CN116492385A - 一种修复皮肤的复方精油和含有其的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种修复皮肤的复方精油和含有其的药物组合物,该复方精油包含下述成分:洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油、永久花精油。各单方精油通过下述方法制得:分别以洋甘菊、薰衣草、广藿香、岩玫瑰和永久花为原料,通过水蒸气蒸馏取得挥发油。优选地,该复方精油还包含金银花精油和连翘精油。金银花精油是以金银花为原料,采用超临界CO2萃取取得的挥发油;连翘精油为以连翘为原料,通过水蒸气蒸馏取得的挥发油。本发明的复方精油具有抗过敏、抗炎和修复皮肤屏障损伤的效果。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域,具体涉及一种修复皮肤的复方精油和含有其的药物组合物。
背景技术
表皮屏障功能缺陷是最常见的炎症性皮肤病的主要特征。表皮屏障受损后,透过表皮的外源性过敏原和微生物会增加,从而产生免疫激活和随后的炎症反应。因此屏障修复治疗是治疗慢性炎症性皮肤病的重要策略。
临床上屏障修复疗法的外治法主要包括以外用保湿剂封闭剂进行保湿,以外用糖皮质激素和钙调神经磷酸酶抑制剂为代表的药物进行抗炎、抗增殖和免疫抑制。近年来,植物来源的屏障修复外用药越来越受到患者和市场的青睐。植物来源的外用药通常是从天然植物中提取的,相对于合成药物具有安全副作用少、对皮肤较温和,很少引起刺激或过敏反应、环境友好少污染等优点。同时,植物来源的外用药通常是从植物中提取的活性成分,具有抗炎、抗菌、抗氧化、增加屏障水分含量等多种生物活性,可以促进伤口愈合、皮肤修复和屏障功能恢复。不同的植物活性成分联合应用时常会起到协同增效的效果。
精油是从植物的叶子、花朵、种子、果实、根部、树皮、树脂、木心等部位以水蒸汽蒸馏法、冷压榨法、脂吸法、二氧化碳超临界萃取等方法提炼出来的。由于其天然来源,被广泛认为是比合成药物更接近自然,是一种更健康、更可持续的选择。精油是多种化学成分组成的复杂混合物,如挥发油、酚类、醇类、酯类等,赋予精油抗菌、抗炎、抗氧化、镇痛等多种功效,并共同作用来产生整体效果,使其在皮肤保健和其他外用应用中具有广泛的用途。
由于表皮屏障的存在,如何增强药物在皮肤的通透性也成为重要的研究内容,常用的化学渗透促进剂经常引起皮肤刺激(局部炎症),使用纳米颗粒等特殊载体系统、使用电场力、激光、超声波和微针等方法给经皮给药提供了更多研究空间,但转化为临床应用的产品并不多。分子量低于500道尔顿(Dalton)的化合物通常具有较好的皮肤渗透性能,而大部分精油分子量小于250道尔顿(Dalton),可以更容易地穿透皮肤表面并渗透到皮肤的不同层次,从而实现更好的吸收和效果。精油分子通常是脂溶性的,能够更好地与皮肤的脂质层相容,并更容易渗透到皮肤的深层发挥作用。另外,精油成分本身具有渗透增强的性质,可以改善其他物质的渗透性、促进其他活性成分的吸收,并增强它们在皮肤中的效果。
单方精油所含药效物质基础有限,难以完全治愈或控制累及多种器官的器质性病变的发展。配方精油是由各种疗效确定或药效物质基础明确的精油成分经一定比例混合而成的复方精油,源于疗效确切的单方精油之间的归类组合,经过实验室安全性及药理毒理研究和临床疗效验证,可归属于组分中药。组分中药是创新中药研究的一个途径,是以中医理论为指导,遵循方剂配伍理论与原则,结合现代药物研制方法和技术,由有效组分配伍而成的中药。组分中药的特征是药效物质和作用机制相对清楚,可在治疗临床疾病或症状时,从不同的角度、多个方面发挥作用,提高疗效并减少不良反应,其协同药理作用得到提高的同时,应用领域也有所增多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种修复皮肤的复方精油,该复方精油具有抗皮肤过敏、抗炎和修复皮肤屏障损伤的功效。
该复方精油包含洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油和永久花精油。
上述单方精油通过下述方法制得:
分别以洋甘菊(Matricaria recutita)、真正薰衣草(Lavandula angustifolia Mill.)、广藿香(Pogostemon cablin (Blanco) Benth.)、岩玫瑰(Cistus ladaniferus)和永久花(Helichrysum italicum (Roth) G.Don)为原料,通过水蒸气蒸馏取得挥发油。
优选地,本发明的复方精油中洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油和永久花精油的体积比为0.8:5.4:1:2:0.8。
优选地,本发明的复方精油还包含金银花精油和连翘精油,其中金银花精油是以金银花(Lonicera japonica)为原料,采用超临界CO2萃取取得的挥发油;连翘精油是为以连翘(Forsythia suspensa)为原料,通过水蒸气蒸馏取得的挥发油。
优选地,本发明的复方精油中洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油、永久花精油、金银花精油和连翘精油的体积比为:0.8:5.4:1:2:0.8:2:2。
本发明还提供了一种修复皮肤的药物组合物,包含上述复方精油和生理上或药学上可接受的辅料。
优选地,本发明的药物组合物中该复方精油的含量为:10μg/mL~500μg/mL。
更优选地,本发明的药物组合物中该复方精油的含量为:50μg/mL~100μg/mL。
辅料可选自凡士林、固体石蜡、液体石蜡、地蜡、微晶蜡、饱和脂肪酸酯、不饱和脂肪酸酯、抗氧剂、二甲基硅油、羊毛脂、胆固醇、羊毛甾醇及其它类固醇、乙酰类固醇或是多元的酯类(如司盘)、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、耆胶西黄、果胶、海藻酸、黄原胶、瓜尔胶、琼脂、茶多酚(TP)、生育酚等等。
本发明还提供了一种化妆品组合物,该化妆品组合物包含上述的复方精油和化妆品基质。
本发明的复方精油的组方依据:
洋甘菊精油:主要成分α-红没药醇、母菊天蓝烃;主要成分作用:消炎、止痛、抗敏;
真正薰衣草精油:主要成分乙酸芳樟酯、芳樟醇、乙酸薰衣草酯;主要成分作用:镇静、消炎、止痛、降血压、助眠;
广藿香精油:藿香醇、广藿香烯,丁香酚、杜松烯 ;主要成分作用:消除壅塞、浮肿,缓解便秘,补强静脉、消除充血,促进组织再生;
岩玫瑰精油:主要成分α-蒎烯、劳丹醇;主要成分作用:抗病毒、强力止血、促进伤口愈合;
永久花精油:主要成分倍半萜酮、乙酸橙花酯;主要成分作用:化瘀、促进细胞再生、抗痉挛。
本发明的包含洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油、永久花精油的复方精油(本文中用编号1F表示),既考虑了各单方精油的成分功效协同和芳疗配伍的经验,又是在中医理论指导下形成的配方,其组方依据如下。
君:岩玫瑰可抗菌消炎,止血促愈合;永久花味香而性温和,可活血祛瘀,抗菌消炎,淡化疤痕。二者合用,止血而不留瘀,祛瘀生新促修复,共为君药。
臣:薰衣草,味辛,性凉,清热解毒,散风止痒,可治湿热毒邪侵犯肌表而成湿疹湿疮。
佐:广藿香味辛,性微温,芳香化浊、发表解暑,可祛湿浊之气,避免湿邪留滞、感染化脓。
使:洋甘菊味微苦、甘香,镇静舒缓、消炎止痛,可帮助排除体内毒素,美白润肤。
以上诸味合用,共成止血祛瘀消肿促修复之功。
进一步地,在本发明复方精油1F的基础上,再添加中药金银花精油和连翘精油,形成本发明的另一复方精油(本文中用编号1T表示)。
金银花精油:主要成分为芳樟醇、香叶醇、乙酸苄酯等。主要成分具有抗病原微生物、抗炎、免疫调节、降血脂、中枢兴奋等作用。
连翘精油:主要成分为单萜烯、单萜醇;主要成分功效具有抗菌消炎、抗氧化、有效清除有机自由基等多种生物活性。
将金银花精油和连翘精油配伍使用可以发挥协同作用。同时,从中医中药的配伍理论上分析,金银花为忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或带初开的花。金银花气芳香,质轻扬,性宣散,甘寒入肺胃,而有清解表热和上焦诸热之功,又有透营转气之功,为治一切热毒所致内痈、外痈要药。金银花加入复方精油1F中能和薰衣草共同作为臣药,二者均为清热解毒之品,共奏消肿解毒之功。连翘为木犀科植物连翘的干燥果实,性味苦,微寒,归肺、心、小肠经,既能散上焦风热,透达表邪,又清心火,解疮毒,连翘加入复方精油1F中和广藿香共同成为佐药,佐助臣药化湿解毒的同时,又可固护卫气,驱散表邪。复方精油1T中加入金银花、连翘二药配伍,轻清升浮宣散,清热解毒之力倍增。诸味合用,共奏清热祛风、解毒退肿、促进修复之功。
本发明的复方精油1F,相比于各单方精油来说,在以下方面都表现出明显的优势:复方精油1F中各单方精油仅占比0.8:5.4:1:2:0.8,复方精油1F在0~100μg/ml的浓度范围内,不抑制细胞活性,无细胞毒性,抑制LPS诱导下的巨噬细胞释放NO和生成IL-6,减轻二甲苯致过敏小鼠的耳肿胀和表皮增厚(P<0.05),促进皮肤角质细胞的增殖和迁移,增加皮肤机械损伤小鼠的皮肤中神经酰胺含量并减轻表皮增厚现象。因此,本发明复方精油1F具有优越的修复皮肤屏障损伤、抗皮肤炎症和抗过敏的功效。
本发明复方精油1T为在复方精油1F的基础上添加了金银花精油和连翘精油,其相较于单方精油和上述不包含金银花精油和连翘精油的复方精油1F,复方精油1T作用于细胞的安全浓度范围更大,其在减轻二甲苯致过敏小鼠的耳肿胀和表皮增厚,增加皮肤机械损伤小鼠的皮肤中神经酰胺含量并减轻表皮增厚现象方面,功效尤为突出。除此之外,在达到相同功效的前提下,复方精油1T中各单精油的使用剂量比复方精油1F要小,特别是在量产投入使用复方精油时,1T更加具有成本低的优势。
附图说明
图1:精油对小鼠耳肿胀度的影响;
图2:精油对小鼠耳廓表皮厚度的影响;
图3:精油对皮肤角质形成细胞迁移的影响;
图4:精油对小鼠机械屏障损伤皮肤神经酰胺含量的影响;
图5:精油对皮肤组织形态学的影响;
图6:精油对小鼠表皮厚度的影响;
图7:洋甘菊精油的气质联用检测结果;
图8:薰衣草精油的气质联用检测结果;
图9:广藿香精油的气质联用检测结果;
图10:岩玫瑰精油的气质联用检测结果;
图11:永久花精油的气质联用检测结果;
图12:金银花精油的气质联用检测结果;
图13:连翘精油的气质联用检测结果。
具体实施方式
下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明,并不用于限定本发明的范围。
下述实施例2-6中所使用的精油均为商购的或者由实施例1的方法提取而得。
洋甘菊精油:从上海逐本化妆品有限公司采购,批号为:2491EEH21,企业标准为:相对密度(20℃):0.9942~0.7942;折光指数(20℃):1.5957~1.3957。
薰衣草精油:从上海逐本化妆品有限公司采购,批号为:2491EEH21,企业标准为:相对密度(20℃):0.9825~0.7825;折光指数(20℃):1.5601~1.3601。
广藿香精油:从上海逐本化妆品有限公司采购,批号为:0951EIS21,企业标准为:相对密度(20℃):1.0452~0.8452;折光指数(20℃):1.6049~1.4049。
岩玫瑰精油:从上海逐本化妆品有限公司采购,批号为:3311ESL21,企业标准为:相对密度(20℃):1.0061~0.8061;折光指数(20℃):1.5856~1.3856。
永久花精油:从上海逐本化妆品有限公司采购,批号为:2591ESA21,企业标准为:相对密度(20℃):0.9879~0.7879;折光指数(20℃):1.5751~1.3751。
金银花精油:从牧九野(上海)科技有限公司采购,批号为:XYJY0070,企业标准为:相对密度(20℃): 0.922-0.965;折光指数(20℃): 1.470-1.520。金银花精油化妆品原料安全信息报送码为005525-02571-6901。
连翘精油:从牧九野(上海)科技有限公司采购,批号为:JY0109,企业标准为:相对密度(20℃), 0.859-0.920;折光指数(20℃),1.467-1.479。连翘精油化妆品原料安全信息报送码为004290-02571-1083。
【实施例1】制备单方精油
水蒸气蒸馏法所使用仪器:水封口式蒸馏釜,其设备构成是:
1.蒸馏釜:整体外观为圆柱形,球冠式釜底,上部开口为加料口。
2.鹅颈管:带有蒸馏釜上口的圆锥形盖子,连接冷凝器。
3.冷凝器:为铝质列管冷凝器,使蒸汽冷凝和冷却式馏出液。
4.油水分离器:用铝材做成,既是接受馏出液的容器,又是精油与水的分离器。
提取精油工艺流程投料→加水→蒸馏→冷却→油水分离→精油→包装。
超临界CO2流体萃取法所使用的主要设备是萃取器,由Ø34x5不锈钢管制成,增压缓冲并为双层结构,内筒为不锈钢,外筒为黄铜,互相紧密配合。
1.1制备洋甘菊精油
洋甘菊精油是通过以下水蒸气蒸馏法取得的挥发油。
在清晨或傍晚,选择采摘新鲜、干燥、没有受到污染的洋甘菊花朵,并将其洗净。将采摘好的洋甘菊花用刀或机器破碎。在蒸馏锅中加入蒸馏锅的2/3到3/4的蒸馏水,并将其放置在加热板上,将加热板加热至水开始沸腾。当蒸馏锅中的水开始煮沸时,将洋甘菊花朵放入蒸馏锅中,确保花朵全部浸没在水中。等待水开始沸腾3小时后,用冷却管连接蒸馏器,并将另一端的管子放入收集瓶中。蒸汽会通过冷却管冷凝,并流入收集瓶中。等待24小时,精油会浮在水的上层,用滴管或分离漏斗将其从水中分离出来。收集好精油后,将其过滤以去除悬浮在精油中的颗粒或其他杂质,得洋甘菊精油。
1.2制备薰衣草精油
薰衣草精油是通过以下水蒸气蒸馏法取得的挥发油。
在夏季6月到8月真正薰衣草花期之间,选择采摘新鲜、干燥、没有受到污染的真正薰衣草全株,并将其洗净。将蒸馏器拆开,清洗干净所有零部件,确保无油污和杂质。在蒸馏锅中加入蒸馏锅的2/3到3/4的蒸馏水,并将其放置在加热板上,将加热板加热至水开始沸腾。当蒸馏锅中的水开始煮沸时,将真正薰衣草全株放入蒸馏锅中,确保全部浸没在水中。等待水开始沸腾后,用冷却管连接蒸馏器,并将另一端的管子放入收集瓶中。蒸汽会通过冷却管冷凝,并流入收集瓶中。等待24小时,精油会浮在水的上层,用滴管或分离漏斗将其从水中分离出来。收集好精油后,使用滤纸或滤布过滤以去除悬浮在精油中的颗粒或其他杂质,得薰衣草精油。
1.3制备广藿香精油
广藿香精油是通过以下水蒸气蒸馏法取得的挥发油。
在7月到9月广藿香开花期之间,选择采摘新鲜、干燥、没有受到污染的广藿香全株,并将其洗净。将蒸馏器拆开,清洗干净所有零部件,确保无油污和杂质。在蒸馏锅中加入蒸馏锅的2/3到3/4的蒸馏水,并将其放置在加热板上,将加热板加热至水开始沸腾。当蒸馏锅中的水开始煮沸时,将广藿香全株放入蒸馏锅中,确保全部浸没在水中。等待水开始沸腾后,用冷却管连接蒸馏器,并将另一端的管子放入收集瓶中。蒸汽会通过冷却管冷凝,并流入收集瓶中。等待24小时,精油会浮在水的上层,用滴管或分离漏斗将其从水中分离出来。收集好精油后,使用滤纸或滤布过滤以去除悬浮在精油中的颗粒或其他杂质,得广藿香精油。
1.4制备岩玫瑰精油
岩玫瑰精油是通过以下水蒸气蒸馏法取得的挥发油。
在6月到9月,选择采摘新鲜、干燥、没有受到污染的岩玫瑰叶片,并将其洗净。将蒸馏器拆开,清洗干净所有零部件,确保无油污和杂质。在蒸馏锅中加入蒸馏锅的2/3到3/4的蒸馏水,并将其放置在加热板上,将加热板加热至水开始沸腾。当蒸馏锅中的水开始煮沸时,将岩玫瑰叶片放入蒸馏锅中,确保全部浸没在水中。等待水开始沸腾后,用冷却管连接蒸馏器,并将另一端的管子放入收集瓶中。蒸汽会通过冷却管冷凝,并流入收集瓶中。等待24小时,精油会浮在水的上层,用滴管或分离漏斗将其从水中分离出来。收集好精油后,使用滤纸或滤布过滤以去除悬浮在精油中的颗粒或其他杂质,得岩玫瑰精油。
1.5制备永久花精油
永久花精油是通过以下水蒸气蒸馏法取得的挥发油。
选择在清晨,采摘新鲜、干燥、没有受到污染的永久花全株,并将其洗净。
将采摘好的永久花用刀或机器破碎并放入蒸馏器中。在蒸馏锅中加入蒸馏锅的2/3到3/4的蒸馏水,并将其放置在加热板上,将加热板加热至水开始沸腾。当蒸馏锅中的水开始煮沸时,将永久花放入蒸馏锅中,确保全部浸没在水中。等待水开始沸腾4小时后,用冷却管连接蒸馏器,并将另一端的管子放入收集瓶中。蒸汽会通过冷却管冷凝,并流入收集瓶中,等待24小时,精油会浮在水的上层,用滴管或分离漏斗将其从水中分离出来。收集好精油后,使用滤纸或滤布过滤以去除悬浮在精油中的颗粒或其他杂质,得永久花精油。
1.6制备金银花精油
金银花精油是通过以下超临界CO2萃取法取得的挥发油。
先将山东产的金银花干花按照10~20目进行粉碎,用砂布袋装好已秤量好的药材粉,并装入萃取器中,封好顶盖。开启恒温槽电源。打开二氧化碳钢瓶阀门,使气体沿管线经过干燥器,冷却冷凝器(浸在冰水浴中),柱塞泵,进入增压缓冲瓶。待增压缓冲瓶的压力大大超过实验压力后,打开阀门,使萃取器升压到实验压力,关阀门,让金银花干花预浸润10min,超临界CO2流体萃取。CO2流体流速1L/min,萃取温度50℃,萃取压力25MPa,分离温度50℃,分离压力4 .5~5 .5MPa,萃取时间2~2 .5h,得到金银花精油膏状物。以金银花精油膏状物为原料,再次超临界CO2萃取,温度保持不变,压力改成40-45MPa,再次萃取时间2-3h。用95.0%的乙醇,按金银花精油膏状物和乙醇的比例为1:9进行萃取,过滤除去部分蜡质,将滤液静置过夜,次日再过滤,将滤液在50℃、真空度-0.015 MPa的条件下,用真空抽出乙醇,得金银花精油。
1.7制备连翘精油
连翘精油是通过以下水蒸气蒸馏法取得的挥发油。
以山西产地连翘果实为材料。
将连翘果壳洗净,滤干水分,置于电热恒温干燥箱中进行干燥,温度控制保持在60摄氏度。粉碎成过60目筛,用纱布包裹,置于蒸馏内槽中,加入等量的蒸馏水,注于外蒸馏槽中,并将蒸馏槽置放于水槽之上,密封外蒸馏槽,浸泡1.5h后进行蒸馏。萃取温度90℃,冷凝管温度15~25℃,蒸馏时间1.5h,得精油纯露混合液,用分离器分离,得连翘精油。
【实施例2】制备复方精油
本文中洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油、永久花精油、金银花精油和连翘精油分别用代号1A、1B、1C、1D、1E、1X-1和1X-2表示。将实施例1.1~1.5获得的或者上述从上海逐本化妆品有限公司商购的1A、1B、1C、1D和1E均匀混合一起,即得本发明的复方精油1F。在1F的基础上再加上由实施例1.6~1.7获得的或者从牧九野(上海)科技有限公司商购的1X-1和1X-2均匀混合在一起,即得本发明的复方精油1T。
复方精油1F:1A+1B+1C+1D+1E,体积比为0.8:5.4:1:2:0.8。即复方精油1F中洋甘菊精油含量为8%,薰衣草精油含量为54%,广藿香精油含量为10%,岩玫瑰精油含量为20%,永久花精油含量为8%。
复方精油1T:1A+1B+1C+1D+1E+(1X-1)+(1X-2),体积比为0.8:5.4:1:2:0.8:2:2。即复方精油1T中洋甘菊精油含量为5.71%,薰衣草精油含量为38.57%,广藿香精油含量为7.14%,岩玫瑰精油含量为14.28%,永久花精油含量为5.71%,金银花精油含量为14.28%,连翘精油含量为14.28%。
【实施例3】精油对细胞活性的影响和对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症的抗炎作用
一、实验材料
3.1.1 实验细胞
细胞小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7 细胞株
3.1.2 试药与试剂
复方精油1F、复方精油1T、各单方精油、脂多糖LPS、DMEM高糖培养基、胎牛血清、CCK8检测试剂盒、一氧化氮(NO)检测试剂盒、IL-6酶联免疫吸附测定(ELISA)检定试剂盒。
3.1.3 仪器与设备
生物安全柜、细胞恒温培养箱、倒置显微镜、全自动酶标仪、离心机、水浴锅、-80摄氏度冰箱、-20摄氏度冰箱、4摄氏度冰箱、万分之一天平、96孔板、24孔板、一次性刮铲、一次性吸管、1000μl、200μl、10μl等不同规格的枪及枪头、50ml、15ml及2ml离心管。
二、实验方法
3.2.1 RAW 264.7 细胞培养
小鼠单核巨噬细胞RAW 264. 7细胞株用内含10% FBS的DMEM培养基于 37℃细胞培养箱中培养,每24 h更换一次培养基,细胞生长至 60%~70% 传代,保持细胞呈对数生长。待细胞传至3代,状态稳定后,用于实验。
3.2.2 药物配制
3.2.2.1单精油的配制:分别取1ml实施例1获得的单精油与1ml DMSO涡旋2~3min混合均匀,取上述精油溶液200 mg加入DMEM培养基至体积为10 mL,涡旋混匀为各精油储备溶液(20 mg/mL)。
3.2.2.2复方精油的配制:分别取1ml实施例2获得的复方精油与1ml DMSO涡旋2~3min混合均匀,取上述精油溶液200 mg加入DMEM培养基至体积为10 mL,涡旋混匀为各精油储备溶液(20 mg/mL)。1ml复方精油1F的组成是0.08ml洋甘菊精油、0.54ml薰衣草精油、0.1ml广藿香精油、0.2ml岩玫瑰精油和0.08ml永久花精油;1ml复方精油1T的组成是0.057ml洋甘菊精油、0.386ml薰衣草精油、0.071ml广藿香精油、0.143ml岩玫瑰精油、0.057ml永久花精油、0.143ml金银花精油、0.143ml连翘精油。
细胞实验中含精油的培养基均由上述精油储备溶液(20 mg/mL)按比例稀释配制。
3.2.3 CCK8法检测RAW 264.7 细胞活性
为考察各精油对小鼠单核巨噬细胞RAW 264. 7 细胞活性的影响,取生长对数期的巨噬细胞用一次性刮铲刮拭,用吸管吹打至呈单个细胞分散。通过细胞计数取相应细胞数,并加入相应培养基,以4×104个/ml的密度接种至96孔板,每孔100μl,使其贴壁。实验设空白对照组,各精油均分别稀释浓度为50μg/ml、100μg/ml 、250μg/ml、500μg/ml,每组3个复孔。空白对照组加入相应体积的细胞培养液,继续培养24 h。弃96孔板上层培养基,加入含10%的CCK8无血清DMEM液100μl,于37℃、5% CO2细胞培养箱孵育30min,于酶标仪测OD450值,计算细胞存活率。细胞存活率 (%) =(精油OD值-PBS孔OD值) /(空白对照组OD值-PBS孔OD值)× 100%。
3.2.4检测精油对LPS刺激巨噬细胞产生的NO、IL-6含量影响
将培养的RAW 264. 7 细胞以1.6×105个/孔接种于24孔板。待其贴壁后加入不同浓度的上述各精油,共培养1小时后,给药组和模型对照组加入10μl 浓度为50μg/ml 的LPS,空白组加入完全培养基,继续培养24 h,收集上清液,具体步骤按照NO试剂盒说明书操作。于540 nm处测吸光值,并计算NO的含量及抑制率。公式:NO含量(μmol/g prot)=(测定管吸光度-空白管吸光度)/(标准管吸光度-空白管吸光度)×标准品浓度/样本的蛋白含量(该公式源于NO试剂盒说明);NO抑制率(%)=(模型对照组NO平均含量-给药组NO平均含量)/模型对照组NO平均含量×100%。IL-6的检测采用ELISA法,按照试剂盒说明书进行。
三、实验结果
3.3.1精油对RAW264.7细胞活性的影响
考察不同浓度的单方精油、复方精油1F、复方精油1T对巨噬细胞生长影响,结果如表1所示。
表1精油对巨噬细胞活力的影响
表1中50μg/ml的复方精油1T的细胞存活率是96%,与50μg/ml的复方精油1F的细胞存活率相比,没有统计学差异,对细胞不产生毒性。由表1可知,本发明的复方精油1F和复方精油1T在0~100μg/ml的浓度时,不会抑制细胞生长,没有细胞毒性,复方精油1F作用于细胞的安全浓度相较于同浓度的单方精油洋甘菊精油、广藿香精油更大。当复方精油1F的浓度增加至250μg/ml时,细胞存活率仅为65%,提示产生细胞毒性;当复方精油1T的浓度为250μg/ml时,细胞存活率仍高达93%,由此可知,与同浓度的复方精油1F、单方精油洋甘菊精油、广藿香精油、永久花精油和金银花精油相比,复方精油1T的细胞毒性显著降低,复方精油1T作用于细胞的安全浓度范围更大。
3.3.2精油对LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中NO的影响
巨噬细胞是机体炎症反应的主要参与者,巨噬细胞在受到外界刺激处于应激状态时,细胞内的可诱导型一氧化氮合酶基因诱导表达后产生大量一氧化氮(NO),促进炎症反应。检测炎症状态巨噬细胞NO浓度可间接反映炎症程度。若溶液中NO含量越高则NO浓度越高、NO抑制率越低,炎症反应增加。若溶液中NO含量越低则NO浓度越低、NO抑制率越高,炎症反应减少。
精油作用于炎症状态巨噬细胞后与模型组对比,如果生成NO量升高则NO
浓度升高、NO抑制率降低、证明了精油可使炎症反应增加,精油抗炎能力弱。精油作用于炎症状态巨噬细胞后与模型组对比,如果生成NO量降低则NO浓度降低、NO抑制率升高、证明了精油可使炎症反应减少、精油抗炎能力强。
精油在不同浓度干预下对NO的抑制率见表2。
表2精油对炎症状态巨噬细胞NO生成的影响
结果显示,经LPS刺激后,模型组上清中NO浓度与正常组比较显著升高,表明巨噬细胞经LPS刺激后,释放的NO的含量增加。而不同浓度的精油干预后可以不同程度的抑制LPS诱导引起的NO释放。其中,100μg/ml浓度的复方精油1T对NO的抑制率为26.86%,100μg/ml浓度的复方精油1F对NO的抑制率为22.93%,复方精油1F和复方精油1T均具有明显的对NO的抑制作用,且复方精油1T优于复方精油1F。单精油干预对NO的抑制率在20%以上的精油有50μg/ml的金银花精油(抑制率30.18%)、100μg/ml的金银花精油(抑制率21.42%)、50μg/ml的永久花精油(抑制率24.97%)和50μg/ml的洋甘菊精油(抑制率22.67%)。100ml复方精油1F含有永久花精油8 ml和洋甘菊精油8 ml,100ml复方精油1T含有金银花精油14.3 ml,永久花精油5.7 ml,洋甘菊精油5.7 ml,在含少量上述各单方精油的前提下,复方精油1F和复方精油1T具有意料之外的抑制NO释放的效果。
3.3.3 精油对LPS诱导的RAW264.7细胞上清液中IL-6的影响
巨噬细胞在受到外界刺激处于应激状态时会释放IL-6,促进炎症反应。检测培养上清液中IL-6浓度可间接反映炎症反应程度。精油作用于炎症状态巨噬细胞后与模型组对比,如果IL-6浓度升高,证明了精油可使炎症反应增加、精油抗炎能力弱。精油作用于炎症状态巨噬细胞后与模型组对比,如果IL-6浓度降低,证明了精油可使炎症反应减少、精油抗炎能力强。
利用ELISA法检测巨噬细胞培养上清液中的IL-6含量,利用IL-6标准品,得到标准曲线为:y = 68.923x2 + 221.89x + 0.4112,R² = 0.9991,线性关系良好,结果见表3。
表3 精油对炎症状态巨噬细胞IL-6生成的影响
由表3可知,经LPS刺激后,细胞分泌的IL-6明显增加,加入精油后,对IL-6有不同程度的抑制作用。其中复方精油1F在50μg/ml浓度对IL-6的抑制率高达54.11%,效果突出,复方精油1T在50μg/ml、100μg/ml浓度下的抑制率分别为23.29%和39.33%。因此,本发明的复方精油1F和复方精油1T均具有抑制IL-6分泌的效果,其中复方精油1F的效果更优。
四、小结
综上,本发明的复方精油1F和复方精油1T在0~100μg/ml的浓度时,不会抑制细胞生长,没有细胞毒性。在100μg/ml~250μg/ml浓度范围内,与同浓度的1F相比,1T的细胞毒性显著降低,1T作用于细胞的安全浓度范围更大。复方精油1F和1T均可以显著抑制LPS诱导引起的RAW264.7细胞上清液中NO和IL-6的含量。其中复方精油1T对NO的抑制效果优于1F,而复方精油1F对IL-6的抑制效果优于1T。以上结果提示,本发明的复方精油1F和复方精油1T均具有皮肤抗炎功效。在功效相当的前提下,复方精油1T不仅安全浓度范围更大,而且复方精油1T中各单精油使用剂量比1F中使用剂量要小,特别是在量产投入使用复方精油时,1T具有成本低的优势。
【实施例4】精油对二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症模型的抗炎、抗过敏作用
一、实验材料
4.1.1 实验动物
昆明种小鼠,雄性,体重25g,购自上海杰斯捷实验动物有限公司,许可证号码:SCXK(沪)2018-0004。
4.1.2 试药与试剂
复方精油1F、复方精油1T、各单方精油、橄榄油、二甲苯(批号20210418,购自上海凌峰化学试剂有限公司)。
4.1.3 仪器与设备
光学显微镜(型号Eclipse Ci-L)。
二、实验方法
4.2.1 耳肿胀度检测
昆明种小鼠,雄性,体重25g左右,随机分为空白组、模型组、复方精油1F、复方精油1T和各单方精油组,共11组,每组7只。各精油浓度均采用2倍稀释(即1体积原精油+1体积橄榄油,混匀后精油的浓度为50%),其中复方精油1F中,洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油和永久花精油的体积比为0.8:5.4:1:2:0.8,复方精油1T中,洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油、永久花精油、金银花精油和连翘精油的体积比为0.8:5.4:1:2:0.8:2:2。
小鼠右耳每日涂抹精油一次,各组连续涂抹给药5天,最后一次给药1 h后,除空白组外,其余各组用二甲苯20 μl均匀涂于小鼠右耳廓致炎,左耳对照,致炎30 min后颈椎脱臼处死动物,沿耳廓基线剪下两耳并称量,以耳片肿胀度(两耳片质量之差) 作为炎症指标,计算各组耳肿胀率。耳片肿胀率=(致炎右耳片质量-对照左耳片质量)/对照左耳片质量×100%
4.2.2病理组织检测
组织石蜡包埋切片实验步骤
①取材:将小鼠耳组织在4%多聚甲醛固定24h以上,并修整目标组织,注意需在通风橱进行,修整好后将组织放于脱水盒内,并贴上标签。
②脱水:按照以下脱水顺序及浓度对脱水盒进行逐级脱水处理。
75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II30min-醇苯(无水乙醇/二甲苯比例1:1)5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-石蜡I 1h-石蜡II 1h-石蜡III 1h。
此处为组织病理包埋的固定步骤,其中I、II和III用于区分不同步骤,二甲苯均为分析纯,下同。
③包埋并切片:将石蜡融化,放入包埋框内。待石蜡凝固将组织放入包埋框进行包埋并标上标签。石蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。修整好后,于石蜡切片机上将蜡块切片,片厚4μm。让切片于摊片机40℃温水上漂浮,使组织展平然后用载玻片捞起,并放进60℃烘箱内使水烤干蜡烤化,之后取出常温保存备用。
4.2.3 HE染色实验步骤
①石蜡切片脱蜡:从上往下依次将切片放入: 依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸馏水洗。
②苏木素染细胞核:用Harris苏木素将切片染3-8min后用自来水洗,接着用1%的盐酸酒精分化数秒,再次用自来水冲洗,最后用0.6%氨水返蓝,流水冲洗。
③伊红染细胞质:切片入伊红染液中染色1-3min。
④脱水封片:将切片依次放入95%酒精I 5min -95%酒精II 5min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min -二甲苯Ⅱ5min中脱水透明,将切片从二甲苯拿出来稍晾干,中性树胶封片。
⑤图像采集:在光学显微镜下观察并描述,对应主要描述部位进行拍照,炎症细胞计数。
三、实验结果
4.3.1精油对二甲苯诱发的小鼠耳廓肿胀的影响
采用二甲苯制备小鼠耳廓过敏肿胀模型,精油连续干预5天(1次/天),测量耳片肿胀度,并计算肿胀抑制率,结果见表4和图1。
表4 各组小鼠的耳肿胀度结果(单位:mg)
与模型组相比,各种精油干预后均能显著降低小鼠耳肿胀度(P<0.01,P<0.001)。复方精油1F和复方精油1T对小鼠耳肿胀的抑制率均高于50%,分别为50.34%、80.52%,复方精油1T的效果更优。
4.3.2精油对二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症模型的耳廓表皮厚度的影响
采用二甲苯制备小鼠耳廓肿胀炎症模型,精油连续干预5天(1次/天),以HE染色后的模型组小鼠耳廓表皮厚度作为过敏炎症指标,检测精油干预前后耳廓表皮厚度的变化。结果见表5和图2。表皮厚度减少率(%)=(模型组厚度-处理组厚度)/ 模型组厚度。
表5精油对小鼠耳廓表皮厚度的影响(单位:μm)
与空白组相比,模型组小鼠耳廓表皮厚度增加(P<0.01);复方精油1T减少表皮厚度达24.53%,复方精油1F为16.98%,复方精油1T减少二甲苯致小鼠耳廓肿胀炎症模型的耳廓表皮厚度的效果比1F好。
四、小结
综上,本发明的复方精油1F和复方精油1T在稀释2倍的情况下均能显著抑制二甲苯刺激诱发的小鼠耳肿胀度和表皮厚度增加,并且1T的效果优于1F。以上结果提示本发明的复方精油1F和复方精油1T具有抗皮肤过敏的功效。在具有相同功效的前提下,复方精油1T中各单精油使用剂量比复方精油1F中对应精油的使用剂量要小,特别是在量产投入使用复方精油时,1T具有成本低的优势。
【实施例5】精油对皮肤屏障的修复作用
一、 实验材料
5.1.1 实验动物
昆明种小鼠,雄性,体重20-23g,购自上海杰斯捷实验动物有限公司,许可证号码:SCXK(沪)2018-0004
5.1.2 试药与试剂
单精油、复方精油1F、复方精油1T、橄榄油、神经酰胺试剂盒(Lot May 2021,购自江莱生物)。
5.1.3 仪器与设备
酶标分析仪Rayto RT-6100。
二、实验方法
5.2.1精油促皮肤角质形成细胞增殖作用检测
将HaCat细胞以2×104/孔接种于96孔板,于细胞培养箱中培养,待细胞密度约为80 %,加入不同浓度的各精油共同培养24 h(浓度梯度为25、50、100、250、500 μg/ml)。以1:9将CCK8用培养液稀释,移除96孔板内的液体,每孔加入100μl稀释后的CCK8溶液。培养箱中继续培养30 min后取出,用酶标仪在450 nm处检测每个孔的吸光度值,计算细胞活力,细胞存活率(%)=(精油组OD值-PBS孔OD值) /(空白对照组OD值-PBS孔OD值)× 100%。
5.2.2精油促皮肤角质形成细胞划痕愈合作用检测
将HaCat细胞以4×104 /孔接种于细胞插件中,于细胞培养箱中培养,待细胞密度约为80 %,移除细胞插件及6孔板内的液体,加入不同浓度的各精油2ml,共同培养24 h(浓度梯度为25、50 μg/ml),于0h及24h拍照,用ImageJ计算细胞面积,并计算相应的迁移率。迁移率=(0h面积-24h面积)/0h面积,相对迁移率=样品迁移率-空白组迁移率。
5.2.3精油对皮肤机械屏障障碍小鼠的皮肤修复检测
取昆明种小鼠20只,雄性,随机分为空白组、模型组、50%复方精油1F组、50%复方精油1T组,共4组,每组5只。除正常组外,其余各组小鼠采用胶带法建立皮肤机械屏障受损模型,具体方法如下:将医用胶带紧贴于被剃毛的小鼠背部皮肤,随即快速撕下。每只小鼠每天2次造模刺激,每次造模均重复5次“胶带粘贴-撕下”的流程,2次造模刺激的间隔时间为8 h,造模过程连续4d。以小鼠皮肤发红但无出血为造模成功,之后各组小鼠给予不同浓度的复方精油干预,连续4 d。精油用橄榄油2倍稀释(即1体积原精油+1体积橄榄油,混匀后精油的浓度为50%)。模型组给予等量空白基质。末次给药后,观察受损皮肤组织的状况。取受损皮肤组织,制备匀浆,参照试剂盒说明书检测小鼠皮肤组织神经酰胺的含量;通过组织切片HE染色观察表皮厚度变化。
三、实验结果
5.3.1精油对皮肤角质形成细胞增殖的影响
利用CCK8法检测了不同浓度精油对皮肤角质形成细胞增殖的作用,结果见表6。
表6精油对HaCaT细胞增殖的影响
根据表6可知,本发明的复方精油1F和复方精油1T在0-250μg/ml浓度范围内,均可促进皮肤角质形成细胞的增殖,复方精油1F在浓度为50μg/ml时,细胞存活率高达135%,复方精油1T在浓度为100μg/ml和250μg/ml时,细胞存活率高达139%、141%,增殖效果尤为突出。因此,本发明的复方精油1F和1T在0-250μg/ml可促进皮肤角质形成细胞增殖,具有修复皮肤屏障的功效,并且复方精油1T较1F相比促增殖的浓度范围更大。
5.3.2精油对皮肤角质形成细胞迁移的影响
细胞划痕实验是简便快捷的测定细胞迁移运动和修复能力的方法,类似体外伤口愈合模型。检测细胞迁移率可以反映细胞的屏障修复能力,迁移率大则屏障修复能力好。迁移率=(0h面积-24h面积)/0h面积,相对迁移率=样品迁移率-空白组迁移率。若迁移率高,则细胞迁移运动强,精油屏障修复能力好;若迁移率低,则细胞迁移运动,则精油屏障修复能力差。
精油作用于角质形成细胞后,计算划痕愈合作用迁移率,若迁移率高则精油的屏障修复能力强。精油作用于角质形成细胞后,计算划痕愈合作用迁移率,若迁移率低则精油的屏障修复能力弱。
由于单次实验所能完成的样品数量有限,因此分成三组实验进行,分别对应下表格7A~7C,结果见图3(图片放大倍数为100)和表7A-表7C。
表7A 精油对皮肤角质形成细胞迁移率的影响
表7B 精油对皮肤角质形成细胞迁移率的影响
表7C 精油对皮肤角质形成细胞迁移率的影响
本发明的复方精油1F和1T在25μg/ml及50μg/ml两种浓度下均可显著促进皮肤角质形成细胞的迁移,其中复方精油1F组在浓度为25μg/ml和50μg/ml时,相对平均迁移率分别为35.85%、46.26%,效果尤为突出。复方精油1T组在对应浓度时的相对平均迁移率分别是18.78%和27.58%。复方精油1F的促进细胞迁移的能力优于1T。
5.3.3精油对皮肤机械屏障障碍小鼠的皮肤修复作用研究结果
5.3.3.1精油对小鼠皮肤神经酰胺含量的影响
角质层在皮肤屏障功能中起重要作用,细胞间的脂质使角质细胞如叠瓦状层层紧密结合,可以阻止水分丢失以及外界致病原进入。神经酰胺是细胞间脂质的主要成分,具有保水、抑制炎症反应、促进皮肤屏障功能修复的作用。神经酰胺能够间接反映皮肤屏障功能,神经酰胺含量越多,皮肤屏障功能越好;神经酰胺越少,皮肤屏障功能越差。通过试剂盒可以检测皮肤组织神经酰胺含量。
精油作用于皮肤机械屏障障碍小鼠后与模型组对比,如果组织匀浆中神经酰胺含量高,证明了精油可增强小鼠皮肤屏障功能、精油修复屏障功能好。精油作用于皮肤机械屏障障碍小鼠后与模型组对比,如果组织匀浆中神经酰胺含量低,证明了精油不可增强小鼠皮肤屏障功能、精油修复屏障功能差。
取各组皮损处皮肤制备匀浆,用ELISA法检测皮肤匀浆中的神经酰胺含量,结果见表8、图4。
表8精油对小鼠神经酰胺含量影响(n=5)
与空白组小鼠相比,模型组小鼠皮肤中神经酰胺的含量显著下降(P<0.001);与模型组相比,50%浓度的复方精油1F和复方精油1T组中,小鼠皮肤的神经酰胺含量均有升高,其中复方精油1T的效果显著(P<0.0001),优于复方精油1F。
5.3.3.2精油对皮肤组织形态学的影响
表皮位于皮肤最外层,具有形成机体的外部屏障的功能。皮肤的屏障功能出现问题后,皮肤会出现失水、增厚,尤其是表皮层增厚的问题。皮肤屏障功能越差,表皮厚度越厚。HE染色是一种利用组织或细胞的不同成分对苏木精的不同亲和力和染色性质而最终呈现不同颜色,可以使各种组织和细胞成分可见化的实验方法。皮肤组织在经过HE染色后,在显微镜下可以清晰看到表皮组织的形态、大小,从而可以观测表皮厚度。精油作用于皮肤机械屏障障碍小鼠后与模型组对比,如果HE染色后表皮组织厚度变薄,证明了精油可增强小鼠皮肤屏障功能、精油屏障修复功效好。精油作用于皮肤机械屏障障碍小鼠后与模型组对比,如果HE染色后表皮组织厚度变厚,证明了精油不可增强小鼠皮肤屏障功能、精油屏障修复功效差。结果见图5、图6和表9。
表9 精油对小鼠表皮厚度的影响(单位:μm)
与空白组相比,模型组小鼠表皮明显增厚(P<0.001),出现大量炎性细胞浸润;本发明稀释2倍的复方精油1F和1T对各组小鼠的病变情况均有明显的改善,与模型组相比,均可以显著降低表皮的厚度(P<0.001),说明各组皆具有较好的保护皮肤的作用,其中复方精油1T抑制表皮厚度增加的效果优于复方精油1F。
四、小结
综上,本发明的复方精油1F和复方精油1T均可不同程度促进角质形成细胞迁移,提高皮肤的神经酰胺含量,减轻皮肤机械损伤导致的表皮增厚,因此具有显著的修复皮肤屏障损伤的功效。其中,复方精油1F与复方精油1T相比,其促迁移能力优于复方精油1T,而复方精油1T的促增殖的浓度范围更大,且在具有相同功效的前提下,复方精油1T中各单精油使用剂量更小,在量产投入使用时,1T具有成本低的优势。
【实施例6】气质联用检测本发明的各单方精油
本实施例采用气质联用的方法对本发明的各单方精油进行质量检测,以对本发明复方精油的原料进行质量控制。
6.1供试品的制备
分别移取各单方精油1A-1E,1X-1和1X-2精油0.5mL置于1.5mL离心管中,离心1min;取上清液50μL,称重,加入乙酸乙酯,配成浓度为100 mg/mL的精油溶液;按 1 : 10的质量比,加入无水硫酸钠粉末,混匀,静置,离心;取上清液 10 μL,以乙酸乙酯稀释 100倍,得浓度为 1 mg/mL的各待测溶液;分别将各待测溶液离心 1 min,取上清液,气质联用检测。
6.2检测方法
色谱柱:安捷伦 HP-5 MS UI(30 m×0.25 mm×0.25 μm)
载气:高纯氦
流速 :1.0 mL/min
进样口温度:250℃
分流比:10 : 1
进样量:1 μL
升温程序:50 ℃—180℃(3℃/min)—300 ℃(20℃/min, 保持5min)
离子源:EI+
离子源温度:230℃
扫描模式:全离子扫描
扫描范围:m/z 40 -600
溶剂延迟:4 min
6.3检测结果
检测结果如图7-图13所示。气质联用检测的原始数据经 Agilent MassHunterQualitative Analysis(V B.07.00)软件分析,得各组分峰的信息(保留时间,积分峰面积,峰面积总和百分比,以及峰高)。
Claims (10)
1.一种用于修复皮肤的复方精油,其特征在于,所述复方精油包含下述成分:
洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油、永久花精油,其中各精油通过下述方法制得:
分别以洋甘菊、薰衣草、广藿香、岩玫瑰和永久花为原料,通过水蒸气蒸馏取得挥发油。
2.根据权利要求1所述的复方精油,其特征在于,所述复方精油中洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油和永久花精油的体积比为0.8:5.4:1:2:0.8。
3.根据权利要求1所述的复方精油,其特征在于,所述复方精油还包含金银花精油和连翘精油,所述金银花精油是以金银花为原料,采用超临界CO2萃取取得挥发油,所述连翘精油为以连翘为原料,通过水蒸气蒸馏取得挥发油。
4.根据权利要求3所述的复方精油,其特征在于,所述复方精油中洋甘菊精油、薰衣草精油、广藿香精油、岩玫瑰精油、永久花精油、金银花精油和连翘精油的体积比为:0.8:5.4:1:2:0.8:2:2。
5.根据权利要求1所述的复方精油,其特征在于,所述复方精油具备抗过敏、抗炎和修复皮肤屏障损伤的功效。
6.一种用于修复皮肤的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含如权利要求1~5中任意一项所述的复方精油和生理上或药学上可接受的辅料。
7.根据权利要求6所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物中的所述复方精油的含量为:10 μg/mL~500 μg/mL。
8.根据权利要求6所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物为软膏剂、乳剂或者乳膏剂。
9.根据权利要求1所述的复方精油在制备抗过敏、抗炎和皮肤屏障修复的药物中的用途。
10.一种化妆品组合物,其特征在于,所述化妆品组合物包含如权利要求1~5中任意一项所述的复方精油和化妆品基质。
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