CN113876645B - 一种须松萝提取物及其应用和含其的皮肤外用剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种须松萝提取物及其应用和含其的皮肤外用剂。该须松萝提取物包括糖类、氨基酸、酚类化合物和最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA；其中，须松萝提取物的干重为7～9g/kg；糖类的浓度为3～5g/L；氨基酸的浓度为100～300mg/L；酚类化合物的浓度为400～600mg/L；最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA的浓度为10～30mg/L。本发明的须松萝提取物作用机理明确、安全可靠，具有抗衰老、促进细胞增殖、增强表皮屏障、改善老化皮肤的功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种须松萝提取物及其应用和含其的皮肤外用剂。
背景技术
随着护肤品市场的不断发展和日趋成熟，消费者对于自身的皮肤状况日趋关注，希望能通过护肤品维持健康年轻的皮肤状态，看到切实有效的护肤效果，因此护肤品活性物的功效机理研究水平需要提升，对于功效机理的阐释也越来越深入，不能仅局限于单纯的对表象进行描述，需要融合生物技术深入阐释皮肤状态的变化机理。随着细胞生物学技术水平的不断发展，研究者对皮肤生物学的研究也不断加深，发现了和皮肤功能结构相关的更多的靶点和调控机理。
皮肤是人体最大的器官，覆盖全身，主要承担着保护身体、排汗、感觉冷热和压力等功能，使体内各种组织和器官免受物理性、机械性、化学性和病原微生物性的侵袭。
皮肤衰老分为外源性老化和内源性老化两种形式。外源性老化主要是环境因素引起的老化，如紫外线辐射等，理论上可以通过日常的物理防晒或使用具有防晒功能的护肤品预防减缓。而内源性老化是由基因随着时间流逝产生的程序性变化，发生机理复杂，在组织学结构上的表现可包括表皮屏障变薄、细胞自我更新缓慢、真皮基质合成减少、弹性蛋白纤维断裂、胶原纤维变短等。虽然随着年龄的增加内源性衰老不可抗拒，但通过护肤品持续的日常护理仍可在一定程度上延缓皮肤内源性衰老的进程。
随着细胞生物学技术水平的不断发展，研究皮肤衰老机制的方法也更加多元化，例如从分子水平上检测与皮肤衰老息息相关的mRNA、microRNA的表达水平，检测胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白、透明质酸等重要的胞外基质的含量；或者从细胞水平上检测皮肤细胞的新陈代谢、自我更新能力；或者从组织水平上，利用体外重组3D皮肤模型或离体皮肤模型模拟皮肤衰老过程中结构组分和功能的变化。这些方法可以作为皮肤衰老问题研究的量化标准，使抗衰老护肤品原料筛选的过程更加精确高效，从而为产品开发打下坚实基础。
因此，研究如何提高皮肤抗衰老的能力、抗老化成分的表达，对于延缓皮肤衰老具有重要意义。
天然植物来源的提取物以其悠久的应用历史和卓越的、多重的功效，越来越多的应用于护肤领域。天然产品相较于化学合成产品也更容易被消费者接受。
地衣是由真菌和藻类联合形成的共生复合体，它既不同于真菌，又有别于藻类，无根、茎、叶的分化，是比较特殊的形态学与生物学实体，在植物界中占有重要的地位。全世界己描述的地衣约有500个属，26000个种，其分布极为广泛。由于地衣所具有的特殊共生关系，它能产生一些特殊化学物质，因此在药用抗菌、香料、食品、染料、日用化工和环境监测等方面有重要作用。目前对于地衣学的研究比较少，具体到松萝属植物的研究，则更为少见。
子囊地衣纲茶渍目松萝科松萝属松萝在我国分布于西藏、云南、四川、黑龙江、吉林、内蒙古、陕西、甘肃、浙江、福建、台湾等地，主要位于高海拔、气候湿润、阳光充足、空气污染程度低的地区。古籍《诗经》中称松萝为女萝，在《本草纲目》中称为松上寄生，又名松落、树挂、天蓬草、龙须草、云雾草、海风藤、金线草等。有研究报道，松萝药用全草，能清热解毒、止血、止咳化痰、清肝、疟疾、外伤出血、毒蛇咬伤等病症，传统应用于植物药和抗菌素的原料。(彭锋等.松萝属地衣植物的研究进展.林产化学与工业.2012,(1):111-118)
松萝属植物目前已经发现的有孔松萝(U.cavernosa)、花松萝(U.florid)、红髓松萝(U.roseola)、红皮松萝(U.rubescens)、深红松萝(U.rubicunda)、光滑松萝(U.barbataglabrescens)、须松萝(U.barbata)、桦树松萝(U.betulina)、环裂松萝(U.diffracta)、长松萝(U.longissima)、粗皮松萝(U.montis-fuji)、粗毛松萝(U.dasypoga)、拟长松萝(U.pectinata)、亚花松萝(U.subfloridana)、环基松萝环裂亚种(U.handoensis)、灌松萝(U.thomsonii)、亚灌松萝(U.arborea)、树松萝(U.dendritiea)、小塔松萝(U.dorogawaensis)和胡子松萝(U.comosa)等。
松萝属植物的化学成分大致分为包含于细胞内的初生代谢产物和次生代谢产物。初生代谢物包括核酸、蛋白质、类胡萝卜素、多元醇、游离氨基酸、维生素以及地衣多糖，次生代谢产物则包括松萝酸、草酸盐、碳酸盐、少量的萜类、甾醇和氨基化合物等物质。
根据国家食品药品监督管理总局发布的2015版《已使用化妆品原料名称目录》(IECIC2015)，松萝属植物中光滑松萝(Usnea barbata glabrescens)提取物和须松萝(Usnea barbata)提取物可用于化妆品原料中。
须松萝(Usnea barbata)为地衣门子囊衣纲松萝科松萝属植物，是由真菌和藻类联合形成的共生复合体，是比较特殊的形态学与生物学实体；生长于树干和树枝上，对环境的要求很高，空气中有细微的污染就无法存活，因此是很好的环境检测器，有须松萝生长的地方往往标志着当地有很好的生态环境条件。有研究报道，须松萝的主要成分之一松萝酸，被认为是一种天然的抗菌剂、除臭剂，在化妆品和个人护理品中作为天然防腐剂防止细菌和真菌生长(Ash,Michael；Irene Ash(2004)."Lichen(Usnea barbata)extract".Handbook of Preservatives.Synapse Info Resources.p.437.ISBN 9781890595661.)。由于须松萝具有消炎属性，还可作为愈合伤口的成分。现有技术中，与须松萝有关的发明也大多将其作为一种天然防腐剂来应用在化妆品、个人护理品的配方当中。
目前现有技术中还没有将须松萝提取物作为天然活性物用于护肤品，从而实现促进细胞增殖、增强人体表皮屏障、延缓皮肤衰老或改善老化皮肤的报道。
发明内容
本发明所解决的技术问题是针对现有技术中缺乏可用于提高皮肤抗衰老能力、促进细胞增殖、增强表皮屏障或改善老化皮肤的活性物质的问题，而提供了一种须松萝提取物及其制备方法和应用。本发明的须松萝提取物作用机理明确、安全可靠，具有抗衰老、促进细胞增殖、增强表皮屏障、改善老化皮肤的功效。
本发明人通过大量研究发现：(1)须松萝提取物中含有对皮肤具有抗衰老作用的活性成分；(2)须松萝提取物对于增强表皮屏障有显著的促进作用；(3)须松萝提取物具有对老化皮肤的改善作用；适用于具有抗衰老、增强表皮屏障或改善老化皮肤功效的皮肤外用剂中，具有较佳的应用前景。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供的技术方案之一为：提供一种须松萝提取物。该须松萝提取物包括糖类、氨基酸、酚类化合物和最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA；
其中，所述须松萝提取物的干重为7～9g/kg；所述糖类的浓度为3～5g/L；所述氨基酸的浓度为100～300mg/L；所述酚类化合物的浓度为400～600mg/L；所述最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA的浓度为10～30mg/L。
本发明提供的技术方案之二为：提供一种须松萝提取物。该须松萝提取物的制备方法包括下述步骤：
(1)将须松萝与水混合，得到混合物；
(2)向步骤(1)所述的混合物中加入乙二胺四乙酸四钠，加热，得到混合物；
(3)将步骤(2)所述的混合物提纯，得到须松萝提取物。
步骤(1)中，所述须松萝可为须松萝干燥粉末。
其中，所述须松萝干燥粉末的粒径可根据本领域常规进行选择。
所述须松萝的生长地区可为本领域常规的须松萝生长地区，优选为云南省，例如云南省泛喜马拉雅地区。
所述水可为蒸馏水。
所述须松萝与所述水的质量比可为(0.2～1)：5，优选为(0.25～0.5):5。
步骤(2)中，所述乙二胺四乙酸四钠的浓度可为2～15mM，优选为10mM。
加入所述乙二胺四乙酸四钠后，还包括调节pH值的操作。优选地，将调节pH值至10.5～11；使核膜在内的细胞膜分解、细胞裂解和DNA双链结构的两股链被分开。
所述加热的温度可为50～60℃，优选为55～58℃。
所述加热的时间可为1.5～3h，优选为2～2.5h。
步骤(3)中，所述提纯前优选对步骤(2)中所述混合物进行离心分离，得到须松萝粗提物溶液。
其中，所述离心的方法可为本领域常规的离心方法，以除去步骤(2)中所述混合物中的固体物质。所述离心的离心力可为4000g。所述离心的时间可为10min。
所述离心后，可检测所述须松萝粗提物溶液的pH值。
其中，当所述须松萝粗提物溶液的pH值不为6～6.5时，可将所述须松萝粗提物溶液的pH值调节至6～6.5。
检测所述须松萝粗提物溶液的pH值或调节所述须松萝粗提物溶液的pH值后，可将所述须松萝粗提物溶液稀释后提纯。
所述提纯的方法可为本领域常规的提纯方法，以澄清所述须松萝粗提物溶液，例如过滤，优选为连续过滤。
所述连续过滤的设备可为过滤器，优选为孔隙度递降的过滤器。
所述连续过滤优选为最后采用孔隙度为0.2μm的过滤器，其目的可为过滤除菌。
所述提纯后，可检测所述须松萝提取物的pH值。
其中，当所述须松萝提取物的pH值不为6～8时，将所述须松萝提取物的pH值调节至6～8，优选为6～6.5。
本发明提供的技术方案之三为：提供一种如前所述的须松萝提取物在制备抗衰老活性剂、增强表皮屏障活性剂和改善老化皮肤活性剂中的一种或多种的应用。
本发明中，所述抗衰老活性剂可为本领域常规的具有抗衰老、抗氧化和抗皱功能中的一种或多种的活性剂。
所述增强表皮屏障活性剂可为本领域常规的具有增强物理屏障和/或免疫屏障功能的活性剂。
所述改善老化皮肤活性剂可为本领域常规的具有改善皮肤松弛、改善皮肤弹性和改善皮肤严重皱纹功能中的一种或多种的活性剂。
本发明中，所述须松萝提取物在所述抗衰老活性剂中的用量可为0.0001～10％，优选为0.1～2％；百分比为所述须松萝提取物占所述抗衰老活性剂的质量百分比。
本发明中，所述须松萝提取物在所述增强表皮屏障活性剂中的用量可为0.0001～10％，优选为0.1～2％；百分比为所述须松萝提取物占所述增强表皮屏障活性剂的质量百分比。
本发明中，所述须松萝提取物在所述改善老化皮肤活性剂中的用量可为0.0001～10％，优选为0.1～2％；百分比为所述须松萝提取物占所述改善老化皮肤活性剂的质量百分比。
本发明提供的技术方案之四为：提供一种皮肤外用剂。该皮肤外用剂含有如前所述的须松萝提取物；所述须松萝提取物的用量为0.0001～10％，优选为0.1～2％；百分比为所述须松萝提取物占所述皮肤外用剂的质量百分比。
本发明中，所述皮肤外用剂可为本领域常规的皮肤外用剂，例如皮肤局部施用的剂型。所述皮肤局部可为常规的表皮性组织，例如面部皮肤或头皮。所述皮肤外用剂与皮肤和粘膜组织相容，施用时无不适感。
所述皮肤外用剂可覆盖本领域常规的化妆品形式，例如化妆水、精华液、乳液或乳霜。所述皮肤外用剂中可含有生理学上可接受的介质。
本发明中须松萝提取物在制备皮肤外用剂中的配方可以由本领域技术人员常规调整。
当所述皮肤外用剂为化妆水时，所述化妆水优选包含下述重量百分比的组分：甘油5％，多元醇类A 3～6％，甜菜碱1％，泛醇0.5％，甘草酸二钾0.05～0.1％，聚乙二醇-320.5％，表面活性剂A 0.15～0.2％，防腐剂A 0.4～0.45％，黄原胶0～0.15％，香料0.03％和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100％。
其中，所述须松萝提取物的重量百分比可为0.0001～10％，优选为0.0025～0.15％，更优选为0.01～5％，例如1％。
所述的多元醇类A可为丁二醇、1,2-戊二醇和双丙甘醇中的一种或多种。所述表面活性剂A可为聚山梨醇酯-20和PEG-40氢化蓖麻油中的一种或多种。所述防腐剂A可为羟苯甲酯和/或苯氧乙醇。所述黄原胶可为糖类，优选为经黄单胞杆菌发酵，产生的一种胞外微生物多糖。
当所述皮肤外用剂为精华液时，所述精华液优选包含下述重量百分比的组分：甘油5％，多元醇类B 3～6％，泛醇1％，甘草酸二钾0.1％，尿囊素0.1％，表面活性剂B 0.05～3.6％，防腐剂B 0.25～0.45％，黄原胶0.2～0.4％，丙烯酸树脂Pemulen TR-2 0.3％，香料0.05％和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100％。
其中，所述须松萝提取物的重量百分比可为0.0001～10％，优选为0.0025～0.15％，更优选为0.01～5％，例如1％。
所述的多元醇类B可为丁二醇和/或1,3-丙二醇。所述表面活性剂B可为聚甘油-2油酸酯和/或聚甘油-10油酸酯。所述防腐剂B可为羟苯丙酯、羟苯甲酯和苯氧乙醇中的一种或多种。所述丙烯酸树脂Pemulen TR-2可为一种丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物。所述黄原胶可为糖类，优选为经黄单胞杆菌发酵，产生的一种胞外微生物多糖。
当所述皮肤外用剂为乳液时，所述乳液优选包含下述重量百分比的组分：甘油5％，1,3-丙二醇5％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，聚二甲基硅氧烷2％，乳化剂A165 2％，油类C 2～3％，异硬脂酸异丙酯3％，鲸蜡硬脂醇0.5％，防腐剂C 0.3％，黄胶原0.5％，EDTA二钠0.1％，三乙醇胺和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100％。
其中，所述须松萝提取物的重量百分比可为0.0001～10％，优选为0.0025～0.15％，更优选为0.01～5％，例如1％。
所述三乙醇胺的重量百分比可为将所述乳液的pH值调节至5.5～7的重量百分比。所述油类C可为矿油和/或异十六烷。所述防腐剂C可为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。所述乳化剂A165可为本领域常规的市售的乳化剂A165，优选为含有甘油硬脂酸酯和PEG-100硬脂酸酯的乳化剂A165。所述黄原胶可为糖类，优选为经黄单胞杆菌发酵，产生的一种胞外微生物多糖。
当所述皮肤外用剂为乳霜时，所述乳霜优选包含下述重量百分比的组分：甘油5％，1,3-丙二醇5％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，聚二甲基硅氧烷2％，乳化剂A165 2％，油类D 2～8％，异硬脂酸异丙酯3％，鲸蜡硬脂醇2～3％，防腐剂D 0.3％，丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物2％，EDTA二钠0.1％，三乙醇胺和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100％。
其中，所述须松萝提取物的重量百分比可为0.0001～10％，优选为0.0025～0.15％，更优选为0.01～5％，例如1％。
所述三乙醇胺的重量百分比可为将所述乳霜的pH值调节至5.5～7的重量百分比。所述油类D可为矿油和/或异十六烷。所述防腐剂D可为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
(1)本发明中的须松萝提取物可作为天然活性物用于皮肤外用剂，实现抗衰老、增强表皮屏障或改善老化皮肤的作用，从而延缓皮肤衰老。
(2)本发明中须松萝提取物的制备方法能够减少提取过程中植物中小分子量RNA的损失，较好的富集150个以下核苷酸的小分子量RNA，保持提取物的活性。
(3)本发明中通过分子水平、细胞水平和组织水平上的实验，证实了须松萝提取物可调控与皮肤衰老表型相关的microRNA分子hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p的表达量；3D皮肤模型实验结果显示须松萝提取物能够显著增强人体表皮屏障，以及改善人体真表皮组织的结构，从而改善老化皮肤。
附图说明
图1为效果实施例1中对照组和须松萝提取物处理组细胞中microRNA表达量的对比结果示意图；
图2为效果实施例1中须松萝提取物对人真皮成纤维细胞DNA含量的作用结果示意图；
图3为效果实施例1中对照组和须松萝提取物处理组3D人重组表皮显微结构对比示意图；
图4为效果实施例1中对照组和须松萝提取物处理组3D人重组表皮显微结构对比示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
在本发明具体实施例中，涉及到对比例，各试验组除了应有的区别外，其余试验环境和原材料等均保持一致。
实施例1须松萝提取物的制备
(1)将须松萝干燥粉末与蒸馏水混合，得到混合物；其中，须松萝干燥粉末与蒸馏水的质量比为0.5：5。
(2)向步骤(1)的混合物中加入10mM乙二胺四乙酸四钠，调节pH值至10.5～11，在55℃条件下加热2h，得到混合物；
(3)将步骤(2)的混合物在4000g条件下离心10min，除去固体物质，得到须松萝粗提物溶液；检测pH值，若不为6～6.5，将pH值调节至6～6.5；再将须松萝粗提物溶液稀释；
将稀释后的须松萝粗提物溶液提纯，采用孔隙度递降的过滤器进行连续过滤，以澄清须松萝粗提物溶液，最后用孔隙度0.2μm的过滤器过滤除菌；得到须松萝提取物，检测所述须松萝提取物的pH值，若不为6～8，将pH值调节至6～8，优选为6～6.5。
其中，须松萝采自云南省境内的泛喜马拉雅地区。
实施例2测试须松萝提取物中各组分含量
具体方法如下：
通过Dubois等人(M.Dubois et al.1956.Anal.Chem.28:350-356)描述的含量测定改进方案测定提取物的总糖含量。该分析包括将原料溶于浓硫酸中，然后与苯酚反应，以形成染色络合物。在分光光度计490nm处读络合物的吸光度。利用葡萄糖标准曲线测定糖含量。
通过Moore等人(MOORE S et al.J Biol Chem.1948Oct；176(1):367-88.)公布的方案测定提取物的氨基酸含量，提取物的游离氨基酸含量是利用茚三酮试剂破坏胺基和羧基官能团后，通过形成染色络合物来估算的。在分光光度计570nm处读络合物的吸光度。利用氨基酸库作为标准品测定总氨基酸含量。
利用Folin-Ciocalteu(Singleton V.L.et al.Am J Enol Vitic.1965,16,144-158.)含量测定法测定提取物的多酚含量。样品中的多酚类化合物与Folin-Ciocalteu试剂反应，试剂的氧化作用会产生蓝色。在分光光度计760nm处读取样品的吸光度。内容物用没食子酸标准曲线测定的等量没食子酸来表示。
利用(Agilent Application Note,Publication Number 5988-7650EN,2002)对小分子量RNA实施鉴定，该分析仪可以通过核苷酸(包括小分子量RNA核苷酸)分析专用电子芯片来实现微型电泳。其能够测定最低限度几微升提取物中所含成分的多少和浓度。
测试结果表明：实施例1制得的须松萝提取物为棕色，包括3～5g/L糖类、100～300mg/L氨基酸、400～600mg/L酚类化合物和10～30mg/L最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。
实施例3含有须松萝提取物的化妆水
按下述组分及用量，配制成化妆水，百分比是指各组分在化妆水中的重量百分比：
甘油5％，多元醇类A 3～6％，甜菜碱1％，泛醇0.5％，甘草酸二钾0.05～0.1％，聚乙二醇-32 0.5％，表面活性剂A 0.15～0.2％，防腐剂A 0.4～0.45％，黄原胶0～0.15％，香料0.03％和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100％。
其中，须松萝提取物的重量百分比为1％。
多元醇类B为丁二醇和1,3-丙二醇。表面活性剂B为聚甘油-2油酸酯和聚甘油-10油酸酯。防腐剂B为羟苯丙酯、羟苯甲酯和苯氧乙醇。丙烯酸树脂Pemulen TR-2为一种丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物。黄原胶为经黄单胞杆菌发酵，产生的一种胞外微生物多糖。
按照本领域常规的化妆水的制备方法，制得本实施例中的皮肤外用剂。
实施例4含有须松萝提取物的精华液
按下述组分及用量，配制成精华液，百分比是指各组分在精华液中的重量百分比：
甘油5％，多元醇类B 3～6％，泛醇1％，甘草酸二钾0.1％，尿囊素0.1％，表面活性剂B 0.05～3.6％，防腐剂B 0.25～0.45％，黄原胶0.2～0.4％，丙烯酸树脂Pemulen TR-20.3％，香料0.05％和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100％。
其中，须松萝提取物的重量百分比为2％。
多元醇类B为丁二醇和1,3-丙二醇。表面活性剂B为聚甘油-2油酸酯和聚甘油-10油酸酯。防腐剂B为羟苯丙酯、羟苯甲酯和苯氧乙醇。丙烯酸树脂Pemulen TR-2为一种丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物。黄原胶为经黄单胞杆菌发酵，产生的一种胞外微生物多糖。
按照本领域常规的精华液的制备方法，制得本实施例中的皮肤外用剂。
实施例5含有须松萝提取物的乳液
按下述组分及用量，配制成乳液，百分比是指各组分在乳液中的重量百分比：
甘油5％，1,3-丙二醇5％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，聚二甲基硅氧烷2％，乳化剂A165 2％，油类C 2～3％，异硬脂酸异丙酯3％，鲸蜡硬脂醇0.5％，防腐剂C 0.3％，黄胶原0.5％，EDTA二钠0.1％，三乙醇胺和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100％。
其中，须松萝提取物的重量百分比为0.5％。
三乙醇胺的重量百分比为将乳液的pH值调节至5.5～7的重量百分比。
油类C为矿油和异十六烷。防腐剂C为羟苯甲酯和羟苯丙酯。乳化剂A165为含有甘油硬脂酸酯和PEG-100硬脂酸酯的乳化剂A165。黄原胶为经黄单胞杆菌发酵，产生的一种胞外微生物多糖。
按照本领域常规的乳液的制备方法，制得本实施例中的皮肤外用剂。
实施例6含有须松萝提取物的乳霜
按下述组分及用量，配制成乳霜，百分比是指各组分在乳霜中的重量百分比：
甘油5％，1,3-丙二醇5％，泛醇1％，生育酚乙酸酯0.5％，聚二甲基硅氧烷2％，乳化剂A165 2％，油类D 2～8％，异硬脂酸异丙酯3％，鲸蜡硬脂醇2～3％，防腐剂D 0.3％，丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物2％，EDTA二钠0.1％，三乙醇胺和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100％。
其中，须松萝提取物的重量百分比可为1.5％。
三乙醇胺的重量百分比为将乳霜的pH值调节至5.5～7的重量百分比。
油类D为矿油和异十六烷。防腐剂D为羟苯甲酯和羟苯丙酯。
效果实施例1须松萝提取物的活性检测
(一)须松萝提取物对皮肤衰老表型相关的microRNA分子的作用
1.检测年轻皮肤样本和老化皮肤样本中的差异化microRNA分子
(1)皮肤样本的获得
新鲜脸部皮肤样本购自上海芯超生物科技有限公司，年轻皮肤样本供体为年龄介于30-40岁之间、上海出生且居住在上海的健康女性，共计8例，该群组平均年龄为(33.5±2.6)岁；老化皮肤样本供体为年龄大于50岁、上海出生且居住在上海的健康女性，共计7例，该群组平均年龄为(62.0±9.7)岁。具体地，经常规整形外科手术后收集到皮肤组织，尽快对皮肤组织进行处理。对皮肤组织进行剪切，皮肤厚度不超过0.5cm，剪成0.5cm×1cm×1cm(厚度×长度×宽度)的小组织块，然后将剪切好的这些小组织块放到无菌的冻存管中，每管加入2ml RNAlater(Sigma公司)浸没过组织保存；每个冻存管中放入1块切好的皮肤组织，放到深低温冰箱-80℃存储。
(2)皮肤样本总RNA抽提
采用专用于抽提普通组织、细胞miRNA的mirVanaTM miRNA Isolation Kitwithout phenol试剂(Ambion公司)，根据生产厂商提供的标准操作流程进行样品的总RNA抽提，抽提所得总RNA经Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent technologies公司)电泳质检合格后备用。
(3)高通量microRNA芯片检测表达谱
采用覆盖2549个人类相关microRNA的Agilent Human miRNA芯片，数据库来源于microRNA数据库miRBase V21.0版本。总RNA样品去磷酸化、变性、连接后，进行芯片杂交。完成后洗涤，扫描芯片并读取数据、归一化，得到年轻皮肤样本和老化皮肤样本的microRNA芯片表达谱。
(4)筛选归纳年轻皮肤样本和老化皮肤样本的差异化microRNA
利用AgiMicroRna R分析工具包对年轻皮肤样本和老化皮肤样本中microRNA的差异表达进行了研究，该分析工具包基于limma线性模型来处理检验数据；得到年轻皮肤样本和老化皮肤样本之间表达水平有显著差异的microRNA分子，其表达量差异如表1所示。
表1.芯片实验筛选到的在年轻皮肤和老化皮肤中具有显著差异的microRNA分子列表
由表1可知，microRNA分子hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p在年轻皮肤和老化皮肤中具有非常显著的差异(P<0.01)，能否降低皮肤细胞中hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p的含量，可用来作为定量评估活性物对皮肤抗衰老作用的指标之一。
2.用实施例1制得的须松萝提取物处理皮肤细胞
使用完全培养基培养人真皮成纤维细胞(Promocell，C-12302)，当细胞生长至约80％汇合时，用胰酶消化细胞，计数后调整接种密度，以5×104个细胞/孔的水平接入6孔细胞培养板中，每孔添加培养液总共3mL，在37℃、5％CO2的条件下培养72h。
3.考察须松萝提取物对人真皮成纤维细胞microRNA的影响
为每个培养孔更换不含血清的DMEM基础培养基，对细胞进行饥饿处理。细胞饥饿16h后做加样处理，样品组用含有0.1％须松萝提取物的DMEM基础培养基培养，对照组为DMEM基础培养基，每组各设置3组重复孔。把6孔细胞培养板放回37℃、5％CO2的条件下培养3h。最后弃上清，用TRIZOL试剂吹打细胞直至溶液澄清后收集起来，按照前文所述的总RNA抽提实施例中的方法，抽提对照组和须松萝提取物组的总RNA。
用RT-PCR方法测试hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p的含量。具体地，microRNA逆转录引物直接从ABI公司购买获得，将皮肤样本的总RNA反转录成cDNA，然后采用ReverTra Ace qPCR Kit(TOYOBO公司)进行RT-PCR反应，检测标志物的表达水平，以U6为内参。反应体系操作方法按照Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI公司)的说明手册进行，384孔板加样，每个样本设3个反应孔。反应条件为：95℃反应15s，60℃反应1min，40个循环。待测microRNA的表达量通过与内参U6比较得到的2-ΔCt值进行衡量，结果如图1所示。
由图1可知，对照组细胞中hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p的表达量均为100％，0.1％须松萝提取物处理组细胞中hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p的表达量分别为83％和65％，与对照组相比均发生了显著降低(***P<0.001)。因此，0.1％须松萝提取物能降低细胞中皮肤衰老表型相关的microRNA分子hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p的表达量。
(二)须松萝提取物对人真皮成纤维细胞增殖的作用
将人真皮成纤维细胞以5×103个细胞/孔的水平接入96孔细胞培养板中，培养72小时后移除上清液，为每个培养孔更换不含血清的DMEM基础培养基，对细胞进行饥饿处理。细胞饥饿16h后做加样处理，样品组共9组，分别用含有0.01％、0.02％、0.05％、0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、5％实施例1中制得的须松萝提取物的DMEM基础培养基培养，对照组为DMEM基础培养基，每组各设置6组重复孔。细胞继续在37℃、5％CO2的条件下培养48h，然后用Picogreen试剂盒测定细胞的DNA含量。
DNA含量测试结果以相对于对照组的百分比表示，即对照组的细胞活性和DNA含量为100％，大于100％则表示有促进作用，结果如图2所示，与对照组相比，添加0.01％-5％须松萝提取物能够显著提高细胞内DNA含量(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)，对人真皮成纤维细胞的增殖具有促进作用。
(三)须松萝提取物在3D重组人表皮模型上的功效测试
利用年龄52岁的供体腹部新鲜皮肤样本，在无菌环境下进行表皮角质细胞原代分离。用碘伏和75％酒精消毒皮肤各1次，PBS清洗，用剪刀剪除皮下脂肪组织及血管，将皮肤切成小块后用Dispase II(Roche公司)在4℃条件下消化15个小时，将真皮层和表皮层分离。表皮层用0.05％胰酶(Invitrogen)消化13分钟后1000rpm离心10分钟，弃去上清液，用K-FSM培养液(Invitrogen)重悬细胞后接种至162cm2方瓶中，置于细胞培养箱中37℃、5％CO2、饱和湿度下进行培养。
待细胞层生长至70～80％汇合时收获细胞，接种到匹配12孔细胞培养板的悬挂式细胞培养小室(Millipore)中构建3D人重组表皮模型。3D人重组表皮模型接种24小时后进行第一次换液，对照组仍使用表皮模型培养液，处理组采用添加了1％实施例1制得的须松萝提取物的表皮模型培养液。之后按照这种分组培养方案进行每日换液，直到3D人重组表皮模型培养结束。3D人重组表皮模型培养完成后，用中性福尔马林固定24小时，然后进行脱水和石蜡包埋，制作成石蜡切片后用常规HE染色法进行染色，在显微镜下拍摄3D重组人表皮模型显微结构。
对照组和1％须松萝提取物处理组的3D人重组表皮模型显微结构如图3所示，其中3(a)为对照组，3(b)为1％须松萝提取物处理组。和对照组相比，1％须松萝提取物处理组的表皮整体结构和颗粒层形态都更加规则，角质层屏障显著更厚更完整。表皮层总体厚度是衡量表皮状态最重要的指标之一，处理组的表皮厚度显著优于对照组。因此，须松萝提取物对于增强表皮屏障有显著的促进作用。
(四)须松萝提取物在3D重组人全层皮肤模型上的功效测试
体外扩增从老化供体皮肤中提取出的表皮角质细胞和真皮成纤维细胞，将其接种到生物相容性支架材料上进行3D体外培养，构建起6个3D重组人全层皮肤模型。从接种后24h开始分组培养，对照组3个皮肤模型使用常规培养基培养，处理组3个皮肤模型使用添加了1％实施例1制得的须松萝提取物的常规培养基进行培养，至第42天终止3D培养。
本实施例所构建的老化重组皮肤模型中，在3D培养终止的第42天，收获1％须松萝提取物处理组和对照组的皮肤模型，置于10％福尔马林溶液中固定后进行石蜡包埋和切片，采用常规Masson’s Trichrome染色法进行组织化学染色，并用显微镜进行显微结构图像拍摄。
结果如图4，其中4(a)为对照组，4(b)为1％须松萝提取物处理组。可见对照组的老化重组人全层皮肤模型整体组织结构欠佳，而1％须松萝提取物处理组的皮肤模型呈现出更完整的组织结构，具有形态良好的表皮基底层、厚度更佳的黏连层以及完好分化的角质层。从组织化学染色结果可明显看出须松萝提取物对老化皮肤的改善作用。
综上所述，效果实施例1～4中的分子、细胞和皮肤模型测试，证实了本申请中须松萝提取物能够调控与皮肤衰老表型相关的microRNA分子hsa-miR-30c-2-3p和hsa-miR-125b-1-3p的表达量，可以促进人真皮成纤维细胞的增殖活性，且通过3D皮肤模型上的验证了须松萝提取物在抗皮肤衰老、增强皮肤屏障方面具备显著的功效，在皮肤外用剂的应用中具备很好的应用前景。
Claims (33)
1.一种须松萝提取物，其特征在于其包括糖类、氨基酸、酚类化合物和最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA；
其中，所述须松萝提取物的干重为7~9g/kg；所述糖类的浓度为3~5g/L；所述氨基酸的浓度为100~300mg/L；所述酚类化合物的浓度为400~600mg/L；所述最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA的浓度为10~30mg/L；
其中，所述须松萝提取物的制备方法包括如下步骤：
（1）将须松萝与水混合，得到混合物；
（2）向步骤（1）所述的混合物中加入乙二胺四乙酸四钠，加热，得到混合物；
其中，所述乙二胺四乙酸四钠的浓度为2~15mM；
加入所述乙二胺四乙酸四钠后，还包括调节pH值的操作；调节pH值至10.5~11；
所述加热的温度为50~60℃；
所述加热的时间为1.5~3h；
（3）将步骤（2）所述的混合物提纯，得到须松萝提取物。
2.如权利要求1所述的须松萝提取物，其特征在于：步骤（1）中，所述须松萝为须松萝干燥粉末；
和/或，所述须松萝的生长地区为云南省；
和/或，所述水为蒸馏水；
和/或，所述须松萝与所述水的质量比为（0.2~1）：5。
3.如权利要求1所述的须松萝提取物，其特征在于：所述须松萝的生长地区为云南省泛喜马拉雅地区；
和/或，所述须松萝与所述水的质量比为（0.25~0.5）:5。
4.如权利要求1所述的须松萝提取物，其特征在于：步骤（2）中，所述乙二胺四乙酸四钠的浓度为10mM；
和/或，所述加热的温度为55~58℃；
和/或，所述加热的时间为2~2.5h。
5.如权利要求1所述的须松萝提取物，其特征在于：步骤（3）中，所述提纯前对步骤（2）中所述混合物进行离心分离，得到须松萝粗提物溶液。
6.如权利要求1~5中任一项所述的须松萝提取物，其特征在于：检测所述须松萝粗提物溶液的pH值或调节所述须松萝粗提物溶液的pH值后，将所述须松萝粗提物溶液稀释后提纯；
和/或，所述提纯的方法为连续过滤；
和/或，所述提纯后，检测所述须松萝提取物的pH值。
7.如权利要求1~5中任一项所述的须松萝提取物，其特征在于：所述提纯后，当所述须松萝提取物的pH值不为6~8时，将所述须松萝提取物的pH值调节至6~8。
8.如权利要求1~5中任一项所述的须松萝提取物，其特征在于：所述提纯后，当所述须松萝提取物的pH值不为6~8时，将所述须松萝提取物的pH值调节至6~6.5。
9.如权利要求5所述的须松萝提取物，其特征在于：
所述离心的离心力为4000g；
和/或，所述离心的时间为10min；
和/或，所述离心后，检测所述须松萝粗提物溶液的pH值。
10.如权利要求5所述的须松萝提取物，其特征在于：所述离心后，当所述须松萝粗提物溶液的pH值不为6~6.5时，将所述须松萝粗提物溶液的pH值调节至6~6.5。
11.一种如权利要求1~10中任一项所述的须松萝提取物在制备抗衰老活性剂、增强表皮屏障活性剂和改善老化皮肤活性剂中的一种或多种的应用。
12.如权利要求11所述的须松萝提取物在制备抗衰老活性剂、增强表皮屏障活性剂和改善老化皮肤活性剂中的一种或多种的应用，其特征在于：所述抗衰老活性剂为具有抗衰老、抗氧化和抗皱功能中的一种或多种的活性剂；
和/或，所述增强表皮屏障活性剂为具有增强物理屏障和/或免疫屏障功能的活性剂；
和/或，所述改善老化皮肤活性剂为具有改善皮肤松弛、改善皮肤弹性和改善皮肤严重皱纹功能中的一种或多种的活性剂。
13.如权利要求11或12所述的须松萝提取物在制备抗衰老活性剂、增强表皮屏障活性剂和改善老化皮肤活性剂中的一种或多种的应用，其特征在于：所述须松萝提取物在所述抗衰老活性剂中的用量为0.0001~10%；百分比为所述须松萝提取物占所述抗衰老活性剂的质量百分比；
和/或，所述须松萝提取物在所述增强表皮屏障活性剂中的用量为0.0001~10%；百分比为所述须松萝提取物占所述增强表皮屏障活性剂的质量百分比；
和/或，所述须松萝提取物在所述改善老化皮肤活性剂中的用量为0.0001~10%；百分比为所述须松萝提取物占所述改善老化皮肤活性剂的质量百分比。
14.如权利要求11或12所述的须松萝提取物在制备抗衰老活性剂、增强表皮屏障活性剂和改善老化皮肤活性剂中的一种或多种的应用，其特征在于：所述须松萝提取物在所述抗衰老活性剂中的用量为0.1~2%；百分比为所述须松萝提取物占所述抗衰老活性剂的质量百分比；
和/或，所述须松萝提取物在所述增强表皮屏障活性剂中的用量为0.1~2%；百分比为所述须松萝提取物占所述增强表皮屏障活性剂的质量百分比；
和/或，所述须松萝提取物在所述改善老化皮肤活性剂中的用量为0.1~2%；百分比为所述须松萝提取物占所述改善老化皮肤活性剂的质量百分比。
15.一种皮肤外用剂，其特征在于：所述皮肤外用剂含有如权利要求1~8中任一项所述的须松萝提取物；所述须松萝提取物的用量为0.0001~10%，百分比为所述须松萝提取物占所述皮肤外用剂的质量百分比。
16.如权利要求15所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述须松萝提取物的用量为0.1~2%，百分比为所述须松萝提取物占所述皮肤外用剂的质量百分比；
和/或，所述皮肤外用剂为皮肤局部施用的剂型。
17.如权利要求15所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述皮肤外用剂为化妆水、精华液、乳液或乳霜。
18.如权利要求17所述的皮肤外用剂，其特征在于：
所述皮肤外用剂为化妆水，所述化妆水包含下述重量百分比的组分：甘油5%，多元醇类A 3~6%，甜菜碱1%，泛醇0.5%，甘草酸二钾0.05~0.1%，聚乙二醇-32 0.5%，表面活性剂A0.15~0.2%，防腐剂A 0.4~0.45%，黄原胶0~0.15%，香料0.03%和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100%；其中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.0001~10%；所述多元醇类A为丁二醇、1,2-戊二醇和双丙甘醇中的一种或多种；所述表面活性剂A为聚山梨醇酯-20和PEG-40氢化蓖麻油中的一种或多种；所述防腐剂A为羟苯甲酯和/或苯氧乙醇。
19.如权利要求18所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述化妆水中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.0025~0.15%。
20.如权利要求18所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述化妆水中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.01~5%。
21.如权利要求18所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述化妆水中，所述须松萝提取物的重量百分比为1%。
22.如权利要求17所述的皮肤外用剂，其特征在于：
所述皮肤外用剂为精华液，所述精华液包含下述重量百分比的组分：甘油5%，多元醇类B 3~6%，泛醇1%，甘草酸二钾0.1%，尿囊素0.1%，表面活性剂B 0.05~3.6%，防腐剂B 0.25~0.45%，黄原胶0.2~0.4%，丙烯酸树脂Pemulen TR-2 0.3%，香料0.05%和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100%；其中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.0001~10%；所述多元醇类B为丁二醇和/或1,3-丙二醇；所述表面活性剂B为聚甘油-2油酸酯和/或聚甘油-10油酸酯；所述防腐剂B为羟苯丙酯、羟苯甲酯和苯氧乙醇中的一种或多种。
23.如权利要求22所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述精华液中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.0025~0.15%。
24.如权利要求22所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述精华液中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.01~5%。
25.如权利要求22所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述精华液中，所述须松萝提取物的重量百分比为1%。
26.如权利要求17所述的皮肤外用剂，其特征在于：
所述皮肤外用剂为乳液，所述乳液包含下述重量百分比的组分：甘油5%，1,3-丙二醇5%，泛醇1%，生育酚乙酸酯0.5%，聚二甲基硅氧烷2%，乳化剂A165 2%，油类C 2~3%，异硬脂酸异丙酯3%，鲸蜡硬脂醇0.5%，防腐剂C 0.3%，黄胶原0.5%，EDTA二钠0.1%，三乙醇胺和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100%；其中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.0001~10%；所述油类C为矿油和/或异十六烷；所述防腐剂C为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。
27.如权利要求26所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述乳液中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.0025~0.15%。
28.如权利要求26所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述乳液中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.01~5%。
29.如权利要求26所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述乳液中，所述须松萝提取物的重量百分比为1%。
30.如权利要求17所述的皮肤外用剂，其特征在于：
所述皮肤外用剂为乳霜，所述乳霜包含下述重量百分比的组分：甘油5%，1,3-丙二醇5%，泛醇1%，生育酚乙酸酯0.5%，聚二甲基硅氧烷2%，乳化剂A165 2%，油类D 2~8%，异硬脂酸异丙酯3%，鲸蜡硬脂醇2~3%，防腐剂D 0.3%，丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物2%，EDTA二钠0.1%，三乙醇胺和所述须松萝提取物，余量为去离子水，上述各组分的重量百分比之和为100%；其中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.0001~10%；所述油类D为矿油和/或异十六烷；所述防腐剂D为羟苯甲酯和/或羟苯丙酯。
31.如权利要求30所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述乳霜中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.0025~0.15%。
32.如权利要求30所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述乳霜中，所述须松萝提取物的重量百分比为0.01~5%。
33.如权利要求30所述的皮肤外用剂，其特征在于：所述乳霜中，所述须松萝提取物的重量百分比为1%。
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