CN117797056A - 一种改善皮肤状态的复方精油和含有其的护肤品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种改善皮肤状态的复方精油和含有其的护肤品组合物，该复方精油包含以下单方精油：栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油和永久花精油，体积比为2:3:2:3。本发明的复方精油具有抗皮肤衰老、美白皮肤、修复皮肤屏障和除螨的功效。该护肤品组合物包含上述复方精油及护肤品可接受的辅料和/或赋形剂。

Description

一种改善皮肤状态的复方精油和含有其的护肤品组合物

技术领域

本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种改善皮肤状态的复方精油和含有其的护肤品组合物。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，它不仅是人体的天然屏障，也是重要的审美器官。随着物质生活水平的提高，人们对皮肤保持年轻健康状态的需求不断增长。皮肤的抗衰、美白、促屏障修复、除螨的关注度越来越大。

皮肤老化也称为皮肤衰老，是人体衰老的直接表现，是遗传和环境因素共同作用的结果，表现为皮肤结构、功能和外观的累积性变化，如皱纹增多、皮肤松弛、弹性减退、 皮肤色素沉着不均、皮肤变黑等。延缓皮肤老化对维持人们的心理健康和皮肤的正常生理功能具有重要意义。

氧化应激是细胞和组织中活性氧（ROS）产生和积累与生物系统对这些活性产物进行代谢的能力之间失衡引起的现象，是机体产生的一种应激反应。皮肤中存在多种抗氧化防御系统，它们集中在表皮，主要是来清除自由基，使自由基在体内保持平衡，如若自由基过量，蛋白质、酶、细胞膜、核酸等生物大分子被过氧化作用攻击，形成不饱和脂肪酸，导致生物酶活性降低，DNA发生突变，细胞功能受损。因此清除自由基可以达到缓解皮肤老化的目的。

皮肤老化时真皮层的结构发生了巨大改变，主要是真皮成纤维细胞的数量减少，细胞外基质中的胶原蛋白和弹性蛋白合成能力下降，特别是I型和Ⅲ型胶原蛋白含量降低，导致真皮层变薄，皱纹增加和弹性减弱。其中I型胶原蛋白是皮肤结构的主要组成部分，占皮肤重量的75%，对皮肤的轮廓支撑、肌肤屏障，以及皮肤紧致和弹性的维持，都起到了至关重要的作用。促进I型胶原蛋白表达可以抑制皱纹的产生。

皮肤表皮层中黑色素的含量决定了我们的肤色，黑色素是由黑素细胞产生并转运至表皮细胞，黑色素产生或累积在皮肤上，导致肤色变黑，甚至产生色斑。影响黑色素生成的关键是酪氨酸酶，体内酪氨酸在酪氨酸酶的刺激下经过一系列化学反应最终生成黑色素，黑色素由黑素体转运至角质细胞，在角质细胞积累最终呈现黑色。由此可见抑制黑色素的生成可以达到美白的目的。

表皮屏障功能缺陷是最常见的炎症性皮肤病的主要特征。表皮屏障受损后，透过表皮的外源性过敏原和微生物会增加，从而产生免疫激活和随后的炎症反应。因此维持皮肤屏障功能对防止皮肤炎性反应有重要意义。

螨虫是一种皮肤上的寄生虫，在人的毛囊和皮脂腺内都可以找到螨虫，它能畅通无阻的进出毛孔，吸食毛囊和皮脂腺内的细胞营养。它的繁殖力特别强，螨体及其排泄物又是强烈的过敏原，普遍影响人们的皮肤健康，如引起皮肤过敏反应，出现皮肤瘙痒、红肿等；若存留时间过长，会导致毛孔堵塞、皮肤粗糙，甚至出现满面红疹或脓包、鼻子潮红等损害容颜的现象。螨虫感染严重影响皮肤健康，抑制螨虫的寄生繁殖、防止它对皮肤的危害受到广大关注。

精油是从植物的叶子、花朵、种子、果实、根部、树皮、树脂、木心等部位以水蒸汽蒸馏法、冷压榨法、脂吸法、二氧化碳超临界萃取等方法提炼出来的。由于其天然来源，被广泛认为是比合成药物更接近自然，是一种更健康、更可持续的选择。精油是多种化学成分组成的复杂混合物，如挥发油、酚类、醇类、酯类等，赋予精油抗菌、抗炎、抗氧化、镇痛等多种功效，并共同作用来产生整体效果，使其在皮肤保健和其他外用应用中具有广泛的用途。

由于表皮屏障的存在，如何增强药物在皮肤的通透性也成为重要的研究内容，常用的化学渗透促进剂经常引起皮肤刺激(局部炎症)，使用纳米颗粒等特殊载体系统、使用电场力、激光、超声波和微针等方法给经皮给药提供了更多研究空间，但转化为临床应用的产品并不多。分子量低于500道尔顿（Dalton）的化合物通常具有较好的皮肤渗透性能，而大部分精油分子量小于250道尔顿（Dalton），可以更容易地穿透皮肤表面并渗透到皮肤的不同层次，从而达到更好的吸收效果。精油分子通常是脂溶性的，能够更好地与皮肤的脂质层相容，并更容易渗透到皮肤的深层发挥作用。另外，精油成分本身具有渗透增强的性质，可以改善其他物质的渗透性、促进其他活性成分的吸收，并增强它们在皮肤中的效果。

单方精油所含药效物质基础有限，其功效单一、治疗范围局限、气味刺激等因素导致在应用中受到极大限制。复方精油是由各种疗效确定或药效物质基础明确的精油成分经一定比例混合而成的复方精油，源于疗效确切的单方精油之间的归类组合，经过实验室安全性及药理毒理研究和临床疗效验证，可归属于组分中药。组分中药是创新中药研究的一个途径，是以中医理论为指导，遵循方剂配伍理论与原则，结合现代药物研制方法和技术，由有效组分配伍而成的中药。组分中药的特征是药效物质和作用机制相对清楚，可在治疗临床疾病或症状时，从不同的角度、多个方面发挥作用，提高疗效并减少不良反应，同时增加治疗范围。除此之外，对于气味不好但功能性却很强的精油，可以通过配方来调和气味，令其使用感更佳。总之，复方精油可使单方精油协同药理作用得到提高，应用领域也不断拓展加深。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于改善皮肤状态的复方精油，该复方精油具有优越的抗皮肤衰老、修复皮肤屏障和美白除螨的功效。

本发明的复方精油包括以下组分：栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油和永久花精油。中医方解：

君药栀子花味苦、性寒，入肺、肝经，有清热利湿，凉血解毒之功，肺主皮毛，君药栀子花可有效预防外感邪气对肌表屏障的损伤，起到解毒杀菌、修复抗衰的功效；臣药白玉兰花性温、味辛，归肺、胃、肝经，有芳香开窍，祛风散邪之功，能助力君药发表祛邪，芳香化浊；佐药永久花味香而性温和，可活血祛瘀，抗菌消炎，既能助血液运行，又可促修复营养皮肤、润肤美白除皱；使药芳樟叶性微温，味辛，有祛风散寒、理气活气、杀虫止痒作用，助诸药畅达周身；诸味合用，共成芳香化浊、抗炎修复、杀菌解毒、美白除皱之效。

优选地，本发明的复方精油中栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油和永久花精油的体积比为2：3：2：3。

优选地，本发明的复方精油由栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油和永久花精油组成。

优选地，本发明的复方精油由栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油和永久花精油按照体积比为2：3：2：3组成。

优选地，栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油和永久花精油分别是通过下述方法制得：栀子花精油、白玉兰花精油分别是以茜草科植物栀子花（Gardenia jasminoides Ellis）、木兰科植物白玉兰（Michelia alba DC）的花为原料，通过超临界二氧化碳萃取所取得的挥发油；永久花精油是以菊科永久花（Helichrysum italicum (Roth) G.Don）的花为原料，通过水蒸气蒸馏取得的挥发油；樟叶精油是以芳樟树（Cinnamomum camphora）的叶为原料原料，采用水中蒸馏的方式提取到樟叶精油。

本发明的另一目的是提供一种护肤品组合物，包含本发明的复方精油以及护肤品可接受的各种辅料、赋形剂，将上述组分共同制备成适于皮肤使用的护肤品组合物。

本发明还提供了一种本发明的复方精油和含有其的护肤品组合物的用途，即，将本发明的复方精油或护肤品组合物用于皮肤抗衰老、修复屏障和美白除螨。

优选地，在该用途中，复方精油的剂量为体积比0.001%~50%。

本发明的复方精油具有显著的抗衰、美白、屏障修复和除螨的功效，主要表现在以下方面：本发明的复方精油对透明质酸酶活性的抑制率高达33.4%；本发明复方精油具有较强的促进皮肤成纤维细胞增殖的活性，经本发明复方精油处理的皮肤成纤维细胞的活性可高达130%；本发明的复方精油促进I型胶原蛋白的合成；本发明复方精油对酪氨酸酶活性的抑制率高达24.49%，经本发明的复方精油处理后的B16-F10小鼠黑色素瘤细胞的黑色素相对含量较对照组降低30%；本发明复方精油在体外实验显示具有显著促进角质形成细胞迁移的作用，体内实验显示本发明复方精油显著增加了有机械屏障障碍的小鼠皮肤含水量，改善了受损皮肤形态；而且相比组成本复方精油的单方精油，本发明复方精油除螨功效最强。综上，本发明复方精油具有突出的抗氧化、保湿、促进皮肤成纤维细胞增殖、延缓衰老、抑制黑色素合成、修复受损屏障和除螨的作用。

附图说明

图1：Vc浓度和OD值的线性关系；

图2：精油对DPPH自由基清除的作用；

图3：透明质酸酶浓度与OD值的线性关系；

图4：精油对透明质酸酶的抑制率；

图5：精油对皮肤成纤维细胞活力的影响；

图6：细胞中I型胶原蛋白的表达；

图7：精油对酪氨酸酶的抑制率；

图8：精油对黑色素生成的影响；

图9：精油对皮肤角质形成细胞迁移的影响；

图10：精油对机械损伤模型小鼠的皮肤含水量的影响；

图11：皮肤组织HE染色；

图12：栀子花精油的气质联用检测结果；

图13：白玉兰花精油的气质联用检测结果；

图14：樟叶精油的气质联用检测结果；

图15：永久花精油的气质联用检测结果。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

下述实施例2-实施例7中所使用的精油均从牧九野(上海)科技有限公司采购或者由实施例1的方法提取而得。

栀子花精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：TCM0281201202209，企业标准为：相对密度（20℃）：0.910 - 0.945；折光指数（20℃）：1.465 - 1.490。栀子花精油的化妆品原料安全信息报送码为008588-02571-7734。

白玉兰花精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：XYJY003209，企业标准为：相对密度（20℃）：0.821 – 0.947；折光指数（20℃）：1.051 – 1.893。白玉兰花精油的化妆品原料安全信息报送码为：001149-02571-1903。

樟叶精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：ALYL23050803，企业标准为：相对密度（20℃）：0.875~0.890；折光指数（20℃） ：1.468~1.474。樟叶精油原料安全信息报送码为008504-02571-9021。

永久花精油：从牧九野(上海)科技有限公司采购，批号为：JY002408，企业标准为：相对密度（20℃）： 0.889~0.920；折光指数（20℃） ：1.450~1.470。

永久花精油原料安全信息报送码为004210-02571-3660。

【实施例1】 提取单方精油

仪器为水封口式蒸馏釜，其设备构成有：

蒸馏釜：整体外观为圆柱形，球冠式釜底，上部开口为加料口；

鹅颈管：带有蒸馏釜上口的圆锥形盖子，连接冷凝器；

冷凝器：为铝质列管冷凝器，使蒸汽冷凝和冷却式馏出液；

油水分离器：用铝材做成，既是接受馏出液的容器，又是精油与水的分离器。

水蒸馏法提取精油工艺流程：投料→加水→蒸馏→冷却→油水分离→精油→包装。

1.1提取栀子花精油

栀子花精油是以茜草科植物黄栀子（Gardenia jasminoides Ellis）的花为原料，通过超临界二氧化碳萃取所取得的挥发油。

在清晨选择开放程度适中的栀子花朵，避免过于幼小或成熟过度的花朵。在采摘后将花朵放置于通风良好、无阳光直射的干燥室内1-2天，再使用烘干机，55摄氏度加热烘干。花朵干燥后花瓣会呈脆硬状态，没有水分感。将干燥的栀子花朵放入粉碎机中进行处理，碎成过10～20目筛的粗粉，用砂布袋装好已秤量好的栀子花粗粉，并装入萃取器中，封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器（浸在冰水浴中），柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,让栀子花预浸润10min,超临界CO₂流体萃取。CO₂流体流速25~40L/H，萃取温度40℃，萃取压力20ＭPa，分离温度35℃，分离压力4.5ＭPa，萃取时间2h，得栀子花精油。

1.2提取白玉兰花精油

白玉兰花精油是以木兰科植物白玉兰（Michelia alba DC）的花瓣为原料，通过超临界二氧化碳萃取取得到的挥发油。

在清晨或黄昏选择开放程度适中的白玉兰花朵，避免过于幼小或成熟过度的花朵。在采摘后将花朵放置于通风良好、无阳光直射的干燥室内1-2天，再使用烘干机，50摄氏度加热烘干。花朵干燥后花瓣会呈脆硬状态，没有水分感。将干燥的白玉兰花朵放入粉碎机中进行处理，碎成过10～20目筛的粗粉，用砂布袋装好已秤量好的白玉兰花粗粉，并装入萃取器中，封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门，使气体沿管线经过干燥器，冷却冷凝器（浸在冰水浴中），柱塞泵，进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后，打开阀门V1,使萃取器升压到实验压力，关阀门V1,让白玉兰花预浸润10min,超临界CO₂流体萃取。CO₂流体流速5L/H，萃取温度30-50℃，萃取压力20-25ＭPa，分离温度35℃，分离压力4 .5～5 .5ＭPa，萃取时间1 h～2 h，得白玉兰花精油。

1.3提取樟叶精油

樟叶精油是以芳樟树（Cinnamomum camphora）的叶为原料，采用水中蒸馏的方式提取到的挥发油。

于6-9月期间从芳樟树上摘取新鲜樟树叶，将新鲜樟树叶洗净，置于不锈钢精油提取器中；在蒸馏器底部加入足量的水，使其没过樟树叶，加热至沸腾，使油水混合蒸汽通过冷凝管进入油水分离器；蒸馏2h后将油水分离器中液体混合物静置分层，取上层油相，得到樟叶精油。

1.4提取永久花精油

以永久花（Helichrysum italicum (Roth) G.Don）为原料通过水蒸气蒸馏法取得的挥发油，经原料采收、挑选合格的花和叶部位、经蒸馏后、冷却蒸馏产物、油水分离、过滤、罐装、醇化、混合、分装、检测、入库等工艺后，取得永久花精油。

【实施例2】制备复方精油

将实施例1获得的精油或者上述从牧九野(上海)科技有限公司商购的栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油、永久花精油均匀混合在一起，即得本发明的复方精油。

精油组合物1：栀子花精油+白玉兰花精油，体积比为2:3。即精油组合物1中栀子花精油含量为40%，白玉兰花精油含量为60%。

精油组合物2：栀子花精油+白玉兰花精油+樟叶精油，体积比为2:3:2。即精油组合物2中栀子花精油含量为28.57%，白玉兰花精油含量为42.85%，樟叶精油含量为28.57%。

复方精油：栀子花精油+白玉兰花精油+樟叶精油+永久花精油，体积比为2:3:2:3。即本发明的复方精油中栀子花精油含量为20%，白玉兰花精油含量为30%，樟叶精油含量为20%，永久花精油含量为30%。

【实施例3】精油的抗衰老功效研究

一、实验材料

3.1.1 实验细胞

人皮肤成纤维细胞HSF（Human skin fibroblasts，HSF）购自北京北纳创联生物技术研究院。

3.1.2试药与试剂

栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油、永久花精油、精油组合物1、精油组合物2、本发明的复方精油、DMSO（上海碧云天生物技术股份有限公司）、DPPH（Sigma公司）、VitaminC（99%，Sigma公司）、无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）、透明质酸酶（500U/mg，上海源叶科技有限公司）、透明质酸（97%，上海麦克林生化科技有限公司）、DNS显色剂（上海麦克林生化科技有限公司）、DMEM高糖培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）、胎牛血清（FBS，天杭生物科技有限公司）、CCK8（上海碧云天生物技术股份有限公司）、RIPA裂解液（上海碧云天生物技术股份有限公司）、BCA蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）、COL-1抗体（Type 1 Collagen，Cell Signaling Technology公司）、GAPDH抗体（CellSignaling Technology公司）、ECL化学发光液（Millipore 公司）。

3.1.3 仪器与设备

多功能酶标仪（Synergy2，美国，Bio-tek）、超净台（SW-CJ-2FD，中国，苏州安泰空气技术有限公司）、二氧化碳培养箱（371型，美国，ThermoFisher Scientific）、离心机（5810R，德国，Eppendorf）、垂直电泳仪（PowerPAC3000，美国，Bio-rad）化学发光成像系统（FluorChem R，美国，Protein Simple）。

二、实验方法

3.2.1 体外DPPH自由基清除测试

1）用无水乙醇配置 0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。以Vitamin C（Vc）为阳性对照，配置Vc标准品，蒸馏水溶解Vc，浓度分别是0μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL，将2 mL Vc标准品和2 mL DPPH 溶液加入到同一试管中摇匀，室温下暗处静置 30 min后测定其在波长517nm吸光度（OD值），根据Vc浓度和OD值绘制标准曲线。

2）将单精油和复方精油分别用DMSO稀释至浓度为15mg/mL，即分别取30mg栀子花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油与2mL DMSO涡旋2~3min混合均匀，即得各组待测液。

3）将2 mL 稀释后的精油和2 mL DPPH 溶液加入到同一试管中摇匀，室温下暗处静置 30 min后测定其在波长517nm吸光值，根据标准曲线求出精油DPPH自由基清除能力的Vc当量。

3.2.2 体外透明质酸酶抑制作用考察

1）DNS法绘制透明质酸酶与底物HA反应的酶活性标准曲线：用去离子水（ddH₂O）将透明质酸酶配制成2000U/mL。按照表1配制反应体系，震荡混匀，37℃反应30min，沸水浴5min。取反应液200μL，加入400μL DNS溶液，震荡混匀，沸水浴5min，冷却后用酶标仪在540nm处读吸光度OD值，每个样品3复孔。以A540处OD值与透明质酸酶浓度的对应关系绘制标准曲线。

表1 透明质酸酶标准溶液与底物HA反应体系

2）待测精油样品反应体系制备：分别取栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油、永久花精油、精油组合物1、精油组合物2和复方精油各6mg，与100μL DMSO涡旋2~3min混合均匀，再加入900μL ddH2O混匀，即为待测样品浓度为6mg/mL，反应体系为：待测样品10μL +2000U/mL透明质酸酶溶液300μL + ddH2O 190μL +0.5%透明质酸500μL，震荡混匀，37℃反应30min，沸水浴5min，该反应体系下精油的浓度为60μg/mL；

3）DNS法测定待测精油样品对透明质酸酶活性影响：取200μL制备好的待测精油反应体系，加入400μL DNS溶液，震荡混匀，沸水浴5min，冷却后用酶标仪在540nm处读OD值，每个样品3复孔。根据透明质酸酶的标准曲线计算精油组的透明质酸酶活性。

3.2.3精油促人皮肤成纤维细胞增殖检测

1）将人皮肤成纤维细胞HSF以10⁴个/孔接种于96孔板，待细胞密度约为80 %，加入不同浓度的精油干预。

2）分别取10mg栀子花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油与100μL DMSO涡旋2~3min混合均匀，加入900μL DMEM高糖培养基，涡旋混匀为精油储备溶液（10mg/mL）。

3）细胞实验中含精油的培养基均由上述精油储备溶液（10mg/mL）按比例由含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释，浓度梯度为0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和50μg/ml，每组设4个复孔。

4）共同孵育24h后移除96孔板内的培养基，每孔加入100 μL含10% CCK8试液的培养基，培养箱内孵育30min 后取出，用酶标仪在450 nm处检测各孔的OD值，计算细胞存活率。细胞存活率（%）=( 样品组OD值-空白OD值)/(对照组OD值-空白OD值)×100%。

3.2.4精油促进皮肤成纤维细胞胶原合成检测

1）将HSF细胞按每孔2×10⁵个接种于6孔板，待细胞密度约为80%后分组处理。

2）实验设空白对照组和各精油干预组，单精油和复方精油（3.2.3中的精油储备溶液）分别稀释至浓度为30μg/mL，空白对照组加入同体积培养基。

3）共同孵育24h后收集细胞，RIPA裂解细胞提取细胞蛋白，BCA法检测细胞蛋白含量，WesternBlot检测各组细胞I型胶原蛋白（COL-1）和GAPDH蛋白的表达。

三、实验结果

3.3.1 精油对自由基清除的作用

DPPH自由基清除测试可以评价待测样本的抗氧化能力，清除率越大，抗氧化性越强。首先建立Vc浓度和OD值之间的线性关系，结果如图1所示，线性方程：y=-0.0002x+0.107，R²=0.995。根据Vc浓度和OD值之间的线性方程得到精油DPPH自由基清除能力的Vc当量。结果见表2和图2。

表2 精油的DPPH自由基清除能力

由表2可知，在15mg/mL的浓度时，栀子花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油对DPPH自由基的清除能力分别相当于99.5μg/mL、149.5μg/mL、189.5μg/mL和223μg/mL的Vc对DPPH自由基的清除能力。与栀子花单精油相比较，本发明的复方精油对DPPH自由基的清除能力显著提高（p<0.001），是相同浓度的栀子花单精油的2.24倍。以上结果提示本发明的复方精油清除DPPH自由基的能力最为突出。

3.3.2 精油对透明质酸酶的抑制作用

透明质酸（Hyaluronic acid，HA）是一种多糖类物质，是构成皮肤细胞间质和细胞外基质的主要成分，其在真皮和表皮中结合和保留水分子的独特能力决定着皮肤的水合作用。HA具有极强亲水性，能够吸附大量水分子，形成一层水分膜，有效锁住肌肤的水分，具有良好保湿性能。透明质酸合成酶合成HA，透明质酸酶降解HA。对透明质酸酶抑制率越大表明对HA的降解作用越弱，则HA含量越高，对皮肤保湿功效越明显。

根据透明质酸酶活性与OD值的对应关系绘制标准曲线，见图3。透明质酸酶溶液在400U/ml-1000U/ml范围内，透明质酸酶浓度与OD值的线性关系良好，线性方程为：y=0.0008x-0.1418, R²=0.9948。按照标准曲线的线性回归方程计算精油反应体系中对透明质酸酶活性的抑制率，并评价精油对酶活性的影响。结果见表3和图4，各组精油在60μg/mL浓度时对透明质酸酶活性均有一定的抑制作用。精油组合物1对透明质酸酶活性抑制率较单方精油栀子花精油、白玉兰花精油的抑制率没有太大差异；在精油组合物1的基础上添加樟叶精油构成精油组合物2，其对透明质酸酶活性抑制率较栀子花精油组显著增强（p<0.05）；在精油组合物2基础上添加永久花精油构成本发明的复方精油，结果显示其对透明质酸酶的活性抑制率最大，高达33.4%，与栀子花精油组相比具有显著差异（p<0.01）。以上结果显示各精油发挥协同作用，使本发明的复方精油具有突出的保湿功效。

表3精油对透明质酸酶活性的影响

3.3.3 精油对皮肤成纤维细胞增殖的影响

考察精油在0-20 μg/mL浓度范围内对皮肤成纤维细胞存活率的影响。结果见表4和图5，在2-20μg/mL浓度范围内，本发明的复方精油具有相对于其它精油组来说明显促进皮肤成纤维细胞增殖的活性，提示复方精油能显著促进新生细胞不断产生，达到延缓衰老的作用。

表4精油对HSF细胞存活率的影响（单位：%）

3.3.4精油对皮肤成纤维细胞I型胶原蛋白表达的影响

作为皮肤蛋白质的主要成分，胶原占人体真皮蛋白质含量约90%，其中主要为I型胶原（80%）和少量III型胶原（10%），本实验通过Western Blot检测各组细胞I型胶原蛋白（COL-1）的表达，结果见图6。从图6可以看出，GAPDH作为内参蛋白其在各组中条带表达没有差异，相比于空白对照组，经栀子花精油和精油组合物1处理后的细胞COL-1蛋白表达变化较小，而经精油组合物2和本发明的复方精油处理后的细胞的COL-1蛋白表达增加明显，其中本发明的复方精油处理的细胞的COL-1蛋白表达量增多最明显。该结果表明，本发明的复方精油具有突出的促进I型胶原蛋白的合成，使皮肤保持一定的强度和弹性，防止真皮层萎缩达到抗皱的功效。

【实施例4】精油的美白功效研究

一、实验材料

4.1.1实验细胞

小鼠皮肤黑色素瘤细胞（B16-F10），购自中国科学院细胞库。

4.1.2 试药与试剂

栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油、永久花精油、精油组合物1、精油组合物2、本发明的复方精油、L-酪氨酸（99%，上海麦克林生化科技有限公司）、酪氨酸酶（500U/mg，上海麦克林生化科技有限公司）、PBS缓冲液（上海碧云天生物技术股份有限公司）、胎牛血清（FBS，天杭生物科技有限公司）、1640培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）、氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）、DMSO（上海碧云天生物技术股份有限公司）。

4.1.3 仪器与设备

多功能酶标仪（Synergy2，美国，Bio-tek）、超净台（SW-CJ-2FD，中国，苏州安泰空气技术有限公司）、二氧化碳培养箱（371型，美国，ThermoFisher Scientific）、离心机（5810R，德国，Eppendorf）。

二、实验方法

4.2.1 体外酪氨酸酶活性抑制实验检测

1）用PBS缓冲液将Ｌ-酪氨酸配制成500μg/mL，酪氨酸酶配制成50 U/mL，备用；

2）将单精油和复方精油分别用PBS缓冲液稀释至浓度为30μg/mL，即分别取10mg栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油、永久花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油与100μL DMSO涡旋2~3min混合均匀，加入900μL PBS缓冲液，涡旋混匀浓度为10 mg/mL，再用PBS缓冲液将其稀释至30μg/mL即得待测精油溶液；

3）在96孔板中设置240μL总反应体系（见表5），分别加入120μL Ｌ-酪氨酸、40 μLPBS缓冲液、40μL待测精油溶液，混匀后加入40μL酪氨酸酶溶液，37℃恒温孵育30min，492nm测定吸光度OD值；

4）对酪氨酸酶活性抑制率的计算公式为：酪氨酸酶抑制率（%）＝[(A - B)-(C -D)]／(A - B)×100% ，式中：A为仅存在酪氨酸酶时的吸光度；B为既不存在化合物也不存在酪氨酸酶时的吸光度；C为同时存在精油和酪氨酸酶时的吸光度；D为仅存在精油时的吸光度。

表5酪氨酸酶催化反应体系（μL）

4.2.2 精油对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞中黑色素生成的影响

1）取对数生长期的B16-F10细胞，消化后用含有10％胎牛血清1640 完全培养基制成细胞悬液，细胞浓度为4×10⁵个/mL，接种于6孔板，每孔2mL，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养；

2）分别取10mg栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油、永久花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油与100μL DMSO涡旋2~3min混合均匀，加入900μL 1640培养基，涡旋混匀为精油储备溶液（10 mg/mL），细胞实验中含精油的培养基均由精油储备溶液（10mg/mL）按比例稀释配制；

3）适应性培养12h后，将孔板分为对照组、栀子花精油组、白玉兰花精油组、樟叶精油组、永久花精油组、精油组合物1组、精油组合物2组、复方精油组，将上述精油储备溶液（10mg/mL）用1640完全培养基稀释至干预浓度30μg/mL，置于培养箱继续培养；

4）共同培养24 h后，弃培养液，PBS洗涤，将细胞消化下来，3000 rpm离心 3-5min获取细胞沉淀；

5）加入400μL含有1 mol/L的氢氧化钠吹打均匀，80℃水浴30 min，吹打均匀后移入96孔板，每个浓度3个复孔，测定各孔405nm波长下OD值；

6）以对照组黑色素含量为100%计，根据下列公式计算精油干预组黑色素含量：黑色素含量（%）=（OD精油组/OD空白对照组）×100％。

三、实验结果

4.3.1 精油在体外对酪氨酸酶抑制作用

酪氨酸酶是黑色素生物合成中的关键酶，酪氨酸酶的活性增加，会导致体内黑色素合成过多，造成色斑形成，可见酪氨酸酶的活性与黑色素合成量相关，抑制其活力即可控制黑色素生成量。因此，待测样品抑制酪氨酸酶活性的能力可评价其抑制黑色素生成的能力。

通过构建酪氨酸酶催化反应体系，来评价精油对酪氨酸酶的抑制效果。结果见表6和图7，各组精油在30μg/mL浓度时对酪氨酸酶活性均有不同程度的抑制作用，单精油组合后的抑制率较各单精油均有明显的增强，其中以本发明的复方精油的抑制作用最强，提示具有较强的抑制黑色素生成的作用，可以产生美白功效。

表6 精油对酪氨酸酶活性的影响

4.3.2 精油对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞黑色素合成的影响

精油对B16-F10细胞黑色素合成的影响结果见表7和图8，实验中各组精油浓度均为30μg/mL，与对照组相比除白玉兰花精油组其它各组均可以显著抑制细胞黑色素生成（p<0.01，p<0.001），其中本发明的复方精油组较其它干预组黑色素含量最低，提示复方精油对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞黑色素生成抑制作用最明显，以此来减少黑色素含量达到美白的作用。

表7 精油对B16-F10小鼠黑色素瘤细胞黑色素合成的影响

【实施例5】精油的屏障修复功效研究

一、实验材料

5.1.1实验细胞

人永生化角质形成细胞（HaCaT），购自中国科学院细胞库。

5.1.2实验动物

BALB/c小鼠，雄性，体重20-23g，购自上海杰斯捷实验动物有限公司，许可证号码：SCXK(沪)2018-0004。

5.1.3 试药与试剂

栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油、永久花精油、精油组合物1、精油组合物2、本发明的复方精油、胎牛血清（FBS，天杭生物科技有限公司）、DMEM培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）、DMSO（上海碧云天生物技术股份有限公司）、橄榄油（食用级）、HE染色试剂盒（上海碧云天生物技术股份有限公司）。

5.1.4 仪器与设备

超净台（SW-CJ-2FD，中国，苏州安泰空气技术有限公司）、二氧化碳培养箱（371型，美国，ThermoFisher Scientific）、离心机（5810R，德国，Eppendorf）、电子分析天平（BSA-124S，Sartorius，德国）、正置显微镜（Axio Scope 5，Zeiss，德国）。

二、实验方法

5.2.1精油促HaCaT细胞划痕愈合作用检测

1）取对数生长期的HaCaT细胞，消化后用含有10％胎牛血清DMEM完全培养基制成细胞悬液，将HaCaT细胞以4×10⁴ 个/孔接种于细胞插件中，在37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养；

2）分别取10mg栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油、永久花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油与100μL DMSO涡旋2~3min混合均匀，加入900μL DMEM培养基，涡旋混匀为精油储备溶液（10 mg/mL），细胞实验中含精油的培养基均由精油储备溶液（10mg/mL）按比例稀释配制；

3）待细胞密度约为80 %，移除细胞插件及6孔板内的液体，实验分为空白对照组、栀子花精油组、白玉兰花精油组、樟叶精油组、永久花精油组、精油组合物1组、精油组合物2组和复方精油组。将上述精油储备溶液（10mg/mL）用DMEM培养基稀释至干预浓度20μg/mL，分别加入2mL/孔，置于培养箱继续培养；

4）分别于0h及24h拍照。

5.2.2精油对皮肤机械屏障障碍小鼠的皮肤修复检测

5.2.2.1实验分组及干预

1）动物实验中5%浓度精油的配制：分别取1mL栀子花精油、精油组合物1、精油组合物2和本发明的复方精油与19mL 橄榄油涡旋2~3min混合均匀，即得5%浓度精油。

2）采用胶带法建立皮肤机械屏障受损模型，具体方法如下：将医用胶带紧贴于被剃毛的小鼠背部皮肤，随即快速撕下。每只小鼠每天2次造模刺激，每次造模均重复5次“胶带粘贴－撕下”的流程，2次造模刺激的间隔时间为8 h，造模过程连续4 d。以小鼠皮肤发红但无出血为造模成功。

3）造模成功之后各组小鼠给予浓度为5%的各组精油涂抹于受损部位，其中模型组给予橄榄油涂抹，连续7 d。

4）末次给药后24 h，收集皮肤组织进行指标检测。

5.2.2.2检测指标

1）表皮含水量测定：末次给药24 h后，迅速取小鼠皮肤组织并称重，然后将皮肤组织在105℃烘干4h直到样本质量保持恒定。表皮含水量=（表皮湿重-表皮干重）/表皮干重×100%。

2）皮肤组织学检查：用石蜡将皮肤组织包埋切片，根据HE试剂盒说明进行染色，在光学显微镜下进行观察拍照。

三、实验结果

5.3.1 精油对角质形成细胞迁移的影响

细胞划痕实验是简便快捷的测定细胞迁移运动和修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型。检测细胞迁移可以反映细胞的屏障修复能力，迁移率越大则屏障修复能力越强。结果见图9，单方精油栀子花精油、樟叶精油和永久花精油分别作用24h后，划痕面积明显缩小，相同浓度的白玉兰花精油处理24h后细胞脱落产生细胞毒性；精油组合物1和精油组合物2在划痕后24h，可以看到划痕明显变小；本发明的复方精油在精油组合物2的基础上添加永久花精油，在20μg/mL浓度干预24h后划痕几乎看不到，表现出对角质形成细胞迁移显著的促进效果。

5.3.2精油对小鼠皮肤含水量的影响

对小鼠皮肤含水量检测见表8和图10，与模型组相比较，精油组合物2和本发明的复方精油可以显著升高小鼠皮肤含水量（p<0.05，p<0.01）；复方精油组小鼠皮肤含水量又明显高于精油组合物2（p<0.05），提示本发明的复方精油在增加皮肤含水量方面作用最强，能够使屏障受损处保持一定水合作用，促进皮肤屏障修复。

表8 精油对小鼠皮肤含水量的影响

5.3.3精油对小鼠皮肤组织形态学的影响

HE染色结果见图11，与模型组小鼠相比，本发明的复方精油组小鼠表皮较薄，细胞层次减少，表皮和真皮层细胞紊乱排列得到明显改善，炎症细胞浸润明显减少，提示复方精油显著改善了屏障受损的皮肤形态，提示复方精油具有较好的保护皮肤屏障功能的作用。

【实施例6】精油的除螨功效研究

一、实验材料

6.1.1供试螨种：粉尘螨（Dermatophagoides farinae）， 雌雄成螨或若螨，来自挪亚检测技术有限公司

6.1.2试药：栀子花精油，精油组合物1，精油组合物2和本发明的复方精油

二、实验方法

1） 采用符合GB/T 41 l要求的中平布，经纱为（32±2）支数，纬纱为（32±2）支数的平布，将其裁剪成直径为60 mm的样块作为负载布。

2）采用浸泡处理方式， 吸取20mL样品原液（各组精油）或去离子水（对照组）均匀滴加或喷洒在试验负载布上，浸泡l 5min。

2）将试验负载布放置于直径60mm培养皿内。

3）挑取相同数量的尘螨放于每个培养皿的负载布的中心，将培养皿置于培养箱内（25℃，75%相对湿度）培养。

4）24h后检查并记录培养皿中活螨虫数，存活标准：用挑螨针波动螨虫，活动者视为存活。

5）计算滞留驱螨率：经样品处理的负载布和未经样品处理的负载布驱除螨虫数量差值的百分比。

三、实验结果

本实验采用载体法计算各组滞留驱螨率，结果见表9。依据标准T/CIAA017-2022《家用清洁产品防螨除螨性能测试方法及评价》的判定结果，滞留驱螨率≥60%，判有防螨效果。本实施例的结果显示各组精油的滞留驱螨率均在90%以上，提示均具有防螨效果。其中本发明的复方精油滞留驱螨率高达99%，除螨效果最强。

表9 精油对滞留驱螨率的影响

【实施例7】利用气质联用分别检测本发明的4种单方精油

本实施例采用气质联用的方法对本发明的各单方精油进行质量检测，以对本发明复方精油的原料进行质量控制。

5.1供试品的制备

将待测精油移取 0.5 mL 置于 1.5mL 离心管中，离心 1 min；取上清液 50 μL，称重，加入乙酸乙酯，配成浓度为 100 mg/mL 的精油溶液；按 1 : 10 的质量比，加入无水硫酸钠粉末，混匀，静置，离心；取上清液 10 μL，以乙酸乙酯稀释 100 倍，得浓度为 1 mg/mL的待测溶液；将待测溶液离心 1 min，取上清液，气质联用检测。

5.2检测方法

色谱柱：安捷伦 HP-5 MS UI（30 m×0.25 mm×0.25 μm）

载气：高纯氦

流速 ：1.0 mL/min

进样口温度： 250℃

分流比： 10 : 1

进样量： 1 μL

升温程序： 50 ℃—180℃（3℃/min）—300 ℃（ 20 ℃/min, 保持 5 min）

离子源： EI+

离子源温度：230℃

扫描模式： 全离子扫描

扫描范围：m/z 40 -600

溶剂延迟： 4 min。

5.3检测结果

检测结果如图12-图15所示。气质联用检测的原始数据经安捷伦MassHunter定性分析（Agilent MassHunter Qualitative Analysis，V B.07.00）软件分析，得各组分峰的信息（保留时间，积分峰面积，峰面积总和百分比，以及峰高）。

Claims (7)

1.一种改善皮肤状态的复方精油，其特征在于，由以下成分组成：栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油和永久花精油；所述栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油、永久花精油的体积比为2：3：2：3。

2.根据权利要求1所述的复方精油，其特征在于，所述复方精油具有抗皮肤衰老、美白皮肤、修复皮肤屏障和除螨的功效。

3.根据权利要求1所述的复方精油，其特征在于，所述栀子花精油、白玉兰花精油分别是以茜草科植物栀子花、木兰科植物白玉兰的花为原料，通过超临界二氧化碳萃取所取得的挥发油；所述永久花精油是以菊科永久花的花为原料，通过水蒸气蒸馏取得的挥发油；樟叶精油是以芳樟树的叶为原料，采用水中蒸馏的方式提取到樟叶精油。

4.一种根据权利要求1~3中任意一项所述的复方精油的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）制备所述栀子花精油

以茜草科植物栀子花的花为原料，通过超临界二氧化碳萃取所取得的精油；

（2）制备所述白玉兰花精油

以木兰科植物白玉兰的花为原料，通过超临界二氧化碳萃取所取得的精油；

（3）制备所述樟叶精油

以樟科植物芳樟的叶为原料，采用水中蒸馏的方式提取到樟叶精油；

（4）制备所述永久花精油

以菊科植物永久花为原料，通过水蒸气蒸馏法取得所述永久花精油；

（5）制备所述复方精油

将步骤（1）~（4）获得的栀子花精油、白玉兰花精油、樟叶精油和永久花精油按照体积比2：3：2：3均匀混合，即获得所述复方精油。

5.一种护肤品组合物，其特征在于，所述护肤品组合物含有根据权利要求1~3中任意一项所述的复方精油。

6.根据权利要求1~3中任意一项所述的复方精油或权利要求5所述的护肤品组合物在抗皮肤衰老、修复皮肤屏障、皮肤美白和除螨中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述护肤品组合物中的复方精油的含量为：0.001%~50%。