CN114525278B - 一种裂蹄木层孔菌的miRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种来自裂蹄木层孔菌的miR‑CM2～CM5的分离和鉴定，尤其涉及miR‑CM2～CM5的应用。所述miR‑CM2～CM5具有SEQ ID NO.1‑4所示的核苷酸序列，有良好的抗炎活性。将miR‑CM2～CM5在皮肤细胞或者组织中应用，可以抵抗脂多糖(LPS)及紫外线辐照诱导的炎症反应，降低炎症因子的表达。本发明还提供含有miR‑CM2，或miR‑CM3，或miR‑CM4，或miR‑CM5的皮肤外用剂，且证实其具有抗炎功效。为抗炎症护肤品的开发提供新的研究方向和研发基础。

Description

一种裂蹄木层孔菌的miRNA及其应用
技术领域：
本发明属于生物技术和医学领域，涉及一种来自裂蹄木层孔菌的miRNA，分别为miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4、miR-CM5的分离和鉴定，以及应用。
背景技术：
皮肤是人体的第一道防线，最易受到外界环境的影响而导致皮肤受损、炎症或者老化。当出现外界刺激时，例如空气污染物等刺激源的接触、紫外线、物理损伤等，皮肤的免疫系统会启动信号，释放出各种各样的炎症因子，引起血流加快、血管的通透性增加，导致皮肤出现炎症反应，症状可能包括发红、发热、瘙痒、敏感和肿胀等。紫外线对皮肤最明显的急性作用之一是诱导炎症。UVB在皮肤中诱导细胞因子、血管活性和神经活性介质的级联反应，共同导致炎症反应并导致“晒伤”。由于经常接触不同的刺激物和过敏原，许多人都患有皮肤炎症，如果不及时治疗，可能会导致严重的健康问题。现代社会，随着人们对护肤重要性不断了解，对护肤知识不断增加，护肤已成为一种日常，且抗炎修复产品已经逐渐作为人们日常使用的化妆品之一。因此，探究和开发抗炎症的护肤品的原料和机制有着较大的现实意义。
脂多糖(LPS)主要由脂质和多糖组成，是革兰氏阴性菌细胞壁外壁的一种成分，是一种常见的内毒素。它可以通过细胞信号转导系统激活单核巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞等，合成和释放多种细胞因子和炎症介质，进而引起一系列炎症反应，导致炎症的出现。利用LPS诱导细胞炎症是细胞炎症造模的方法之一。此外，紫外线照射后，表皮细胞层数以及表皮厚度都会增加，形成更多的死皮，从而加重毛囊的堵塞程度，使得痘痘的炎症恶化。UV辐照可以模拟日晒刺激，构建炎症或者衰老模型。
裂蹄木层孔菌是一种典型的药用真菌，含有多糖，多酚，黄酮等化合物。越来越多的研究表明，裂蹄木层孔菌在抗肿瘤，保肝，减轻炎症反应，控制血糖等方面发挥着显著的调控作用。例如，从它身上分离的多糖可以抑制细胞中各种炎症因子的表达。此外，其水溶性提取物在特应性皮炎中发挥免疫调节作用。裂蹄木层孔菌提取物被列入已使用化妆品原料目录(2021年版)。目前，裂蹄木层孔菌提取物现已经被用于各种护肤品和化妆品的配方中。
microRNA(miRNA)是一类长度约为19-25nt的内源性非编码RNA。miRNA参与基因转录后调控，能够调节细胞和机体的生长，发育，并与人类的疾病相关。越来越多的研究表明，外源性的植物miRNAs可以调节哺乳动物靶基因的表达，实现跨界调控。例如，张辰宇发现金银花中的miR2911可以被小鼠吸收，通过靶向甲流病毒而抑制病毒复制。本申请发现裂蹄木层孔菌中的miRNA能够对人源的皮肤细胞进行跨界调节，发挥抵抗炎症的活性。这在抗炎护肤品的研发中有巨大的潜在应用价值。
发明内容：
本发明的目的是提供一种裂蹄木层孔菌的miRNA，分别为miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4、miR-CM5及其应用，其中miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4、miR-CM5均可减少炎症模型中炎症因子的表达，在抗炎护肤品的开发和应用中有潜在的价值。
本发明提供的技术方案之一，是一种来自裂蹄木层孔菌的miRNA，分别为miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5；
所述miR-CM2，具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；
所述miR-CM3，具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；
所述miR-CM4，具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；
所述miR-CM5，具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；
进一步地，所述miR-CM2的前体序列MIR-CM2，具有SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列；
进一步地，所述miR-CM3的前体序列MIR-CM3，具有SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；
进一步地，所述miR-CM4的前体序列MIR-CM4，具有SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；
进一步地，所述miR-CM5的前体序列MIR-CM5，具有SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
进一步地，编码所述前体序列MIR-CM2的DNA，具有SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列；
进一步地，编码所述前体序列MIR-CM3的DNA，具有SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列；
进一步地，编码所述前体序列MIR-CM4的DNA，具有SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列；
进一步地，编码所述前体序列MIR-CM5的DNA，具有SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。
本发明提供的技术方案之二，是上述miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5的应用；
进一步地，所述应用是miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5在护肤品、化妆品或美妆产品中的应用，以及在制备预防或治疗光老化产品中的应用，特别是在制备抗炎产品中的应用。
本发明提供的技术方案之三，是含有上述miR-CM2，或miR-CM3，或miR-CM4，或miR-CM5的皮肤外用剂；
进一步地，所述皮肤外用剂包括但不限于护肤品、化妆品、或涂抹剂等；
所述涂抹剂包括但不限于油剂、水剂、膏剂或凝胶剂等；
进一步地，所述的miR-CM2，或miR-CM3，或miR-CM4，或miR-CM5在皮肤外用剂中的添加量为0.2％-5％(重量百分比)；
进一步地，所述皮肤外用剂以水、精华液、凝胶、乳液、肌底液或霜中至少一种形式存在；
进一步地，一种含有miR-CM2的乳液，包含如下成分(按重量百分比计)：EDTA二钠0.01-0.05％，甘油2-5％，黄原胶0.05-0.2％，对羟基苯乙酮0.1-0.3％，Montanov L-乳化剂0.5-3％，ARLACEL170乳化剂0.5-3％，甘油硬脂酸酯0.1-0.5％，鲸蜡硬脂醇0.5-3％，辛酸/癸酸甘油三酯2-6％，聚二甲基硅氧烷0.5-3％，甲基丙二醇0.1-0.5％，聚乙烯亚胺-1500 0.5-3％，透明质酸钠0.5-3％，miR-CM2 0.2-5％，余量为去离子水；
更进一步地，上述乳液中添加的miR-CM2，可以是单链核酸分子，也可以是双链核酸分子；所述单链核酸分子是根据SEQ ID NO.1中的核苷酸序列合成的核酸分子；所述双链核酸分子是根据SEQ ID NO.1中的核苷酸序列及其互补序列合成的双链核酸分子；
进一步地，一种含有miR-CM3的乳液，包含如下成分(按重量百分比计)：EDTA二钠0.01-0.05％，甘油2-5％，黄原胶0.05-0.2％，对羟基苯乙酮0.1-0.3％，Montanov L-乳化剂0.5-3％，ARLACEL170乳化剂0.5-3％，甘油硬脂酸酯0.1-0.5％，鲸蜡硬脂醇0.5-3％，辛酸/癸酸甘油三酯2-6％，聚二甲基硅氧烷0.5-3％，甲基丙二醇0.1-0.5％，聚乙烯亚胺-1500 0.5-3％，透明质酸钠0.5-3％，miR-CM3 0.2-5％，余量为去离子水；
更进一步地，上述乳液中添加的miR-CM3，可以是单链核酸分子，也可以是双链核酸分子；所述单链核酸分子是根据SEQ ID NO.2中的核苷酸序列合成的核酸分子；所述双链核酸分子是根据SEQ ID NO.2中的核苷酸序列及其互补序列合成的双链核酸分子；
进一步地，一种含有miR-CM4的乳液，包含如下成分(按重量百分比计)：EDTA二钠0.01-0.05％，甘油2-5％，黄原胶0.05-0.2％，对羟基苯乙酮0.1-0.3％，Montanov L-乳化剂0.5-3％，ARLACEL170乳化剂0.5-3％，甘油硬脂酸酯0.1-0.5％，鲸蜡硬脂醇0.5-3％，辛酸/癸酸甘油三酯2-6％，聚二甲基硅氧烷0.5-3％，甲基丙二醇0.1-0.5％，聚乙烯亚胺-1500 0.5-3％，透明质酸钠0.5-3％，miR-CM4 0.2-5％，余量为去离子水；
更进一步地，上述乳液中添加的miR-CM4，可以是单链核酸分子，也可以是双链核酸分子；所述单链核酸分子是根据SEQ ID NO.3中的核苷酸序列合成的核酸分子；所述双链核酸分子是根据SEQ ID NO.3中的核苷酸序列及其互补序列合成的双链核酸分子；
进一步地，一种含有miR-CM5的乳液，包含如下成分(按重量百分比计)：EDTA二钠0.01-0.05％，甘油2-5％，黄原胶0.05-0.2％，对羟基苯乙酮0.1-0.3％，Montanov L-乳化剂0.5-3％，ARLACEL170乳化剂0.5-3％，甘油硬脂酸酯0.1-0.5％，鲸蜡硬脂醇0.5-3％，辛酸/癸酸甘油三酯2-6％，聚二甲基硅氧烷0.5-3％，甲基丙二醇0.1-0.5％，聚乙烯亚胺-1500 0.5-3％，透明质酸钠0.5-3％，miR-CM5 0.2-5％，余量为去离子水；
更进一步地，上述乳液中添加的miR-CM5，可以是单链核酸分子，也可以是双链核酸分子；所述单链核酸分子是根据SEQ ID NO.4中的核苷酸序列合成的核酸分子；所述双链核酸分子是根据SEQ ID NO.4中的核苷酸序列及其互补序列合成的双链核酸分子；
优选地，miR-CM2(或miR-CM3或miR-CM4或miR-CM5)的添加量为0.5-1％；
优选地，所述含有miR-CM2(或miR-CM3或miR-CM4或miR-CM5)的乳液，包含如下成分(按重量百分比计)：EDTA二钠0.03％，甘油4％，黄原胶0.1％，对羟基苯乙酮0.2％，Montanov L-乳化剂1％，ARLACEL170乳化剂1％，甘油硬脂酸酯0.3％，鲸蜡硬脂醇1％，辛酸/癸酸甘油三酯4％，聚二甲基硅氧烷1％，甲基丙二醇0.35％，聚乙烯亚胺-1500 1％，透明质酸钠1％，miR-CM2(或miR-CM3或miR-CM4或miR-CM5)0.75％，余量为去离子水。
本发明提供的技术方案之四，是上述含有miR-CM2，或miR-CM3，或miR-CM4，或miR-CM5的皮肤外用剂的应用，特别是上述含有miR-CM2，或miR-CM3，或miR-CM4，或miR-CM5的乳液的应用，所述乳液可以抵抗紫外线诱导的炎症，减少由于紫外辐照导致的表皮厚度的增加。
本发明的有益效果：
本发明筛选出了一种新型裂蹄木层孔菌miRNA(miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4、miR-CM5)及其前体MIR-CM2，MIR-CM3，MIR-CM4，MIR-CM5。miR-CM2/CM3/CM4/CM5有良好的抗炎活性，将miR-CM2/CM3/CM4/CM5在皮肤细胞或者组织中应用，可以抵抗脂多糖(LPS)及紫外线辐照诱导的炎症反应，降低炎症因子的表达。
本发明提供了一种含有miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5基础护肤品的配方，且证实其具有抗炎功效。为抗炎症护肤品的开发提供新的研究方向和研发基础。
本发明公开的miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5，可以为裂蹄木层孔菌提取物抗炎症护肤品的研究提供机制支持，为抗炎症护肤品研发提供更广阔的空间。
附图说明：
图1为miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4和miR-CM5的前体MiR-CM2、MiR-CM3、MiR-CM4和MiR-CM5的二级结构。
图2为miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4和miR-CM5在LPS刺激条件下对皮肤细胞的保护作用。
图3为在皮肤细胞中应用miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5时炎症因子的表达情况(IL-1β，IL-6，TNF-α，NF-κB)。
图2、图3各柱状图中按顺序从左至右均依次为：Ctrl组、LPS组、LPS+miR-CM2、LPS+miR-CM3组、LPS+miR-CM4组、LPS+miR-CM5组。
图4在小鼠皮肤中应用miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5护肤品前后皮肤表皮厚度的变化；
其中，左为小鼠皮肤的HE染色；右为对应的表皮厚度统计图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径中获得。
在本发明中，miR代表miRNA；
在本发明中，miR-CM2/CM3/CM4/CM5代表“miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5”；
本发明所使用的的裂蹄木层孔菌(Phellinus linteus)购自北纳生物(BNCC)，菌株编号BNCC109781。
实施例1miRNA的筛选和鉴定
1.样品的制备
RNA样品的提取可来自于裂蹄木层孔菌的溶胞物，或者来自于裂蹄木层孔菌的外泌体。对于溶胞物：于PBS中高压剪切裂蹄木层孔菌，经高速离心获取上清液，此上清液即为裂蹄木层孔菌的溶胞物。对于外泌体：裂蹄木层孔菌的外泌体是通过将裂蹄木层孔菌均质后，经差速离心法获得。首先在3000×g下离心30分钟以去除死细胞，收集上清液并以10000×g离心60分钟以去除细胞碎片。所得上清液在150000×g下进一步离心90分钟，将外泌体(沉淀部分)悬浮在PBS缓冲液中。
2.RNA提取和质量检测
利用Trizol(赛默飞，美国)法提取外泌体样品的总RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整度，电泳显示28S和18S条带清晰，无降解；用超微量分光光度计(天根，背景)检测RNA的浓度和纯度，OD260/280值在1.8～2.2之间，OD260/230≥2.0，表明RNA纯度合格。RNA样品浓度≥200ng/μL，总量≥2μg。RNA初步检测质量合格，以保证下游高质量small RNA-seq文库的构建。进行进一步质控和miRNA测序。
3.文库构建：
检验合格的RNA用于构建miRNA文库，取适量总RNA进行接头连接反应，利用成熟miRNA的5’端有一个磷酸基团，3’端为羟基，这一区别于其他RNA的结构，在T4 RNA连接酶2和T4 RNA连接酶的作用下，在两端加上已知序列的3’接头和5’接头。对于已连接5’和3’接头的RNA，利用与接头上序列互补的逆转录合成第一链的cDNA。以上一步反应产物作为模板，利用PCR合成、扩增miRNA的双链文库。利用聚丙烯酰氨凝胶电泳来分离插入片段大小在22-24nt的miRNA文库。对构建好的测序文库进行质检和定量评估是否适合上机。
4.上机测序
对于质检合格的样品经过稀释后，根据不同样品测序通量要求，按相应比例对样品进行上机。采用Illumina高通量测序平台，双端测序策略对文库进行测序。
5.生物信息分析(包含新miRNA预测及表达分析)
为了保证信息分析质量，对测序得到的原始测序序列(raw reads)进行过滤，得到clean reads用于后续分析。利用FASTX-Toolkit软件进行质量过滤。对质控后的序列进行小RNA长度分布统计，miRNA集中在21nt或22nt。此外，将质控后的序列与miRBase数据库中对应物种的成熟miRNA序列进行BLAST比对，以及与Rfam数据库和参考基因组比对，以便对测序结果进行初步评价。对不同类型Small RNA分类注释结果。
新miRNA预测及表达分析。由于miRNA前体的发卡结构可以用来预测miRNA，因此可以将miRNA比对到基因组序列上并截取其两侧序列进行RNA二级结构预测，并结合Dicer酶结合位点以及二级结构的自由能等信息预测得到新的miRNA。采用miRDeep2软件，将reads和参考基因组进行比对，根据reads和基因组比对的结果，结合近缘物种的同源miRNA序列，比如RNAfold等RNA二级结构，预测识别该物种的新miRNA成熟体(Star miRNA与maturemiRNA)和前体序列，并统计各样本新miRNA的表达情况。
经过上述分离与鉴定，获得的四种来自裂蹄木层孔菌的新型miRNA，分别命名为miR-CM2，miR-CM3，miR-CM4，miR-CM5。其二级结构如图1所示，由图可知，均形成类似miRNA前体的稳定茎环结构，其成熟序列分别如序列表SEQ ID NO.1～NO.4所示，其前体序列分别如序列表SEQ ID NO.5～NO.8所示，其前体序列的编码基因分别如序列表SEQ ID NO.9～NO.12所示。
SEQ ID NO.1(miR-CM2成熟序列)：uccucaagguuauccgua(18bp)。
SEQ ID NO.2(miR-CM3成熟序列)：ccggugcgcucucgacagcc(20bp)。
SEQ ID NO.3(miR-CM4成熟序列)：acguguggauccagacggguu(21bp)。
SEQ ID NO.4(miR-CM5成熟序列)：uauuccauuccguccauccu(20bp)。
实施例2miR-CM2～CM5减少LPS引起的HaCaT细胞的炎症损伤
1.CCK8实验
1)细胞样品的制备
人类永生化表皮细胞(HaCaT细胞)培养在添加10％的胎牛血清(BI，以色列)和100U/mL的青霉素链霉素混合液(美仑，中国)的DMEM(Gibco，美国)中培养，并在37℃，5％浓度的CO2培养箱中生长；
向上述经过培养的HaCaT细胞中通过Lipo2000转染试剂(赛默飞，美国)分别转染miR-CM2 mimics，miR-CM3 mimics，miR-CM4 mimics，miR-CM5 mimics，预保护24h。向每孔(96孔板)中加入终浓度1μg/mL的LPS，刺激6h后进行CCK8检测(实验组)。
对照组(Ctrl组)：上述人类永生化表皮细胞(HaCaT细胞)正常培养不做任何处理(无预保护，无LPS刺激)；模型组(LPS组)不进行预保护，仅LPS刺激；实验组(LPS+miR-CM2/CM3/CM4/CM5组)进行预保护，且LPS刺激。
转染说明：以24孔板为例，其他培养材料参考说明书转染规模调整，所有数量和体积均是按每孔计算。细胞接种于500μL不含抗生素的培养基中，使其在转染时长至50％融合。转染时，每孔细胞用量如下：用50μL Opti-MEM培养基分别稀释20pmol miR-CM2mimics、miR-CM3 mimics、miR-CM4 mimics或miR-CM5 mimics，轻轻混匀。取1μL Lipo2000在50μL Opti-MEM培养基中稀释，室温孵育5分钟。将前两步溶液混合(使总体积为100μL)，轻轻混匀，室温放置20分钟，形成100μL转染液。在每孔细胞中加入100μL转染液，轻轻摇匀。(本发明涉及转染步骤如未特别说明均采用此方法)。
miR-CM2 mimics，miR-CM3 mimics，miR-CM4 mimics，miR-CM5 mimics，即miR-CM2类似物，miR-CM3类似物，miR-CM4类似物，miR-CM5类似物，上述类似物均为双链序列，其中：
miR-CM2 mimics：
正义链序列为：5'-uccucaagguuauccgua-3'(同miR-CM2，SEQ ID NO.1)；
反义链序列为：5'-cggauaaccuugaggauu-3'(SEQ ID NO.13)。
miR-CM3 mimics：
正义链序列为：5'-ccggugcgcucucgacagcc-3'(同miR-CM3，SEQ ID NO.2)；
反义链序列为：5'-cugucgagagcgcaccgguu-3'(SEQ ID NO.14)。
miR-CM4 mimics：
正义链序列为：5'-acguguggauccagacggguu-3'(同miR-CM4，SEQ ID NO.3)；
反义链序列为：5'-cccgucuggauccacacguuu-3'(SEQ ID NO.15)。
miR-CM5 mimics：
正义链序列为：5'-uauuccauuccguccauccu-3'(同miR-CM5，SEQ ID NO.4)；
反义链序列为：5'-gauggacggaauggaauauu-3'(SEQ ID NO.16)。
2)细胞活力检测
利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)(APExBIO，美国)进行细胞活力的检测。
向上述96孔板的每个孔中加入10μl CCK-8溶液。将培养板放在培养箱中孵育1小时。使用酶标仪测量450nm处的吸光度。细胞增殖越多，颜色越深；细胞毒性越强，颜色越浅。
由图2可知，1μg/ml LPS刺激显著降低了HaCaT细胞的细胞活力，降低了HaCaT细胞的存活率。而miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5预保护明显改善了1μg/ml LPS引发的HaCaT细胞的活力下降。结果表明，miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5预保护可以使细胞损伤程度减轻，减轻LPS处理导致的细胞炎症损伤中的细胞活力下降的状况。
2.实时荧光定量PCR检测基因表达
1)细胞样品的制备
细胞样品的制备同实施例2步骤1。
2)提取总RNA
利用Trizol(赛默飞，美国)法提取样品的总RNA。RNA样品的完整度和纯度检测同实施例1步骤2。
3)逆转录
利用HifairⅢ1st Strand cDNA SHnthesis SuperMix for qPCR(gDNA digesterplus)(翌圣，上海)试剂盒进行逆转录合成cDNA。去除基因组残留基因组DNA及逆转录体系如下：
在RNase-free离心管中配制如下混合液，轻轻吹打混匀。42℃孵育2min。
逆转录反应体系配制(20μL体系)
25℃，5min；55℃，15min；85℃，5min。-20℃保存获得的cDNA。
4)qPCR实验
利用Hieff UNICON Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix(翌圣，上海)进行qPCR。
用于检测的引物如下：
IL-1β上游引物：CCACAGACCTTCCAGGAGAATG(SEQ ID NO.17)；
IL-1β下游引物：GTGCAGTTCAGTGATCGTACAGG(SEQ ID NO.18)。
IL-6上游引物：AGACAGCCACTCACCTCTTCAG(SEQ ID NO.19)；
IL-6下游引物：TTCTGCCAGTGCCTCTTTGCTG(SEQ ID NO.20)。
TNF-α上游引物：CTCTTCTGCCTGCTGCACTTTG(SEQ ID NO.21)；
TNF-α下游引物：ATGGGCTACAGGCTTGTCACTC(SEQ ID NO.22)。
NF-κB上游引物：GCAGCACTACTTCTTGACCACC(SEQ ID NO.23)；
NF-κB下游引物：TCTGCTCCTGAGCATTGACGTC(SEQ ID NO.24)。
采用β-actin为内参基因：
β-actin上游引物：CACCATTGGCAATGAGCGGTTC(SEQ ID NO.25)；
β-actin下游引物：AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT(SEQ ID NO.26)。
将cDNA原液稀释4倍，在冰上配制qPCR反应体系(20μl)：
充分混匀后，吸取反应液20μL至反应孔中，封好热封膜，短暂离心。在PCR仪上检测。qPCR反应程序如下：预变性阶段，95℃，2min；40个循环阶段(包括变性，退火/延伸)，变性95℃，10s，退火/延伸60℃，30s；熔解曲线阶段(仪器默认设置)；获得实验数据用于后续结果分析。
实验至少重复三次。以内参基因做参考，计算各个炎症因子的相对表达量。结果(图3)显示，转染miR-CM2 mimics、miR-CM3 mimics、miR-CM4 mimics或miR-CM5 mimics进行预保护的HaCaT细胞的炎症因子相对表达量不同程度地低于LPS刺激组。说明miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5预保护可以减轻由于LPS刺激导致的炎症因子的增多，减轻炎症反应。
结果表明，miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5预保护可以减少LPS引起的HaCaT细胞的炎症损伤。
实施例3miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5护肤乳液减少紫外辐照导致的小鼠皮肤炎症中表皮的厚度
1)miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5护肤乳液的配制
miR-CM2护肤乳液的配方：按重量百分比计算，EDTA二钠0.03％，甘油4％，黄原胶0.1％，对羟基苯乙酮0.2％，Montanov L-乳化剂1％，ARLACEL170乳化剂1％，甘油硬脂酸酯0.3％，鲸蜡硬脂醇1％，辛酸/癸酸甘油三酯4％，聚二甲基硅氧烷1％，甲基丙二醇0.35％，聚乙烯亚胺-1500 1％，透明质酸钠1％，miR-CM2 0.75％，余量为去离子水。
miR-CM3护肤乳液的组成同上述miR-CM2护肤乳液的配方，仅将miR-CM2替换为miR-CM3即可；
miR-CM4护肤乳液的组成同上述miR-CM2护肤乳液的配方，仅将miR-CM2替换为miR-CM4即可；
miR-CM5护肤乳液的组成同上述miR-CM2护肤乳液的配方，仅将miR-CM2替换为miR-CM5即可；
根据上述配方，按照如下方法进行配置：
首先，将EDTA二钠，甘油，黄原胶，对羟基苯乙酮，Montanov L-乳化剂，ARLACEL170乳化剂，甘油硬脂酸酯，鲸蜡硬脂醇，辛酸/癸酸甘油三酯，聚二甲基硅氧烷，甲基丙二醇、水预先混合乳化得到乳液；
随后，将聚乙烯亚胺-1500和透明质酸钠预先混合成溶液，向该溶液中加入miR-CM2(或miR-CM3或miR-CM4或miR-CM5，所采用的miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4、miR-CM5是分别根据序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列进行合成获得的核酸分子)，轻柔混合，静置25min得到包含miR-CM2(或miR-CM3或miR-CM4或miR-CM5)的混合溶液；
最后，于40℃以下将包含miR-CM2(或miR-CM3或miR-CM4或miR-CM5)的混合溶液加入到前述预先混合乳化得到的乳液中，得到miR-CM2(或miR-CM3或miR-CM4或miR-CM5)护肤乳液。
2)小鼠光老化模型的建立
将昆明小鼠(雌性，6-8周)随机分为七组(n＝5，1组对照组、4组实验组、1组模型组1、1组模型组2)，背部脱毛处理。各组小鼠正常饲养；其中，对照组不给予任何处理；实验组、模型组1和模型组2进行紫外辐照(UVA辐照，频率为每周三次，剂量为8J/cm2，持续4周)，实验组每次辐照后分别给予步骤1)制备的四种护肤乳液涂抹治疗；模型组2每次辐照后，给予不含miR-CM2/CM3/CM4/CM5的基础护肤乳液(制备方法同步骤1)，仅去除miR-CM2/CM3/CM4/CM5成分)涂抹治疗；模型组1仅紫外照射，不给与治疗。4周后对所有小鼠实施安乐死。收集背部皮肤组织，固定在福尔马林中。
3)HE染色
按照标准程序，将组织脱水并包埋在石蜡中。获取4μm厚的切片，使用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(索莱宝，北京)染色。
苏木精-伊红染色法(HematoxHlin-Eosin staining)，简称HE染色法，是病理学常规制片中最基本的染色方法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
石蜡切片于二甲苯中脱蜡2次，每次5-10min。梯度乙醇(100％、95％、85％、75％)复水，每梯度3min。蒸馏水2min。苏木素染液染色2-20min(具体时间根据染色结果和实验要求调整)，蒸馏水洗去浮色。分化液分化3min，自来水冲洗2次，每次2min。置于伊红染液30s-2min，蒸馏水洗2-3s，快速脱水。梯度乙醇(75％乙醇、85％乙醇、95％乙醇和100％乙醇)各浸洗2-3s。100％乙醇浸洗1min，二甲苯透明两次，每次1min，中性树胶封片，镜下观察。
皮肤结构主要分为三层：表皮、真皮和皮下组织。HE染色能对组织细胞的各种成分着色，用来全面观察组织构造。皮肤组织经过HE染色，能轻易得到皮肤的组织结构染色图片，用于评判各种皮肤指标，例如，表皮厚度。HE染色结果用来通过imageJ软件来统计表皮厚度，统计结果如图4右所示。
对照组对应图4中的Ctrl组。
实验组对应图4中的：UV+miR-CM2组，UV+miR-CM3组，UV+miR-CM4组，UV+miR-CM5组。
模型组1对应图4中的UV组。
模型组2对应图4中的UV+基础乳液组。
结果(如图4所示)发现，紫外辐照后，模型组1(即图4中的UV组)较对照组(即图4中的Ctrl组)表皮厚度明显增加，表明小鼠光老化模型建模成功。且模型组1与模型组2(即图4中的UV+基础乳液组)表皮厚度无显著差异，说明涂抹去除miR-CM2/CM3/CM4/CM5成分的乳液无法保护小鼠皮肤抵抗紫外辐照导致的表皮厚度的增加，而miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5护肤乳液保护(即图4中的UV+miR-CM2组，UV+miR-CM3组，UV+miR-CM4组，UV+miR-CM5组)可以抵抗由于紫外线辐照导致的表皮厚度的增加，说明miR-CM2、miR-CM3、miR-CM4或miR-CM5护肤乳液能够极显著地抑制紫外线辐照导致的皮肤炎症，减少治疗组表皮的厚度，减少由于紫外辐照导致的炎症而产生的皮肤不规则增生。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海澄穆生物科技有限公司
<120> 一种裂蹄木层孔菌的miRNA及其应用
<130> 1
<160> 26
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> RNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 1
uccucaaggu uauccgua 18
<210> 2
<211> 20
<212> RNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 2
ccggugcgcu cucgacagcc 20
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 3
acguguggau ccagacgggu u 21
<210> 4
<211> 20
<212> RNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 4
uauuccauuc cguccauccu 20
<210> 5
<211> 114
<212> RNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 5
ccguugaaca ucucccguga gacucuucaa caaaacaaga uccucaaggu uauccguaag 60
aacaucguca agaagugccu ugaccucuuc caggaaaucu ccgaggacaa ggac 114
<210> 6
<211> 108
<212> RNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 6
cccuugguug ucuaccguuc auaaaaucgg guuggcuuga gcuaggguag agcgcagcac 60
uucugcugga uccggugcgc ucucgacagc ccuuaaaaga ccaaggua 108
<210> 7
<211> 108
<212> RNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 7
cgaguccuug uggauaccag gcugguacau gugaggaugc ggauggaaau gcuuugacga 60
guccguugaa cguguggauc cagacggguu cuuacgucuu gaucgccu 108
<210> 8
<211> 109
<212> RNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 8
ccaugcugcu ggcguccgua uuccauuccg uccauccugu uuaucucagg augggacgaa 60
ugcgaaugcg uauuugagua ucgcgucguc guuucuucgu cuccccagu 109
<210> 9
<211> 114
<212> DNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 9
ccgttgaaca tctcccgtga gactcttcaa caaaacaaga tcctcaaggt tatccgtaag 60
aacatcgtca agaagtgcct tgacctcttc caggaaatct ccgaggacaa ggac 114
<210> 10
<211> 108
<212> DNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 10
cccttggttg tctaccgttc ataaaatcgg gttggcttga gctagggtag agcgcagcac 60
ttctgctgga tccggtgcgc tctcgacagc ccttaaaaga ccaaggta 108
<210> 11
<211> 108
<212> DNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 11
cgagtccttg tggataccag gctggtacat gtgaggatgc ggatggaaat gctttgacga 60
gtccgttgaa cgtgtggatc cagacgggtt cttacgtctt gatcgcct 108
<210> 12
<211> 109
<212> DNA
<213> 裂蹄木层孔菌（Phellinus linteus）
<400> 12
ccatgctgct ggcgtccgta ttccattccg tccatcctgt ttatctcagg atgggacgaa 60
tgcgaatgcg tatttgagta tcgcgtcgtc gtttcttcgt ctccccagt 109
<210> 13
<211> 18
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 13
cggauaaccu ugaggauu 18
<210> 14
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 14
cugucgagag cgcaccgguu 20
<210> 15
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 15
cccgucugga uccacacguu u 21
<210> 16
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<400> 16
gauggacgga auggaauauu 20
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccacagacct tccaggagaa tg 22
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
gtgcagttca gtgatcgtac agg 23
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
agacagccac tcacctcttc ag 22
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ttctgccagt gcctctttgc tg 22
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
ctcttctgcc tgctgcactt tg 22
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
atgggctaca ggcttgtcac tc 22
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gcagcactac ttcttgacca cc 22
<210> 24
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tctgctcctg agcattgacg tc 22
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
caccattggc aatgagcggt tc 22
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
aggtctttgc ggatgtccac gt 22

Claims (6)

1. 一种来自裂蹄木层孔菌的miRNA，其特征在于，具体为miR-CM2，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.如权利要求1所述的一种来自裂蹄木层孔菌的miRNA，其特征在于，
所述miR-CM2的前体序列MIR-CM2，核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
编码所述前体序列MIR-CM2的DNA，核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。
3.权利要求1所述来自裂蹄木层孔菌的miRNA的类似物，其特征在于，
miR-CM2类似物为miR-CM2 mimics：
正义链序列为：5'-uccucaagguuauccgua-3'，如SEQ ID NO.1所示;
反义链序列为：5'-cggauaaccuugaggauu-3'，如SEQ ID NO.13所示。
4.权利要求1所述的来自裂蹄木层孔菌的miRNA或权利要求3所述类似物的应用，其特征在于，是miR-CM2或其类似物在制备预防皮肤炎症产品中的应用。
5. 含有权利要求1所述miR-CM2的皮肤外用剂，其特征在于，包含如下成分：EDTA二钠0.01-0.05%，甘油2-5%，黄原胶0.05-0.2%，对羟基苯乙酮0.1-0.3%，Montanov L-乳化剂0.5-3%，ARLACEL170乳化剂0.5-3%，甘油硬脂酸酯0.1-0.5%，鲸蜡硬脂醇0.5-3%，辛酸/癸酸甘油三酯2-6%，聚二甲基硅氧烷0.5-3%，甲基丙二醇0.1-0.5%，聚乙烯亚胺-1500 0.5-3%，透明质酸钠0.5-3%，miR-CM2 0.2-5%，余量为去离子水。
6. 如权利要求5所述的皮肤外用剂，其特征在于，包含如下成分：EDTA二钠0.03%，甘油4%，黄原胶0.1%，对羟基苯乙酮0.2%，Montanov L-乳化剂1%，ARLACEL170乳化剂1%，甘油硬脂酸酯0.3%，鲸蜡硬脂醇1%，辛酸/癸酸甘油三酯4%，聚二甲基硅氧烷1%，甲基丙二醇0.35%，聚乙烯亚胺-1500 1%，透明质酸钠1%，miR-CM2 0.75%，余量为去离子水。
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