
2×qPCR Mix：12.5μl；
7.5μM基因引物：2.0μl。其中基因引物具体为ADIPOQ基因引物，引物信息为15626359a1，上游引物的序列为TGTTCCTCTTAATCCTGCCCA，下游引物的序列为TGTTCCTCTTAATCCTGCCCA，片段长度为104；
反转录产物：2.5μl；
ddH2O：8.0μl。
步骤S3.2、PCR扩增
预变性：95℃、10min；
循环：在95℃下维持15s，然后降温至60℃，在60℃维持60s,此为一个循环；然后升温至95℃，重复上述循环；然后再升温至95℃，重复上述循环,共循环40次；
熔解曲线：按照每15s升温0.3℃的速度，从60℃升至95℃。
步骤S4、结果处理
结果出来采用ΔΔCT法计算：
A＝CT(目的基因，待测样本)-CT(内标基因，待测样本)；
B＝CT(目的基因，对照样本)-CT(内标基因，对照样本)；
K＝A-B；
表达倍数＝2-K。
最后根据不同组样品的表达倍数数据，计算均值和标准差。
步骤(3)、ELISA法检测脂联素在蛋白水平含量变化
收集培养的上清液，使用脂联素ELISA试剂盒，按照说明书操作，测定上清液中脂联素的含量。同时测量值通过相应孔提取的DNA的量来进行标准化。
二、实验结果：
(1)、采用qPCR结果评价脂肪细胞中脂联素mRNA水平变化，结果如表一所示。
表一、脂联素mRNA水平的相对表达情况
备注：各组相对于模型组进行单因素方差分析，计算P值(*为P＜0.05，**为P＜0.01,***为P＜0.001,****为P＜0.0001)进行显著性差异分析。
根据表一的结果可见，与对照组相比，天山雪莲多糖对脂联素在mRNA水平的相对表达有明显的促进作用。分子量小于等于100kDa的小分子天山雪莲多糖对应的样品(样品1、样品2、样品3-1、样品3-2、样品3-3)的脂联素在mRNA水平的相对表达量是对照组表达量的2倍～5倍。分子量小于等于100kDa的小分子天山雪莲多糖对应的样品的脂联素在mRNA水平的相对表达量高于对比样1的结果，可见，本发明制备的小分子天山雪莲多糖在促进脂联素分泌方面的效果优于传统工艺提取的天山雪莲多糖在此方面的效果。
根据样品1、样品2、样品3-2的结果可以看出，在相同的浓度下，样品3-2的脂联素在mRNA水平的相对表达量最高。天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa的脂联素在mRNA水平的相对表达量效果最佳。
当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时，即使小分子量的天山雪莲多糖浓度仅为对比样1浓度的20％时，其脂联素在mRNA水平的相对表达量效果仍优胜于对比样1。
(2)、采用ELISA法检测上清液中脂联素mRNA水平，结果如表二所示。
表二、脂肪细胞分泌脂联素mRNA水平的相对表达情况
备注：各组相对于模型组进行单因素方差分析，计算P值(*为P＜0.05，
**为P＜0,01)进行显著性差异分析。
根据表二结果，分子量小于等于100kDa的小分子天山雪莲多糖对应的样品(样品1、样品2、样品3-1、样品3-2、样品3-3)上清液中脂联素表达量是对照组表达量的2倍多，且显著优于传统工艺提取的天山雪莲多糖对应的对比样1的结果。
综上所述，小分子天山雪莲多糖具有脂联素分泌调节作用，可用于作为脂联素分泌调节的有效成分。以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品能提高脂肪细胞中脂联素的含量，且当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时的脂肪细胞脂联素表达效果最佳。
实施例2。
一种小分子天山雪莲多糖在作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品用于修复皮肤屏障。
小分子天山雪莲多糖具有调控皮肤中脂联素表达和修复皮肤屏障的作用。为了验证该效果，建立皮肤屏障损伤动物模型，检测天山雪莲多糖对皮肤中脂联素的表达调控和对皮肤的屏障修复作用。
一、天山雪莲多糖对皮肤中脂联素表达调控和屏障修复作用的实施步骤：
设置空白组、模型组、对照组、分别涂抹样品1、样品2、样品3-1、样品3-2、样品3-3的样品组小鼠进行比对实验。空白组小鼠不进行任何处理。模型组、对照组、各样品组小鼠经过丙酮/乙醚处理30s，水处理30s。在模型构建之后，间隔30min，使用不同组别的样品100μl，涂抹大鼠背部，对照组涂抹蒸馏水100μl，一天两次。处理第6d，对照组背部出现鳞屑，实验组涂抹小分子天山雪莲多糖提取物的部位，没有鳞屑现象产生(没有涂抹的部位也有鳞屑产生)。
二、指标检测
2.1、经皮失水率TWEL检测：
小鼠处死前，使用仪器对小鼠背部皮肤的经皮失水率进行测定。本发明具体采用TM300-德国CK皮肤水份流失(TEWL)测试仪，测试环境保持温度20℃～22℃、湿度为50％的恒温恒湿环境稳定30min之后进行测量，保持探头贴合小鼠的背部皮肤，在数值稳定后进行记录。
三、实验结果
经皮失水测定结果见表三，经皮失水率TWEL结果及显著性分析显示，样品组和对比样1小鼠的经皮失水率低于模型组小鼠的经皮失水率，其中小分子天山雪莲多糖样品组的经皮失水率均低于对比样1组小鼠的经皮失水率。可见，样品组和对比样1组的性能优于模型组的结果，小分子天山雪莲多糖样品组的性能优于对比样1组的性能。
小分子天山雪莲多糖对皮肤屏障修复效果显著，且当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时的皮肤屏障修复效果最佳。当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时，即使小分子量的天山雪莲多糖仅为对比样1浓度的20％时，其皮肤屏障修复效果仍优于对比样1。
表三、不同组别经皮失水率的结果
备注：各组相对于模型组进行单因素方差分析，计算P值(*为P＜0.05，**为P＜0.01,***为P＜0.001,****为P＜0.0001)进行显著性差异分析。
实施例3。
一种小分子天山雪莲多糖在作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品用于促进皮肤中脂联素的表达。
本实施例的指标检测方法与实施例1中的实验步骤中的步骤S1至步骤S4相同，通过指标检测对各组小鼠背部皮肤组织取样进行qPCR检测脂联素指标。qPCR测定的脂联素的表达结果，具体相对含量如表四所示。
表四、不同组别脂联素的mRNA水平相对含量
备注：各组相对于模型组进行单因素方差分析，计算P值(*为P＜0.05，**为P＜0.01)进行显著性差异分析。
根据表四，脂联素在mRNA水平的表达结果及显著性分析显示，样品组和对比样1组，脂联素的mRNA水平相对含量均高于模型组的含量，其中小分子天山雪莲多糖样品组的脂联素的mRNA水平相对含量均高于对比样1组的结果。可见，样品组和对比样1组的性能优于模型组的结果，小分子天山雪莲多糖样品组的性能优于对比样1组的性能。
当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时脂联素在mRNA水平的表达效果最佳。当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时，即使小分子量的天山雪莲多糖仅为对比样1浓度的20％时，其脂联素在mRNA水平的表达效果仍优胜于对比样1。因此小分子天山雪莲多糖促进脂联素的表达效果更显著。
故，本发明的分子量小于等于100kDa的小分子天山雪莲多糖可作为脂联素分泌调节产品的有效成分，通过该产品促进出皮肤中脂联素的表达。
实施例4。
一种小分子天山雪莲多糖在作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品用于促进丝聚蛋白的表达。
本实施例的指标检测方法与实施例1中的实验步骤中的步骤S1至步骤S4相同，通过指标检测对各组小鼠背部皮肤组织取样进行qPCR检测丝聚蛋白指标。其中本实施例指标检测的基因引物具体为FLG基因引物，引物信息为26331770a1，上游引物的序列为CTAGAGGGCATGAGTGTAGTCA，下游引物的序列为CAAGACTGGACAGTTGGCTGG，片段长度为133。qPCR测定的丝聚蛋白FLG的表达结果如表五所示。
表五、不同组别丝聚蛋白的mRNA水平相对含量
备注：各组相对于模型组进行单因素方差分析，计算P值(*为P＜0.05，**为P＜0.01)进行显著性差异分析。
根据表五，丝聚蛋白在mRNA水平的表达结果及显著性分析显示：样品组和对比样1小鼠皮肤组织丝聚蛋白mRNA水平相对含量均高于模型组小鼠皮肤组织中的含量，且当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时促进丝聚蛋白表达的效果最佳。
当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时，即使小分子量的天山雪莲多糖浓度仅为对比样1浓度的20％时，其促进丝聚蛋白的表达效果仍优于对比样1。因此小分子天山雪莲多糖促进丝聚蛋白的表达效果更显著。
本发明的分子量小于等于100kDa的小分子天山雪莲多糖可作为脂联素分泌调节产品的有效成分，通过该产品促进出丝聚蛋白的表达。
实施例5。
一种小分子天山雪莲多糖在作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其产品用于抑制炎症的表达。
本实施例的指标检测方法与实施例1中的实验步骤中的步骤S1至步骤S4相同，通过指标检测对各组小鼠背部皮肤组织取样进行qPCR检测炎症因子指标，炎症因子简称为IL-6。其中本实施例指标检测的基因引物具体为IL-6基因引物，引物信息为15626359a1，上游引物的序列为GGCGGATCGGATGTTGTGAT，下游引物的序列为GGACCCCAGACAATCGGTTG，片段长度为199。qPCR测定的炎症因子的表达结果见表六。
表六、不同组别炎症因子的mRNA水平相对含量
备注：各组相对于模型组进行单因素方差分析，计算P值(*为P＜0.05，**为P＜0.01,***为P＜0.001,****为P＜0.0001)进行显著性差异分析。
根据表六中相对含量的变化，炎症因子在mRNA水平的表达结果及显著性分析显示涂抹小分子天山雪莲多糖的样品组(样品1、样品2、样品3-1、样品3-2、样品3-3)和对比样1的结果均优于模型组的结果，其中样品组的结果显著低于对比样1。且当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时的抑制炎症因子的表达效果最佳。而且当天山雪莲多糖的分子量的范围为1.5kDa～50kDa时，即使小分子量的天山雪莲多糖的浓度仅为对比样1浓度的20％时，其抑制炎症因子的表达效果仍优于对比样1，小分子天山雪莲多糖抑制炎症因子的表达效果更显著。
综上分析，分子量小于等于100kDa的小分子天山雪莲多糖可作为脂联素分泌调节的有效成分，可作为产品促进脂联素分泌的有效成分，所形成的产品能抑制炎症的表达。
需要说明的是，实施例1-5仅是以分子量小于等于100kDa天山雪莲多糖、分子量的范围为1.0kDa～70kDa天山雪莲多糖和分子量的范围为1.5kDa～50kDa天山雪莲多糖的样品进行说明的。本发明的小分子天山雪莲多糖的小端分子量范围分布于1.0kDa～5.0kDa之间、大端在小于等于100kDa范围的均具有促进脂肪细胞脂联素表达及对应的效果。在此不对各个小端范围与对应的大端分子量范围的各种情况进行一一效果列举。
实施例6。
一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品用于改善脂质代谢。
脂联素具有改善改善脂质代谢的功效，由于小分子天山雪莲多糖能提高脂肪细胞中脂联素的含量，故本发明的小分子天山雪莲多糖能改善脂质代谢，含有小分子天山雪莲多糖的产品能改善脂质代谢。
实施例7。
一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品用于改善胰岛素代谢。
脂联素具有改善胰岛素敏感性的功效，由于小分子天山雪莲多糖能提高脂肪细胞中脂联素的含量，本发明的小分子天山雪莲多糖能改善胰岛素代谢，含有小分子天山雪莲多糖的产品能改善胰岛素代谢。
实施例8。
一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品具有改善高血压的功效，可用于改善高血压。
脂联素具有改善高血压的功效，由于小分子天山雪莲多糖能提高脂肪细胞中脂联素的含量，本发明的小分子天山雪莲多糖能改善高血压，含有小分子天山雪莲多糖的产品能改善高血压。
实施例9。
一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品用于抑制癌细胞转移的功效。
脂联素具有抑制癌细胞转移的功效，由于小分子天山雪莲多糖能提高脂肪细胞中脂联素的含量，本发明的小分子天山雪莲多糖能抑制癌细胞转移，含有小分子天山雪莲多糖的产品具有抑制癌细胞转移的功效。
实施例10。
一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品用于抑制肝纤维化的功效。
脂联素具有抑制肝纤维化的功效，由于小分子天山雪莲多糖能提高脂肪细胞中脂联素的含量，本发明的小分子天山雪莲多糖能抑制肝纤维化，含有小分子天山雪莲多糖的产品具有抑制肝纤维化的功效。
实施例11。
一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品用于改善粘膜性能。
脂联素能够促进角质细胞的增殖、丝聚蛋白、透明质酸和细胞外基质的表达，由于小分子天山雪莲多糖能提高脂肪细胞中脂联素的含量，所以小分子天山雪莲多糖能改善粘膜，具体如小分子天山雪莲多糖等具有修复伤口、促进伤口愈合、抑制纤维化等的功能，因此含有小分子天山雪莲多糖的产品具有改善粘膜性能的功效。
实施例12。
小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品为具有脂联素分泌调节作用的日化产品形态。如面霜、营养液、乳液、爽肤水、面膜等。
其中，小分子天山雪莲多糖可为实施例1中的小分子天山雪莲多糖，所用于的产品可为实施2至11中的产品用途。
实施例13。
一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品为具有脂联素分泌调节作用的药品形态，如药片、药粉、胶囊、丸剂等。
其中，小分子天山雪莲多糖可为实施例1中的小分子天山雪莲多糖，所用于的产品可为实施2至11中的产品用途。
实施例14。
一种小分子天山雪莲多糖在制备以小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分的产品中的用途,其中产品为具有脂联素分泌调节作用的食品形态。
其中，小分子天山雪莲多糖可为实施例1中的小分子天山雪莲多糖，所用于的产品可为实施2至11中的产品用途。
实施例15。
一种促进脂联素表达的方法，通过如实施例11至实施例24任意一种小分子天山雪莲多糖促进脂联素表达。
实施例16。
一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，可用于制备实施例1至15中的小分子天山雪莲多糖，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品萃取、过滤，得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，加入去离子水，然后进行胶体磨处理，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、对步骤二得到的天山雪莲匀浆液进行亚临界提取，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa的多糖滤液；
步骤四、将步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，酶解处理得到酶解液，然后升温，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后进行加热浓缩，加入溶剂后进行沉降，得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物进行干燥得分子量小于等于100kDa的多糖。
本发明水解酶为纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、β-(1→3)葡聚糖水解酶中的至少一种。
该小分子天山雪莲多糖的制备方法，采用亚临界结合酶水解处理天山雪莲匀浆得到小分子多糖，具体通过天山雪莲干制品为起始原料，经过五个步骤制得到小分子天山雪莲多糖，通过该方法得到的小分子天山雪莲多糖的分子量小于等于100kDa。因为本发明的小分子天山雪莲多糖的分子量较小，从而能容易透过肠道粘膜及皮肤屏障，发挥功效。本发明的小分子天山雪莲多糖的制备方法具有提取率高，且得到的天山雪莲多糖的分子量低的优点。
实施例17。
一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品，向粉碎成50目～150目的细粉中加入3倍～12倍量无水乙醇萃取5h～18h，然后过滤得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，加入料液重量比为1:3～1:30的去离子水，浸泡5min～60min，然后进行胶体磨处理1min～15min，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、将步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为90℃～200℃、提取压力为2.0Mp～4.0Mpa的条件进行亚临界提取，亚临界提取0.1h～3.0h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa的多糖滤液；
步骤四、按照水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的0.1％～3.0％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至4.0～7.0，酶解温度为50℃～60℃，酶解处理0.5h～5h后得到酶解液，然后升温至大于70℃后处理0.2h～4.0h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度55℃以上浓缩，浓缩至相对密度为1.10～1.50，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为65％～92％，搅拌均匀后，静置沉降4h～15h，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
该小分子天山雪莲多糖的制备方法，采用亚临界结合酶水解处理天山雪莲匀浆得到小分子多糖，具体是通过天山雪莲干制品为起始原料，经过五个步骤制得到小分子天山雪莲多糖。该小分子天山雪莲多糖的制备方法能够得到的分子量低于100KDa、提取率高于10％的小分子天山雪莲。解决了现有技术中，制备的天山雪莲多糖不能达到小分子量(低于100KDa)的技术难题，以及提取率低的缺陷。
实施例18。
一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品，向粉碎成80目～120目的细粉中加入5倍～11倍量无水乙醇萃取6h～15h，然后过滤得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，按照料液重量比为1:4～1:28的比例加入去离子水，浸泡6min～55min，然后进行胶体磨处理2min～14min，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、取步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为100℃～180℃、提取压力为2.5Mp～3.5Mpa的条件进行亚临界提取，亚临界提取0.3h～2.5h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液；
步骤四、按照水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的0.5％～2.8％量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至4.3～6.5，酶解温度为53℃～56℃，酶解处理1h～3h后得到酶解液，然后升温至大于80℃后处理0.8h～2.5h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度60℃以上浓缩，浓缩至相对密度为1.20～1.35，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为70％～90％，搅拌均匀后，静置沉降8h～12h，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
该小分子天山雪莲多糖的制备方法，采用亚临界结合酶水解处理天山雪莲匀浆得到小分子多糖，具体是通过天山雪莲干制品为起始原料，经过五个步骤制得到小分子天山雪莲多糖。该小分子天山雪莲多糖的制备方法具有提取率高、且得到的天山雪莲多糖的分子量低的优点。
实施例19。
采用以下原料或者材料，进行小分子天山雪莲多糖的制备。
天山雪莲干制品购自中国科学院新疆理化技术研究所、无水乙醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、纤维素酶购自上海源叶生物科技有限公司。
一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品，向粉碎成50目的细粉中加入3倍量无水乙醇萃取5h，然后过滤得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，加入料液重量比为1:3的去离子水，浸泡5min，然后进行胶体磨处理1min，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、取步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为90℃、提取压力为2.0Mp的条件进行亚临界提取，亚临界提取0.1h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液；
步骤四、按照纤维素酶作为水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的0.1％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至4.0，酶解温度为50℃，酶解处理0.5h后得到酶解液，然后升温至大于70℃后处理0.2h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度55℃以上浓缩，浓缩至相对密度为1.10，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为65％，搅拌均匀后，静置沉降4h，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
本实施例得到的天山雪莲多糖的分子量仅为2.8～88.0kDa，而且提取高达12.40％。与现有技术相比，本实施例得到的小分子天山雪莲多糖的分子量大幅度下降，而提取率明显提升。
实施例20。
采用以下原料或者材料，进行小分子天山雪莲多糖的制备。
天山雪莲干制品购自中国科学院新疆理化技术研究所、无水乙醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、果胶酶购自上海源叶生物科技有限公司。
一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品，向粉碎成150目的细粉中加入12倍量无水乙醇萃取18h，然后过滤得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，加入料液重量比为1:30的去离子水，浸泡60min，然后进行胶体磨处理15min，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、将步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为200℃、提取压力为4.0Mpa的条件进行亚临界提取，亚临界提取3.0h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa的多糖滤液；
步骤四、按照果胶酶作为水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的3.0％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至7.0，酶解温度为60℃，酶解处理5h后得到酶解液，然后升温至大于70℃后处理4.0h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度55℃以上浓缩，浓缩至相对密度为1.50，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为92％，搅拌均匀后，静置15h进行沉降，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
本实施例得到的天山雪莲多糖的分子量仅为1.00～78.30kDa，而且提取高达11.08％。与现有技术相比，本实施例得到的小分子天山雪莲多糖的分子量大幅度下降，而提取率明显提升。
实施例21。
采用以下原料或者材料，进行小分子天山雪莲多糖的制备。天山雪莲干制品购自中国科学院新疆理化技术研究所、无水乙醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司。
一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品，向粉碎成80目的细粉中加入5倍量无水乙醇萃取6h，然后过滤得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，按照料液重量比为1:的比例加入去离子水，浸泡6min，然后进行胶体磨处理2min，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、取步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为100℃、提取压力为2.5Mp的条件进行亚临界提取，亚临界提取0.3h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液；
步骤四、按照胰蛋白酶作为水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的0.5％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至4.3，酶解温度为53℃，酶解处理1h后得到酶解液，然后升温至大于80℃后处理0.8h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度65℃以上浓缩，浓缩至相对密度为1.20，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为70％，搅拌均匀后，静置8h进行沉降，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
本实施例得到的天山雪莲多糖的分子量仅为4.80～52.80kDa，而且提取高达12.65％。与现有技术相比，本实施例得到的小分子天山雪莲多糖的分子量大幅度下降，而提取率明显提升。
实施例22。
采用以下原料或者材料，进行小分子天山雪莲多糖的制备。天山雪莲干制品购自中国科学院新疆理化技术研究所、无水乙醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、木瓜蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司。
小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品，向粉碎成120目的细粉中加入11倍量无水乙醇萃取5h，然后过滤得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，按照料液重量比为1:28的比例加入去离子水，浸泡55min，然后进行胶体磨处理14min，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、取步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为180℃、提取压力为3.5Mpa的条件进行亚临界提取，亚临界提取2.5h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液；
步骤四、按照木瓜蛋白酶作为水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的2.8％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至6.5，酶解温度为56℃，酶解处理3h后得到酶解液，然后升温至大于80℃后处理2.5h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度70℃以上浓缩，浓缩至相对密度为1.35，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为90％，搅拌均匀后，静置12h进行沉降，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
本实施例得到的天山雪莲多糖的分子量仅为8.40～63.00kDa，而且提取高达11.69％。与现有技术相比，本实施例得到的小分子天山雪莲多糖的分子量大幅度下降，而提取率明显提升。
实施例23。
采用以下原料或者材料，进行小分子天山雪莲多糖的制备。天山雪莲干制品购自中国科学院新疆理化技术研究所、无水乙醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、α-淀粉酶购自上海源叶生物科技有限公司。
一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品，向粉碎成60目的细粉中加入10倍量无水乙醇萃取12h，然后过滤得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，按照料液重量比为1:16的去离子水，浸泡30min，然后进行胶体磨处理6min，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、取步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为126℃、提取压力为3.0Mpa进行亚临界提取，亚临界提取1.0h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液；
步骤四、按照α-淀粉酶作为水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的0.5％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至6.0，酶解温度为55℃，酶解处理4h后得到酶解液，然后升温至100℃处理1h，将酶解液进行300目过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度65℃浓缩，浓缩至相对密度为1.30，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为80％，搅拌均匀后，静置10h进行沉降，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
本实施例得到的天山雪莲多糖的分子量仅为1.50～48.20kDa，而且提取高达13.22％。本实施例得到的小分子天山雪莲多糖的分子量最低，而提取率最高。
实施例24。
采用以下原料或者材料，进行小分子天山雪莲多糖的制备。天山雪莲干制品购自中国科学院新疆理化技术研究所、无水乙醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、异淀粉酶酶购自上海源叶生物科技有限公司。
一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品，向粉碎成80目的细粉中加入10倍量无水乙醇萃取12h，然后过滤得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，按照料液重量比为1:20的去离子水，浸泡10min，然后进行胶体磨处理10min，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、取步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为110℃、提取压力为3.0Mpa进行亚临界提取，亚临界提取2h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液；
步骤四、按照异淀粉酶作为水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的1.0％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至5.0，酶解温度为55℃，酶解处理3h后得到酶解液，然后升温至100℃处理1h，将酶解液进行300目过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度65℃浓缩，浓缩至相对密度为1.30，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为80％，搅拌均匀后，静置10h进行沉降，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
本实施例得到的天山雪莲多糖的分子量仅为3.20～68.10kDa，而且提取高达10.88％。与现有技术相比，本实施例得到的小分子天山雪莲多糖的分子量大幅度下降，而提取率明显提升。
实施例25。
采用以下原料或者材料，进行小分子天山雪莲多糖的制备。天山雪莲干制品购自中国科学院新疆理化技术研究所、无水乙醇购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司、β-(1→3)葡聚糖水解酶和α-淀粉酶均购自上海源叶生物科技有限公司。
一种小分子天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、粉碎天山雪莲干制品，向粉碎成100目的细粉中加入6倍量无水乙醇萃取8h，然后过滤得到滤渣；
步骤二、取步骤一得到的滤渣，按照料液重量比为1:8的去离子水，浸泡30min，然后进行胶体磨处理5min，得到天山雪莲匀浆液；
步骤三、取步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为150℃、提取压力为3.0Mpa进行亚临界提取，亚临界提取0.5h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液；
步骤四、按照异淀粉酶作为水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的2.0％％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至4.5，酶解温度为55℃，酶解处理2h后得到酶解液，然后升温至100℃处理1h，将酶解液进行300目过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度65℃浓缩，浓缩至相对密度为1.30，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为80％，搅拌均匀后，静置10h进行沉降，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖。
本实施例的水解酶具体是：β-(1→3)葡聚糖水解酶和α-淀粉酶，且两者重量比为1：1。
本实施例得到的天山雪莲多糖的分子量仅为1.30～80.00kDa，而且提取高达12.06％。与现有技术相比，本实施例得到的小分子天山雪莲多糖的分子量大幅度下降，而提取率明显提升。
对比例1。
一种天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、将天山雪莲干制品粉碎成100目的细粉，取天山雪莲细粉，加入8倍量无水乙醇萃取8h，挥去乙醇，滤渣备用；
步骤二、天山雪莲多糖提取：取步骤一中天山雪莲滤渣加入料液比为1:20的去离子水，浸泡30min，投入反应釜中，按照提取温度为100℃，提取2h后，提取两次，过滤，滤液备用；
步骤三、将步骤二得到的滤液，分别置于65℃浓缩至相对密度为1.30，加入乙醇使溶液中乙醇浓度为80％，搅拌均匀后，静置6-12h后除去乙醇水，多糖沉淀物经干燥后得到两种分子量的天山雪莲多糖进行混合，得到对比样1。
对比例2。
一种天山雪莲多糖的制备方法，包括步骤：
步骤一、将天山雪莲干制品粉碎成100目的细粉，取天山雪莲细粉，加入6倍量无水乙醇萃取8h，挥去乙醇，滤渣备用；
步骤二、天山雪莲匀浆液制备：取步骤一中天山雪莲滤渣加入料液比为1:10的去离子水，浸泡30min，过胶体磨处理5min，得到天山雪莲匀浆液，备用；
步骤三、联合工艺萃取：将步骤二得到的天山雪莲匀浆液投入亚临界提取釜中，按照提取温度为150℃，压力为3Mpa，提取0.5h后，过滤并截留100kDa以上天山雪莲大分子量多糖滤液，收集小于等于100kDa分子量范围的多糖提滤液，备用；
步骤四、将步骤三得到的得分子量大于100kDa天山雪莲多糖提取滤液和分子量小于等于100kDa天山雪莲多糖提取滤液，将两种分子量范围的天山雪莲多糖提取滤液分别置于65℃浓缩至相对密度为1.30，加入乙醇使溶液中乙醇浓度为80％，搅拌均匀后，静置6-12h后除去乙醇水，多糖沉淀物经干燥后得到两种分子量的天山雪莲多糖，然后将这两种分子量的天山雪莲多糖进行混合。
对比实施例19至25、对比例1和对比例2的提取率与天山雪莲多糖分子量结果，如表七所示。
表七提取率与天山雪莲多糖分子量
| 实施例 | 提取率(％) | 分子量范围(kDa) |
| 实施例19 | 12.40 | 2.80～88.00 |
| 实施例20 | 11.08 | 1.00～78.30 |
| 实施例21 | 12.65 | 4.80～52.80 |
| 实施例22 | 11.69 | 8.40～63.00 |
| 实施例23 | 13.22 | 1.50～48.20 |
| 实施例24 | 10.88 | 3.20～68.10 |
| 实施例25 | 12.06 | 1.30～80.00 |
| 对比例1 | 6.17 | 12.0～1105.0 |
| 对比例2 | 8.24 | 6.0～800.0 |
从表七可知，本发明小分子天山雪莲多糖的制备方法的提取率均明显优于对比例1和2的提取率，而得到的天山雪莲多糖的分子量也远小于等于对比例1和2，最小的分子量可达到1.50kDa～48.20kDa，本发明的天山雪莲多糖的分子量均小于等于100kDa。本发明的方法能够有效地制备出分子量范围处于100kDa以内的产品，所制备的天山雪莲多糖分子量分布范围窄，分子量均匀。对比例1、2中的方法，所制备的天山雪莲多糖的分子量分布区间非常宽，从6或者12到800或者1105，所得到的天山雪莲多糖产品分子量均匀度不够一致。
本发明的方法能够制备小分子量的天山雪莲多糖，容易透过肠道粘膜及皮肤屏障，发挥对应功效。
需要说明的是，本发明的天山雪莲多糖提取率的按照计算如下：天山雪莲多糖提取率＝C×V×n/M×100％，其中C为天山雪莲多糖的浓度(mg/mL)、V为体积(L)、N为稀释倍数、M为天山雪莲重量(g)。
本发明的天山雪莲多糖分子量范围测定方法如下：
步骤1、高效凝胶过滤色谱法天山雪莲多糖相对分子质量的测定采用高效凝胶过滤色谱法(high performance gel filtration chromatography，HPGFC)。色谱条件：YMCPack-Diol 200色谱柱(300mm×8.0mm，5μm，200A)；流动相：蒸馏水；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；检测器：示差折光检测器；进样量：20μL
步骤2、标准曲线的制作
分别称取标准葡萄糖和系列标准葡聚糖T-10、T-40、T-500、T-2000适量，用流动相溶解配制成2mg/mL溶液。分别取分子量标准溶液进样，记录洗脱峰的保留时间。先取葡萄糖标液进样，洗脱测得Vt；再用T-2000洗脱测得外水体积V0；分别用T-500、T-40、T-10的标准溶液相继进样，分别求得它们的洗脱体积Ve。相对分子质量Mw与其在凝胶柱上的洗脱体积Ve、分配系数Kav存在如下关系：
Ve＝a－blnMw
Kav＝K1－K2lnMw
Kav＝(Ve－V0)/(Vt－V0)
其中，a、b、K1、K2为常数。
以Kav对lnMw进行线性回归处理，得线性回归方程。
步骤2、样品分子量的测定分别取多糖组分
配制成2mg/mL的溶液，按色谱条件分析，记录样品保留时间。由样品保留时间计算该多糖组分在凝胶柱上的洗脱体积Ve，从而获得分配系数Kav。通过步骤制2作的回归方程得到该多糖组分的相对分子质量Mw。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (5)
1.小分子天山雪莲多糖作为脂联素分泌调节的有效成分在制备修复皮肤屏障的产品中的用途；所述小分子天山雪莲多糖的分子量小于等于100kDa；
所述小分子天山雪莲多糖的制备方法包括：
步骤一、获取天山雪莲滤渣；
步骤二、获取天山雪莲匀浆液；
步骤三、将步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为90℃～200℃、提取压力为2 .0Mp～4 .0Mpa的条件进行亚临界提取，亚临界提取0 .1h～3 .0h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa的多糖滤液；
步骤四、按照水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的0 .1％～3 .0％的量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至4 .0～7 .0，酶解温度为50℃～60℃，酶解处理0 .5h～5h后得到酶解液，然后升温至大于70℃后处理0 .2h～4 .0h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
步骤五、将步骤三得到的分子量小于等于100kDa的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度55℃以上的条件下浓缩，浓缩至相对密度为1 .10～1 .50，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为65％～92％，搅拌均匀后，静置沉降4h～15h，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得分子量小于等于100kDa的多糖。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于：所述小分子天山雪莲多糖的分子量的范围为1 .0kDa～70kDa。
3.根据权利要求2所述的用途,其特征在于：所述小分子天山雪莲多糖的分子量的范围为1 .5kDa～50kDa。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于：所述产品为日化产品形态或药品形态。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，
所述步骤三具体是：取步骤二得到的天山雪莲匀浆液加入亚临界提取釜中，按照提取温度为100℃～180℃、提取压力为2 .5Mp～3 .5Mpa的条件进行亚临界提取，亚临界提取0.3h～2 .5h后，过滤并截留分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液，收集分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液；
所述步骤四具体是：按照水解酶的重量等于天山雪莲大分子量多糖滤液重量的0 .5％～2 .8％量，向步骤三得到的分子量大于100kDa的天山雪莲大分子量多糖滤液中加入水解酶，并调整pH至4 .3～6 .5，酶解温度为53℃～56℃，酶解处理1h～3h后得到酶解液，然后升温至大于80℃后处理0 .8h～2 .5h，将酶解液过滤得到酶解滤液Ⅰ；
所述步骤五具体是：将步骤三得到的分子量小于等于100kDa分子量范围的多糖滤液与步骤四得到的酶解滤液Ⅰ混合，然后在加热温度60℃以上浓缩，浓缩至相对密度为1 .20～1.35，加入乙醇使溶液中的乙醇浓度为70％～90％，搅拌均匀后，静置沉降8h～12h，沉降完成后除去乙醇水溶液得到多糖沉淀物，最后对多糖沉淀物干燥得小分子天山雪莲多糖；
所述水解酶为纤维素酶、果胶酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-淀粉酶、异淀粉酶、β-(1→3)葡聚糖水解酶中的至少一种。
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