CN108852925A - 含有富含小rna的莳萝水性提取物的组合物及其在化妆品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种化妆品组合物，其中含有有效含量的莳萝(Anethum graveolens)地上部分的水性提取物，所述提取物富含最大长度为150个核苷酸的小RNA，该提取物作为活性成分包含在生理学上可接受的介质中，它是按照下述步骤从植物原料中获得的，其中：a)将莳萝地上部分与水混合；b)向a)中获得的混合物中加入乙二胺四乙酸(EDTA)四钠，其中混合物的pH值在10.5到11之间；c)然后将b)中获得的混合物的pH值调节至6到8之间的值；d)对c)中获得的混合物提纯，以除去残留的固态植物原料并获得纯化的水性粗提取物；以及e)检测pH值并且在必要时重新调节至6到8之间，优选6到6.5之间的值。本发明还涉及根据本发明的组合物在化妆品中用于皮肤、头皮和表皮性组织护理的用途。

Description

含有富含小RNA的莳萝水性提取物的组合物及其在化妆品中 的用途
本发明涉及一种获得莳萝(Anethum graveolens)水性提取物的方法，所述提取物富含最大长度为150个核苷酸(nt)的小RNA(acides ribonucléiques，核糖核酸)，本发明还涉及此方法所获得的提取物以及含有此类提取物的化妆品组合物及其在化妆品中的用途。
伞形科(Apiaceae)，也称Ombellifère，由双子叶植物组成，包括近420个属，3000个物种，主要分布于世界上的温带地区。该科还包括诸如欧芹、芫荽和茴香等草药。莳萝(Anethum graveolens)属于伞形科(Apiaceae)。其学名有多种叫法，例如Anethum sowa、Peucedanum graveolens和Peucedanum sowa(Janeen等人；The Herb Society ofAmerica's Essential Guide to Dill.(美国草药学会莳萝基本指南)，Kirtland,Ohio：美国草药学会，2009年)。莳萝(Anethum graveolens)在世界上的生长范围很广，并且是一种富含各类分子的物种，例如精油、脂肪酸、蛋白质、碳水化合物、呋喃香豆素、多酚、矿物质以及许多其他生物活性分子。莳萝主要用于传统医学。莳萝这一名称来自希腊语“aneeson”或“aneeton”，指“强烈的气味”。这种植物有着悠久的历史，在许多国家很早就作为烹饪和药用植物。莳萝的用途在阿育吠陀医学(传统印度药物)中很常见，主要用于治疗腹部不适和消化不良(Jana和Shekhawat Shekhawat GS，Phytochemical Analysis andAntibacterial Screening of in vivo and in vitro Extracts of Indian MedicinalHerb:Anethum graveolens.(印度药用植物的体内和体外提取物的植物化学分析和抗菌筛选：莳萝)Res.J.Med.Plant.2010a；4(4)；206-212.2010；Janeen等人，The Herb Societyof America's Essential Guide to Dill.(美国草药学会莳萝基本指南)，Kirtland,Ohio：美国草药学会，2009年)。在法国和西欧的其他几个国家，这种植物因其促消化和强身健体的特性而成为许多传统药物制剂的成分，现在仍然在使用。科学文献主要描述了抗菌、抗炎、止痛作用，呼吸道粘膜保护以及肌肉松弛剂的作用。
许多莳萝籽提取物在文献中有所描述，其中一部分是其精油的用途，然而针对莳萝地上部分提取物所做的研究却很少。另外，所描述的大多数莳萝提取中均采用非极性有机溶剂，而很少采用极性溶剂如水来进行提取。而且，很少提及这些提取物用于化妆品。
尽管市面上有各种用于皮肤护理的抗衰老化妆品，但是对于施用于局部的有效化妆品组合物仍有需求，它们采用天然成分作为活性成分，从而对于皮肤和毛发产生抗衰老的作用。
所谓的“非天然”及化学合成产品可能被认为对环境和人类存在危害。相反，天然产品被认为优于化学合成产品。我们已经知道从植物或草药中提取出许多含有抗氧化剂/抗自由基剂的天然产物，它们可以用于中和多酚等自由基的损伤作用。
莳萝是一种极富含酚类化合物以及对皮肤产生有益作用的其它已知分子的植物。特别是，通过本发明所述的提取方法可以富集含有小分子量RNA的最终提取物。
通常描述的核糖核酸(小分子量RNA)提取方案适合于实验室操作，因此是小规模实施的。它们使用的溶剂不被视为化妆品溶剂(Zumbo，P.2014“Phenol-chloroformExtraction(酚-氯仿提取)”，2014)。另外，通过这些提取和纯化方案仅能够获得纯化的核苷酸组分。
这种RNA或DNA或小RNA的核苷酸组分不含任何其他有用的分子，例如代谢副产物、维生素、糖类、肽等，这些分子可能对皮肤产生有益效果，因此可用于化妆品。
本发明的第一个主题是一种从植物原料中获得莳萝(Anethum graveolens)水性提取物的方法，所述提取物富含最大长度为150个核苷酸的小RNA，该方法包括以下步骤：
a)用水增溶莳萝地上部分；
b)向a)中获得的混合物中加入乙二胺四乙酸(EDTA)四钠，其中混合物的pH值在10.5到11之间；
c)然后将b)中获得的混合物的pH值调节至6到8之间；
d)从c)中获得的不可溶物中分离出可溶物，以纯化所得的混合物，从而回收水性粗提取物；以及
e)对水性粗提取物实施至少一次过滤，以获得水性提取物，其富含最大长度为150个核苷酸的小RNA，检测其pH值并且在必要时重新调节至6到8之间，优选6到6.5之间的值。
另外，本发明的第二个主题是通过根据本发明所述方法获得的一种莳萝(Anethumgraveolens)地上部分的水性提取物，其富含最大长度为150个核苷酸的小RNA并且不含DNA，其特征在于，以提取物的总重量计，该提取物包含5到30g/kg干提取物、0.5到10g/kg蛋白质片段、0.5到10g/kg糖类、0.1到3g/kg氨基酸、50到2000mg/kg酚类化合物以及10到100mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。
本发明的第三个主题是一种组合物，其含有根据本发明的提取物作为抗衰老活性成分，以及生理学上可接受的介质。
更具体地，本发明的主题是一种化妆品组合物，其中含有有效含量的莳萝(Anethum graveolens)地上部分的水性提取物，所述提取物富含最大长度为150个核苷酸的小RNA(核糖核酸)，该提取物作为活性成分包含在生理学上可接受的介质中，它是按照下述步骤从植物原料中获得的，其中：
a)将莳萝(Anethum graveolens)地上部分与水混合；
b)向a)中获得的混合物中加入乙二胺四乙酸(EDTA)四钠，其中混合物的pH值在10.5到11之间；
c)然后将b)中获得的混合物的pH值调节至6到8之间；
d)对c)中获得的混合物提纯，以除去残留的固态植物原料并获得纯化的水性粗提取物；
e)检测pH值并且在必要时重新调节至6到8之间，优选6到6.5之间的值。
本发明的主题还包括根据本发明的组合物在化妆品中用于皮肤、头皮和表皮性组织护理的用途。
通过下面的描述和非限制性实施方式，并结合附图，可以更加清楚地理解本发明及其优点，其中：
-图1为在上进行分析后所得的图表，表示根据实施例5，对来自中国喜马拉雅地区的莳萝提取物中的RNA进行定量的情况；
-图2表示在上进行分析后所得的图表，表示根据实施例6，经小RNA沉淀步骤后，对来自中国喜马拉雅地区的莳萝提取物中的RNA进行定量的情况；
-图3表示在上进行分析后所得的图表，表示根据实施例7，对常规提取法获得的，来自中国喜马拉雅地区的莳萝提取物中的RNA进行定量的情况；
-图4表示，利用各种1％莳萝提取物离体处理72小时，对皮肤进行弹性蛋白免疫荧光染色法标记后，纤维长度的定量情况；
-图5表示，利用各种1％莳萝提取物离体处理72小时，对皮肤进行透明质酸(HA)标记后的定量情况；
-图6表示，利用各种1％莳萝提取物离体处理48小时，对皮肤进行p16标记后的定量情况；
-图7表示，利用各种1％莳萝提取物离体处理48小时，对皮肤进行E-钙粘蛋白标记后的定量情况。
本发明涉及一种从莳萝的干燥或新鲜地上部分获得水性提取物的方法，所述提取物富含最大长度为150个核苷酸的小RNA。
更具体地，本发明涉及一种化妆品组合物，其中含有有效含量的莳萝(Anethumgraveolens)地上部分的水性提取物，所述提取物富含最大长度为150个核苷酸的小RNA(核糖核酸)，该提取物作为活性成分包含在生理学上可接受的介质中，它是按照根据本发明方法的各个步骤，从植物原料中获得的。
莳萝(Anethum graveolens)是指例如来自喜马拉雅地区、埃及以及中国非喜马拉雅地区的物种；优选地，所述提取物是从喜马拉雅莳萝中获得的。
“地上部分”指莳萝的叶、茎和花。
本发明所指的“地上部分”不包括种子。
在描述过程中，名词“莳萝”和“Anethum graveolens”可互换使用，具有相同的含义。
“小RNA”或“小分子量RNA”是指小分子量的非编码RNA(核糖核酸)，最大长度为150个核苷酸，例如所有类型的单链和/或双链非信使小RNA，例如微RNA、干扰RNA、内含子、小核RNA或者甚至是任何RNA片段。
在根据本发明方法的第一步骤a)中，将植物原料，即经粉碎、干燥的莳萝地上部分与水混合，其中植物原料/水的优选重量比为4％至20％，更优选5％至10％，例如重量比为5.7或10。
所用的水为蒸馏水、去矿物质水或富含矿物盐和/或微量元素的水，优选蒸馏水。
优选地，莳萝的地上部分为干燥物。
优选地，植物原料在步骤a)中与水混合之前经过粉碎。粉碎是一种旨在更好提取的机械动作。机械粉碎，然后在EDTA存在的条件下进行碱裂解，这会促进细胞膜，特别是核膜充分分解。
然后，在步骤b)中，向a)中获得的混合物中加入EDTA四钠。此阶段的pH值是碱性的，必要时应加入氢氧化钠(NaOH)将其调节至10.5至11之间的值。在步骤b)中，有必要维持10.5和11之间的碱性pH值。实际上，与EDTA的作用有关的这一pH值水平会引起包括核膜在内的细胞膜分解、细胞裂解和DNA变性(双链结构的两股链被分开)。步骤b)中的pH值检测表明，其仍然为碱性并且稳定在9到11之间。
EDTA四钠的浓度优选2到15mM之间，更优选为10mM。
选择这一浓度是为了优化最终提取物中小分子量RNA的提取率。通过络合作用隔离二价离子，例如在纤维素微原纤维周围的果胶分子之间形成离子桥的钙离子，EDTA四钠会使植物细胞的果胶纤维素膜脆化、分解。其作用是在提取期间促进细胞内容物释放。EDTA处理步骤主要是为了富集含有小分子量RNA的提取物。
EDTA处理步骤优选持续至少1小时，温度在20到80℃之间。在此步骤中，有利地对a)中获得的混合物进行搅拌。
然后在c)步骤中，将在b)中获得的混合物的pH值调节至6到8之间。
例如，通过加入盐酸(HCl)溶液或者能够调节pH值并且适用于化妆品用途的任何酸，例如柠檬酸或乳酸来调节pH。
该酸化步骤导致DNA的突然变性(双链体重新配对)。然而，过长的染色体DNA无法完全重新配对并形成不可溶缠绕体。相反，短得多的小RNA则保留在溶液中。因此DNA和小RNA被分成不同的两个相；其中有含有染色体DNA等的固相，以及其中含有小RNA等的液相。
在步骤d)中，对c)中获得的混合物提纯，以除去植物原料并回收水性粗提取物；可以使用本领域技术人员已知的任何方法。优选地，c)中获得的混合物以低速离心，例如以4000g的速度至少持续10分钟，从而使渣滓中的残留植物原料沉淀，并回收上清液中的水性粗提取物。
在步骤d)中，检测pH值并且在必要时重新调节至6到8之间的值。优选地，将pH值重新调节至6到6.5之间的值，更优选重新调节至6.5。通过加入盐酸(HCl)或氢氧化钠(NaOH)溶液来重新调节pH值。
实际上，pH值低于6时通常可能会造成核苷酸沉淀，从而造成最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA沉淀。
根据本发明的方法中，步骤d)中的pH值调节步骤对于小分子量RNA的最佳提取来说，是必不可少的一个步骤。
有利地，步骤d)中pH值的重新调节是通过对d)中获得的水性粗提取物进行至少一次过滤来完成的。优选地，通过将过滤截留阈值从50到20μm降低至0.4、0.3、0.2或0.1μm，从而实施连续过滤。
本发明的第二个主题是通过上述方法获得的一种根据本发明的水性提取物，所述提取物富含最大长度为150个核苷酸的小RNA。
这种提取物不含DNA(脱氧核糖核酸)。
此类水性提取物，富含最大长度为150个核苷酸的小RNA，稀释前，以提取物的总重量计，该提取物包含10到30g/kg干提取物、2到10g/kg蛋白质片段、2到10g/kg糖类、0.2到3g/kg氨基酸、100到2000mg/kg酚类化合物以及10到100mg/kg最大长度为150个核苷酸的小RNA。由此获得的提取物被认为是浓缩物。然后可其将用生理学上可接受的溶剂稀释，以用于化妆品，以便随后将提取物的浓度调节至特定的有用干提取物重量。
作为说明性并且是非限制性的示例，生理学上可接受的溶剂的可以是水、丙三醇、乙醇、丙二醇及其被称为的天然形式(来自玉米)、丁二醇、二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化二甘醇、环状多元醇或这些溶剂的任何混合物。
优选地，通过根据本发明的方法获得的提取物用例如30％丙三醇和水的溶剂稀释，并且占提取物总重量的一定比例。根据本发明方法获得的提取物，还包括5-15g/kg干提取物、50-1000mg/kg多酚、0.5-10g/kg蛋白质片段、0.5-10g/kg糖类、0.1-1g/kg氨基酸以及10-100mg/kg最大长度为150个核苷酸的小RNA。
为了解释根据本发明的方法，下面将描述其实施方式的优选实施例。
实施例1：富含小RNA的伞形科(Apiaceae)莳萝(Anethum graveolens)提取物的制 备
富含小分子量(最大长度为150个核苷酸)RNA的水性提取物是从伞形科(Apiaceae)的莳萝(Anethum graveolens)中获得的。
第一步，将5％的粉末状莳萝干燥地上部分置于蒸馏水中，加入10mM的EDTA四钠，即50g莳萝干燥粉末置于950g蒸馏水和3.8g EDTA四钠中。该步骤中的pH值应该呈碱性，并且在10.5到11之间，以使小分子量RNA提取物达到最佳富集。
然后在搅拌下将该混合物在55℃下加热2小时。
接着，将混合物在4000g的速度下离心10分钟以除去固体物质。
在该步骤结束时，进行必要的稀释前，检测pH值，如有必要将pH值调节至6到6.5之间并保留小RNA提取物。
用孔隙度递降的过滤器实施连续过滤，以澄清植物提取物，最后用孔隙度0.2μm的过滤器滤菌。
实施例2：莳萝提取物的特征确定
通常会获得浅绿色的莳萝水性提取物，滴定浓度为10到30g/kg干提取物、2到10g/kg蛋白质片段、2到10g/kg糖类、0.1到3g/kg氨基酸、300到750mg/kg酚类化合物以及10到100mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。
然而，对于Anethum graveolens莳萝的地上部分，所得提取物可能因诸如采收地点、采收年份、季节、气候条件等因素而呈现出较大的差异性。
在实施例1的提取中，获得了滴定浓度为12g/kg干提取物的水性提取物。
理化分析表明，这种提取物的浓度为2.55g/kg蛋白质片段、3g/kg糖类、340g/kg氨基酸、650mg/kg酚类化合物以及50mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。然后，提取物用化学品溶剂稀释，特别是30％的甘油或丁二醇或丙二醇。稀释后，提取物的浓度为1.7g/kg蛋白质片段、2g/kg糖类、240g/kg氨基酸、455mg/kg酚类化合物以及35mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。
为了测定莳萝提取物中各种化合物含量，所用的分光光度含量测定方法如下：
通过罗氏蛋白质定量法(Lowry等人，1951)测定莳萝提取物的总蛋白含量。在分光光度计550nm处读取样品的吸光度。利用BSA标准曲线测定蛋白含量。
通过Moore等人(1948)公布的方案测定提取物的氨基酸含量，提取物的游离氨基酸含量是利用茚三酮试剂破坏胺基和羧基官能团后，通过形成染色络合物来估算的。在分光光度计570nm处读络合物的吸光度。利用氨基酸库作为标准品测定总氨基酸含量。
通过Dubois等人(1956)描述的含量测定改进方案测定提取物的总糖含量。(Dubois等人，“Méthode colorimétrique pour la détermination des sucres et dessubstances apparentées(用于测定糖和有关物质的比色法)”，Anal.Chem.，1956，28(3)，350-356)。该分析包括将原料溶于浓硫酸中，然后与苯酚反应，以形成染色络合物。在分光光度计490nm处读络合物的吸光度。利用葡萄糖标准曲线测定糖含量。
利用Folin-Ciocalteu含量测定法(Singleton等人，Analyse des phénolstotaux et d'autres substrats d'oxydation et antioxydants au moyen du réactiffolin-ciocalteu(利用folin-ciocalteu试剂分析总酚类和其他氧化和抗氧化基质)，1999，299:152)测定提取物的多酚含量。样品中的多酚类化合物与Folin-Ciocalteu试剂反应，试剂的氧化作用会产生蓝色。在分光光度计760nm处读取样品的吸光度。内容物用没食子酸标准曲线测定的等量没食子酸来表示。
利用(Agilent)对小分子量RNA实施鉴定，该分析仪可以通过核苷酸(例如小分子量RNA核苷酸)分析专用电子芯片来实现微型电泳。其能够测定最低限度几微升提取物中所含成分的多少和浓度。结果采用图表的形式，其中纵坐标(FU)为任意荧光度单位，横坐标为核苷酸数量(nt)。每次分析都添加了内部标记物(图1、2和3中的峰值25nt)，并作为内部对照品来验证分析是否顺利进行。
实施例3：富含小RNA的伞形科(Apiaceae)中国非喜马拉雅地区莳萝(Anethum graveolens)提取物的制备
富含小分子量(最大长度为150个核苷酸)RNA的水性提取物是从伞形科(Apiaceae)的莳萝(Anethum graveolens)中获得的。
第一步，将5％的粉末状中国非喜马拉雅地区莳萝的干燥地上部分置于蒸馏水中，加入10mM的EDTA四钠，即50g莳萝干燥粉末置于950g蒸馏水和3.8g EDTA四钠中。该步骤中的pH值应该呈碱性，并且在10.5到11之间，以使小分子量RNA提取物达到最佳富集。
然后在搅拌下将该混合物在55℃下加热1小时。
接着，将混合物在4000g的速度下离心10分钟以除去固体物质。
在该步骤结束时，进行必要的稀释前，检测pH值，如有必要将pH值调节至6到6.5之间并保留小RNA提取物。
用孔隙度递降的过滤器实施连续过滤，以澄清植物提取物，最后用孔隙度0.2μm的过滤器过滤。
通常会获得浅绿色的莳萝水性提取物，滴定浓度为10到30g/kg干提取物、2到10g/kg蛋白质片段、2到10g/kg糖类、0.1到3g/kg氨基酸、300到750mg/kg酚类化合物以及10到100mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。
然而，对于Anethum graveolens莳萝的地上部分，所得提取物可能因诸如采收地点、采收年份、季节、气候条件等因素而呈现出较大的差异性。
在此实施例中，获得了滴定浓度为12g/kg干提取物的水性提取物。
理化分析表明，这种提取物的浓度为2.5g/kg蛋白质片段、3g/kg糖类、340g/kg氨基酸、650mg/kg酚类化合物以及50mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。然后，提取物经水或水和化妆品溶剂的混合物稀释，特别是30％的甘油或丁二醇或丙二醇，以获得8g/Kg干燥物的提取物。稀释后，提取物的浓度为1.7g/kg蛋白质片段、2g/kg糖类、240g/kg氨基酸、455mg/kg酚类化合物以及35mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。
为了测定根据实施例3的莳萝提取物中各种化合物含量，所用的分光光度含量测 定方法如下：
通过罗氏蛋白质定量法(Lowry等人，1951)测定莳萝提取物的总蛋白含量。在分光光度计550nm处读取样品的吸光度。利用BSA标准曲线测定蛋白含量。
通过Moore等人(1948)公布的方案测定提取物的氨基酸含量，提取物的游离氨基酸含量是利用茚三酮试剂破坏胺基和羧基官能团后，通过形成染色络合物来估算的。在分光光度计570nm处读络合物的吸光度。利用氨基酸库作为标准品测定总氨基酸含量。
通过Dubois等人(1956)描述的含量测定改进方案测定提取物的总糖含量。(Dubois等人，“用于测定糖和有关物质的比色法”，Anal.Chem.，1956，28(3)，350-356)。该分析包括将原料溶于浓硫酸中，然后与苯酚反应，以形成染色络合物。在分光光度计490nm处读络合物的吸光度。利用葡萄糖标准曲线测定糖含量。
利用Folin-Ciocalteu含量测定法(Singleton等人，利用folin-ciocalteu试剂分析总酚类和其他氧化和抗氧化基质，1999，299:152)测定提取物的多酚含量。样品中的多酚类化合物与Folin-Ciocalteu试剂反应，试剂的氧化作用会产生蓝色。在分光光度计760nm处读取样品的吸光度。内容物用没食子酸标准曲线测定的等量没食子酸来表示。
实施例4：富含小RNA的伞形科(Apiaceae)埃及莳萝(Anethum graveolens)提取物 的制备
提取方法与实施例3中的相同，唯一差别在于莳萝的地理产区不同，此例中为埃及。
第一步，将5％的粉末状埃及莳萝干燥地上部分置于蒸馏水中，加入10mM的EDTA四钠，即50g莳萝干燥粉末置于950g蒸馏水和3.8g EDTA四钠中。该步骤中的pH值应该呈碱性，并且在10.5到11之间，以使小分子量RNA提取物达到最佳富集。
然后在搅拌下将该混合物在55℃下加热1小时。接着，将混合物在4000g的速度下离心10分钟以除去固体物质。
在该步骤结束时，进行必要的稀释前，检测pH值，如有必要将pH值调节至6到6.5之间并保留小RNA提取物。
用孔隙度递降的过滤器实施连续过滤，以澄清植物提取物，最后用孔隙度0.2μm的过滤器过滤。
在此实施例中，获得了滴定浓度为20.4g/kg干提取物的水性提取物。
理化分析表明，这种提取物的浓度为4.3g/kg蛋白质片段、3.1g/kg糖类、650g/kg氨基酸、720mg/kg酚类化合物以及46mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。然后，提取物经水或水和化妆品溶剂的混合物稀释，特别是30％的甘油或丁二醇或丙二醇。稀释后，提取物的浓度为1.8g/kg蛋白质片段、1.5g/kg糖类、360g/kg氨基酸、490mg/kg酚类化合物以及32mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。
实施例5：富含小RNA的伞形科(Apiaceae)中国喜马拉雅莳萝(Anethum graveolens)提取物的制备
提取方法与实施例3(和4)中的相同，唯一差别在于莳萝的地理产区不同，此例中为喜马拉雅地区。
第一步，将5％的粉末状中国喜马拉雅莳萝的干燥地上部分置于蒸馏水中，加入10mM的EDTA四钠，即50g莳萝干燥粉末置于950g蒸馏水和3.8g EDTA四钠中。该步骤中的pH值应该呈碱性，并且在10.5到11之间，以使小分子量RNA提取物达到最佳富集。然后在搅拌下将该混合物在55℃下加热1小时。
接着，将混合物在4000g的速度下离心10分钟以除去固体物质。
在该步骤结束时，进行必要的稀释前，检测pH值，如有必要将pH值调节至6到6.5之间并保留小RNA提取物。
用孔隙度递降的过滤器实施连续过滤，以澄清植物提取物，最后用孔隙度0.2μm的过滤器过滤。
在此实施例中，获得了滴定浓度为20g/kg干提取物的水性提取物。
理化分析表明，这种提取物的浓度为4.5g/kg蛋白质片段、2.8g/kg糖类、670g/kg氨基酸、650mg/kg酚类化合物以及90mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。然后，提取物经水或水和化妆品溶剂的混合物稀释，特别是30％的甘油或丁二醇或丙二醇。稀释后，提取物的浓度为2.3g/kg蛋白质片段、1.7g/kg糖类、470g/kg氨基酸、455mg/kg酚类化合物以及65mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA。
利用(Agilent)对小分子量RNA实施的鉴定，该分析仪可以通过核苷酸(例如小分子量RNA核苷酸)分析专用电子芯片来实现微型电泳。其能够测定最低限度几微升提取物中所含成分的多少和浓度。结果采用图表的形式，其中纵坐标(FU)为任意荧光度单位，横坐标为核苷酸数量(nt)，如图1所示。每次分析都添加了内部标记物(图1、2和3中的峰值25nt)，并作为内部对照品来验证分析是否顺利进行。
实施例6：研究制备中国喜马拉雅莳萝(Anethum graveolens)提取物，以获得不含 小RNA莳萝提取物时，最终pH值的影响
按照实施例3、4、5的同等操作条件执行提取方法，以富集小分子量RNA提取物，但不包括pH值调节的最终步骤。
这一提取方法是通过EDTA四钠处理步骤来完成的，但是提取物的pH值最终调节至4到4.5之间的酸性pH值，而不是6到8之间。
这引起小分子量RNA沉积，分析确认后的结果表明，小分子量RNA的浓度为零(如图2所示)。
实施例7：利用中国喜马拉雅莳萝(Anethum graveolens)获得常规提取物的实施 方法。证明EDTA处理步骤在实施小RNA提取时的作用
为了证明EDTA处理步骤在RNA提取时的作用，修改根据本发明方法中的某些主要步骤，使其无法富集小分子量RNA提取物，同样获得了莳萝(Anethum graveolens)提取物。
第一步，将5％的莳萝粉碎，然后加入水，即50g莳萝置于950g蒸馏水中。
测量pH值并且为5.5，在搅拌下将该混合物在55℃下加热1小时。
接着，将提取物在4000g的速度下离心10分钟以除去固体物质。
用50到20μm之间，孔隙度递降的过滤器实施连续过滤，最后用孔隙度0.4到0.3μm的过滤器过滤。
因此获得浅绿色的水性提取物，滴定浓度为13g/kg干提取物，含有3.3g/kg蛋白质片段、2.2g/kg糖类、380mg/kg氨基酸、410mg/kg酚类化合物。
然后仅添加水，将提取物稀释至8g/Kg干重。
理化分析表明，稀释后，植物提取物中的浓度为：蛋白质片段2.8g/kg、糖类1.7g/kg、氨基酸240mg/kg、酚类化合物280mg/kg。在这些所谓的常规提取条件下(无EDTA处理)，分析表明，这种提取物中小分子量RNA的浓度为零(如图3所示)。这一结果证明，提取方法中不包括EDTA(碱性pH值)处理时，所得提取物不含小分子量RNA。EDTA处理步骤是获得根据本发明的富含小分子量RNA的提取物的重要步骤。
更具体地说，根据本发明的第三方面，根据本发明获得的富含小RNA的水性提取物，作为活性有分，有利地用于化妆品组合物的制备，其中含有有效含量的根据本发明的此类小RNA提取物以及生理学上可接受的介质。
有效含量指获得提取物活性所必需的最低含量的本发明提取物，特别是化妆品活性，更具体地说是改善皮肤外观，对抗皮肤衰老迹象或改善皮肤滋润情况所必需的，而且这个含量是无毒的。
有利地，使用根据本发明的小RNA提取物，优选用化妆品溶剂稀释至5到15g/kg干重。
有利地，根据本发明的小RNA提取物在组合物中的浓度为组合物总重量的0.1到5％，优选浓度为组合物总重量的0.5％到2.5％之间。
生理学上可接受的介质是指适于与皮肤或粘膜表层接触的载体，无毒性、无刺激性、无不当致敏性或类似作用或不耐受反应，并且与合理的益处/风险比成比例。
根据本发明的可用组合物可以经任何适当途径施用，特别是口服或局部外用，并且采用可以由本领域技术人员调整的组合物配方。
根据本发明的组合物可以配制成经口服施用的剂型。所用的盖伦剂型可以是固体或液体形式。通常，口服固体形式为片剂、硬胶囊(胶囊剂)、软胶囊、装有粉剂或颗粒剂的药包。通常，口服液体形式为口服溶液剂、糖浆剂、酏剂、口服乳剂、口服混悬剂、口服滴剂。
优选地，根据本发明的组合物可以是经局部施用的剂型。因此，这些组合物应该含有生理学上可接受的介质，即与皮肤和表皮性组织相容，施用时无不适感，并且覆盖所有合适的化妆品形式。
局部施用是指将根据本发明的富含小RNA的水性提取物，更具体地说是含有这种提取物的组合物，施用或涂抹在皮肤或粘膜的表面上。
“皮肤”是指面部皮肤，特别是眼周和唇部、鼻子、额头、颈部、双手，还包括全身皮肤。
实施本发明的组合物尤其可以是水性、水醇或油性溶液，水包油乳剂、油包水乳剂或多相乳剂的形式；它们也可以是适用于皮肤、粘膜、唇部和/或头发的混悬液或粉剂的形式。
这些组合物可以具有或多或少的流动性，并且也可以是乳膏、乳液、乳剂、精华液、油膏、凝胶、糊剂、摩丝的形式。它们也可以是固体形式，例如棒状，或以气雾剂的形式施用于皮肤。
作为相关应用领域中通常使用的生理学上可接受的介质，可以是例如制剂所需的辅料，例如溶剂、增稠剂、稀释剂、抗氧化剂、染色剂、防晒剂、美黑剂、色素、填料、防腐剂、香精、气味吸收剂、精油、维生素、必需脂肪酸、表面活性剂、成膜聚合物等。
在任何情况下，本领域技术人员需确保在选择这些辅料及其比例时，依据的原则是避免影响本发明组合物的相关有利特征。这些辅料可以例如相当于组合物总重量的0.01到20％。如果根据本发明的组合物为乳剂，则脂相可以占组合物总重量的5到80％，优选5到50％。组合物中所用的乳化剂和辅助乳化剂选自相关领域中常规使用的那些。例如，它们可以按照占组合物总重量的0.3到30％的比例来使用。
根据本发明的另一种有利的实施方式，根据本发明的富含小RNA的水性提取物，可以包封或包含在化妆品载体中，例中化妆品领域中使用的脂质体或其它纳米胶囊或微胶囊，或者吸附在粉状有机聚合物、矿物载体如滑者石和膨润土上。
有利地，除了根据本发明的活性成分以外，根据本发明的组合物还可以含有至少一种其它活性成分，其具有与本发明所述活性成分相似和/或互补的化妆品用途。根据本发明，这种活性成分被定义为“补充活性成分”。
例如，所述一种或多种补充活性成分可以选自：抗老化剂、紧肤剂、增白剂、保湿剂、排水剂、微循环促进剂、去角质剂、脱屑剂、细胞外基质刺激剂、能量代谢活化剂、抗细菌剂、抗真菌剂、舒缓剂、抗自由基剂、抗紫外线剂、抗痤疮剂、抗炎剂、麻醉剂、发热剂、爽肤剂、瘦身剂。
这类补充活性成分可以选自以下各组物质：
-维生素A，特别是视黄酸、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇棕榈酸酯；
-维生素B3，特别是烟酰胺、生育酚烟酸酯；
-维生素B5、维生素B6、维生素B12、泛醇；
-维生素C，特别是抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸磷酸钠；
-维生素E、F、H、K、PP，辅酶Q10；
-金属蛋白酶抑制剂或TIMP(金属蛋白酶组织抑制剂)活化剂；
-DHEA(脱氢表雄酮)，其前体及衍生物；
-氨基酸，如精氨酸、鸟氨酸、羟脯氨酸、二棕榈酸羟脯氨酸、棕榈酰甘氨酸、羟赖氨酸、甲硫氨酸及其衍生物、N-酰基氨基酸化合物；
-天然或合成肽，包括二-、三-、四-、五-、六肽及其亲脂衍生物、异构体，以及与其它物质例如金属离子(例如铜、锌、锰、镁等)的络合物。例如，可以引用已知市售肽类，名为：CHRONOGENTM、LAMINIXYL ISTM、PEPTIDE Q10TM、COLLAXYLTM(法国专利FR2827170，)、PEPTIDE VINCI 01TM(法国专利FR2837098，)、PEPTIDEVINCI 02TM(法国专利FR2841781，)、ATPeptideTM(法国专利FR2846883，)，或者是Arg-Gly-Ser-NH2序列的合成肽、出售的名为ATPeptideTM的产品；
-名为GP4GTM(FR2817748，)的市售卤虫(Artémia salina)提取物；
-植物肽提取物，例如亚麻提取物(LipigénineTM，法国专利FR2956818，)，大豆、双粒小麦、葡萄藤、油菜、亚麻、大米、玉米、豌豆的提取物；
-酵母提取物，例如DynagenTM(法国专利FR2951946，)或ActopontineTM(法国专利FR2944526，)；
-脱氢乙酸(DHA)；
-合成或天然来源的植物甾醇；
-水杨酸及其衍生物、α-和β-羟酸、硅烷醇；
-氨基糖、葡糖胺、D-葡糖胺，N-乙酰葡糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺、甘露糖胺、N-乙酰基甘露糖胺、半乳糖胺、N-乙酰半乳糖胺；
-多酚提取物、异黄酮、类黄酮，例如葡萄提取物、松树提取物、橄榄提取物；
-脂类，例如神经酰胺或磷脂，动物油例如角鲨烯或角鲨烷；植物油例如甜杏仁油、椰子油、蓖麻油、荷荷巴油、橄榄油、菜籽油、花生油、葵花籽油、小麦胚芽油、玉米胚芽油、黄豆油、棉花籽油、苜蓿油、罂粟油、南瓜籽油、月见草油、小米油、大麦油、黑麦油、红花油、西番莲油、榛子油、棕榈油、杏仁油、鳄梨油、金盏花油；乙氧基化植物油、乳木果油；
-一切紫外线隔离剂和光线过滤剂；
-环AMP及其衍生物、腺苷酸环化酶活化剂及磷酸二酯酶抑制剂、积雪草(Centellaasiatica)提取物、积雪草苷和积雪草酸、甲基黄嘌呤、咖啡碱、咖啡因及其衍生物、茶碱、可可碱、毛喉素、马栗树皮甙和七叶苷糖、ACE抑制剂、缬氨酸色氨酸的肽、神经肽Y抑制剂、脑啡肽、银杏(Ginkgo biloba)提取物、薯蓣(dioscorea)提取物、芦丁、巴拉圭茶提取物、瓜拉那提取物、寡糖、多糖、肉碱、常春藤提取物、墨角藻提取物、夏枯草(Prunella vulgaris)提取物、鸡冠花(Celosia cristata)水解提取物、光滑果榆绿(Anogeissus leiocarpus)提取物、木薯(Manihot utilissima)叶提取物、棕榈肉碱、肌肽、牛磺酸、接骨木提取物、藻类提取物例如掌状红皮藻(Palmaria Palmata)提取物。
作为解释，下面列举了一些化妆品组合物配方示例，其中含有根据本发明方法所得的水性提取物，其富含最大长度为150个核苷酸的小RNA：
实施例8：眼部修护霜
制备方法：
1.将A相在主容器中均质化至澄清；
2.在25℃下，掺入到B相中，并均质化10分钟至均质；
3.在25℃下，在一只空烧杯中制备C相，混合至均质。掺入到D相中，充分混合至均质；
4.在25℃下，在主容器中加入C+D相，并混合至均质；
5.在25℃下，在主容器中加入E相，并混合至均质；
6.在25℃下，对F相预混合，将其加入到主容器中并混合至均质；
7.在25℃下停止操作。
因此该组合物呈紫色珠光奶油凝胶的形式，其pH值在5.70到6.20之间，粘度(D0)为80000-130000cps(Brookfield RVT/Spindle C/5RPM/1分钟/25℃)。
实施例9：滋润乳霜
制备方法：
1.将A相在主容器中均质化，并开始在75-80℃下加热；
2.在30℃下，掺入到B相中，均质化并且同时加热；
3.在空烧杯中制备C相，在75-80℃下加热至均质；
4.在75℃下，在主容器中加入C相，并均质化10分钟；
5.放冷，在65℃下加入D相。充分混合均质化10分钟；
6.预混合E相，然后加入到主容器中；
7.在60℃下加入E相。充分混合10分钟；
8.在35℃下，预混合F相，然后将其加入，并充分混合；
9.预混合G相，然后加入到主容器中；
10.在35℃下加入G相。充分混合均质化；
11.在空烧杯中制备H相：在室温下将NatrosolTM掺入到水中，均质化同时在60℃下加热；
12.在30℃下加入H相。充分混合均质化；
13.在25℃下停止操作。
因此该组合物呈粉红色黄油状乳膏的形式，其pH值在4.90到5.40之间，粘度(D0)为160000-210000cps(Brookfield RVT/Spindle D/5RPM/1分钟/25℃)。
实施例10：面部精华
制备方法：
1.在室温下，用烧杯称取A相各成分并混合。掺入B相并均质化；
2.在室温下，掺入到C相中，并对所有物质继续均质化；
3.在室温下，向ABC相中加入D相，并继续均质化；
4.在室温下，加入E相并均质化；
5.在室温下，加入F相并对所有物质均质化；
6.在室温下，加入G相并混合至均质；
7.在25℃下停止操作。
因此该组合物呈半透明奶黄色光滑凝胶的形式，其pH值在6.30到7.10之间，粘度(D0)为10000-15000cps(Brookfield RVT/Spindle B/5RPM/1分钟/25℃)。
实施例11：抗衰老面膜
制备方法：
1.在25℃下，将A相在主容器中均质化；
2.在25℃下，掺入到B相中，充分混合至均质；
3.在25℃下，加入C相，充分混合至均质；
4.在空烧杯预混合D相，然后在25℃下加入到主容器中；
5.在25℃下，在主容器中加入E相，并充分混合；
6.预混合F相并缓慢加入；充分混合至均质；
7.在空烧杯中预混合G相，加入到主容器中至均质；
8.在25℃下停止操作。
因此该组合物呈奶油凝胶的形式，带有闪亮绿色效果，其pH值在5.30到5.80之间，粘度(D0)为70000-100000cps(Brookfield RVT/Spindle C/5RPM/1分钟/25℃)。
实施例12：精华
制备方法：
1.将水加入主容器，并开始利用高低螺旋桨叶混合；
2.逐一加入其余成分，同时每次添加间隔时进行混合。
因此该组合物呈半透明光滑浆液的形式，其pH值在5.75到6.25之间，粘度(D0)为1.100-1.400cps(Brookfield RVT/Spindle 3/20rpm/25℃/1分钟)。
本发明的第四个方面涉及根据本发明的组合物在化妆品中用于皮肤、头皮和表皮性组织护理的用途。本发明尤其涉及根据本发明的组合物在化妆品中用于改善皮肤外观、对抗皮肤衰老迹象或改善皮肤滋润情况的用途。
表皮性组织指人类机体或动物机体中存在的天然物质，其富含角蛋白，更具体地指头发、毛发、睫毛、眉毛和指甲。根据本发明的用途和组合物特别适用于头发。
更具体地，本发明涉及根据本发明的组合物在化妆品中用于改善皮肤滋润情况和增强屏障功能的用途。
更具体地，本发明还涉及根据本发明的组合物在化妆品中用于对抗皮肤衰老迹象和改善皮肤紧致度和弹性的用途。
最后，本发明还涉及根据本发明的组合物在化妆品中用于改善头发健康状况的用途。
“改善皮肤外观”指皮肤毛孔显得更细、光泽度更高、肤色更为均匀。
“皮肤老化迹象”指由于衰老造成的皮肤外观的一切改变，例如皱纹和细纹、皲裂、眼袋、黑眼圈、无光泽，皮肤失去弹性、紧致性和/或张力，还指皮肤的一切不会系统地导致外观改变的内在改变，例如，皮肤变薄，诸如污染和紫外线辐射等环境应激造成的皮肤内部受损。
“改善皮肤滋润情况”指缺水造成的皮肤外观变化的一切改善作用，例如改善干燥、紧绷和不适。
“改善头发健康状况”指强化头发结构，以改善其外观并提高其光滑度和韧性。
对此，下面通过皮肤和头皮护理的活性测试结果来对本发明进行阐述。
实施例13：通过胶原蛋白I、皮肤桥蛋白原(dermatopontine)和弹性蛋白的研究， 评价根据实施例5、6和7的莳萝提取物对于真皮细胞外基质的作用
这项研究的目的是，比较三种喜马拉雅莳萝提取物对于真皮细胞外基质的作用。根据实施例5获得的富含小分子量RNA的第一提取物，根据实施例6获得的不含小分子量RNA的第二提取物，以及根据实施例7经浸渍后获得的第三提取物。
这项研究的目的是，评价这三种莳萝提取物对于细胞外基质结构中所含的胶原蛋白I、皮肤桥蛋白原和弹性蛋白表达的作用。胶原蛋白和弹性蛋白对维持皮肤的弹性和紧致度非常重要。皮肤桥蛋白原位于胶原纤维上(Forbes EG、Cronshaw AD、MacBeath JRE、Hulmes DJS.富含酪氨酸的酸性基质蛋白(TRAMP)，为细胞外基质的经过酪氨酸硫酸化并广泛分布的蛋白。FEBS Lett.1994 351(3):433-6)。它促进纤维形成，稳定胶原纤维并调节其直径(Macbeath J，Shackleton D和Hulmes D，富含酪氨酸的酸性基质蛋白(TRAMP)加速体外胶原纤维形成。J.Biol.Chem.1993 268:19826-32)。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类皮肤活检组织离体培养。活检组织培养48小时(皮肤桥蛋白原)或72小时(胶原蛋白I和弹性蛋白)，并且每天施用2次根据实施例5、6和7的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS 1X实现对照状况。所述施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。对特定部位去标记后，进行胶原蛋白I、皮肤桥蛋白原和弹性蛋白标记。免疫标记采用胶原蛋白I的特异性兔多克隆抗体(Rockland，参考号600-401-103-0.5)、皮肤桥蛋白原的特异性小鼠单克隆抗体(Santa Cruz，参考号Sc-376863)、弹性蛋白的特异性兔多克隆抗体(Abcam，参考号Ab21610)，再采用与荧光色素偶联的抗兔或抗小鼠二次抗体(Invitrogen，参考号A21206和A21202)。然后在Epi-荧光显微镜(ZeissAxiovert 200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对经胶原蛋白I标记后获得的荧光强度进行定量。利用(Improvision)软件对真皮中的皮肤桥蛋白原含量进行定量。利用ImageJ软件对经弹性蛋白标记后获得的纤维长度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表1中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理48小时(皮肤桥蛋白原)或72小时(胶原蛋白I和弹性蛋白)，对比经过PBS 1X处理后的对照状况，对比根据实施例6(不含小分子量的RNA)和7(浸渍)，从喜马拉雅莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到胶原蛋白I和皮肤桥蛋白原的表达明显提高，以及弹性蛋白纤维长度明显增加。对于经不同的1％莳萝提取物离体处理72小时的皮肤，经弹性蛋白免疫荧光标记后，在纤维长度定量时得到的结果(表1)在图4中得到更具体地体现，其中在史蒂顿特氏t检验(test t de Student)中：平均值+/-sem；n＝3；***：非常明显，*：明显，ns：不明显。
表1：
结论：
与不富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例6和7)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会进一步刺激离体人类皮肤中胶原蛋白I、皮肤桥蛋白原和弹性蛋白的表达。这些蛋白与皮肤的紧致度和弹性有关，因此它们的合成可以产生紧致作用。因此，根据本发明获得的莳萝提取物可以通过改善皮肤的紧致度和弹性来有效地对抗皮肤衰老迹象。
实施例14：通过胶原蛋白I、皮肤桥蛋白原和弹性蛋白的研究，分别评价根据实施 例3、4和5的不同产地(中国非喜马拉雅地区、埃及、中国喜马拉雅地区)的莳萝提取物对于 真皮细胞外基质的作用
这项研究的目的是，比较根据实施例3、4和5，从不同地理产区获得的三种莳萝提取物对于真皮细胞外基质的作用。从中国非喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第一提取物，从埃及莳萝中获得的富含小分子量RNA的第二提取物，以及从中国喜马拉雅莳萝中获得的富含小分子量RNA的第三提取物。
这项研究的目的是，评价这三种莳萝提取物对于细胞外基质结构中所含的胶原蛋白I、皮肤桥蛋白原和弹性蛋白表达的作用。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类皮肤活检组织离体培养。活检组织培养48小时(皮肤桥蛋白原)或72小时(胶原蛋白I和弹性蛋白)，并且每天施用2次不同地理产区的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS 1X实现对照状况。施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。对特定部位去标记后，进行胶原蛋白I、皮肤桥蛋白原和弹性蛋白标记。免疫标记采用胶原蛋白I的特异性兔多克隆抗体(Rockland，参考号600-401-103-0.5)、皮肤桥蛋白原的特异性小鼠单克隆抗体(Santa Cruz，参考号Sc-376863)、弹性蛋白的特异性兔多克隆抗体(Abcam，参考号Ab21610)，再采用与荧光色素偶联的抗兔或抗小鼠二次抗体(Invitrogen，参考号A21206和A21202)。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对经胶原蛋白I标记后获得的荧光强度进行定量。利用(Improvision)软件对真皮中的皮肤桥蛋白原含量进行定量。利用ImageJ软件对经弹性蛋白标记后获得的纤维长度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表2中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理48小时(皮肤桥蛋白原)或72小时(胶原蛋白I和弹性蛋白)，对比经PBS 1X处理后的对照状况，并对比根据实施例3和4，从中国非喜马拉雅地区的莳萝和埃及莳萝中获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到胶原蛋白I和皮肤桥蛋白原表达的明显增强，以及弹性蛋白纤维长度的明显增加。对于经不同的1％莳萝提取物离体处理的皮肤，经弹性蛋白免疫荧光标记后，在纤维长度定量时得到的结果(表2)在图4中得到更具体地体现。
表2：
结论：
与来自中国非喜马拉雅地区和埃及的富含小RNA的莳萝提取物(实施例3和4)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会进一步刺激离体人类皮肤中胶原蛋白I和弹性蛋白的表达。这些蛋白与皮肤的紧致度和弹性有关，因此它们的合成可以产生紧致作用。因此，根据本发明获得的莳萝提取物，特别是喜马拉雅莳萝提取物，可以通过改善皮肤的紧致度和弹性来有效地对抗皮肤衰老迹象。
实施例15：通过透明质酸研究，评价根据实施例5、6和7的莳萝提取物的作用
这项研究的目的是，比较三种喜马拉雅莳萝提取物对于透明质酸合成的作用。根据实施例5获得的富含小分子量RNA的第一提取物，根据实施例6获得的不含小分子量RNA的第二提取物，以及根据实施例7经浸渍后获得的第三提取物。
对透明质酸表达的研究是判断本发明的滋润作用的一种手段。实际上，透明质酸是真皮细胞外基质的主要成分，也存在于表皮中，并且对皮肤有滋润作用。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类皮肤活检组织离体培养。活检组织培养72小时，并且每天施用2次根据实施例5、6和7的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS1X实现对照状况。施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。透明质酸标记是利用生物素基化透明质酸特异性结合蛋白(Coger-Seikagaki，参考号400-763-1A)和与荧光色素偶联的抗生蛋白链菌素(Invitrogen)来完成的(Invitrogen，参考号S32354)。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对经透明质酸标记后获得的荧光强度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表3中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理72小时，对比经PBS1X处理后的对照状况，并对比根据实施例6(不含小分子量的RNA)和7(浸渍)，从喜马拉雅莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到真皮和表皮中透明质酸合成的明显提高。对于经不同的1％莳萝提取物离体处理72小时的皮肤，在透明质酸标记定量时得到的结果(表3)在图5中得到更具体地体现，其中在史蒂顿特氏t检验中：平均值+/-sem；n＝3；***：非常明显，**：很明显，ns：不明显。
表3：
结论：
与不富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例6和7)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会进一步刺激离体人类皮肤的表皮和真皮中透明质酸的合成。透明质酸对皮肤有滋润作用。
实施例16：通过透明质酸的研究，分别评价根据实施例3、4和5的不同产地(中国非 喜马拉雅地区、埃及、中国喜马拉雅地区)的莳萝提取物的滋润作用
这项研究的目的是，比较根据实施例3、4、5，从不同地理产区获得的三种莳萝提取物对透明质酸合成的作用。从中国非喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第一提取物，从埃及莳萝中获得的富含小分子量RNA的第二提取物，以及喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第三提取物。
对透明质酸表达的研究是判断本发明的滋润作用的一种手段。实际上，透明质酸是真皮细胞外基质的主要成分，也存在于表皮中，并且对皮肤有滋润作用。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类皮肤活检组织离体培养。活检组织培养72小时，并且每天施用2次来自不同地理产区的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS1X实现对照状况。施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。透明质酸标记是利用生物素基化透明质酸特异性结合蛋白(Coger-Seikagaki，参考号400-763-1A)和与荧光色素偶联的抗生蛋白链菌素(Invitrogen)来完成的(Invitrogen，参考号S32354)。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对经胶原蛋白I标记后获得的荧光强度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表4中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理72小时，对比经PBS1X处理后的对照状况，并对比根据实施例3和4，从中国非喜马拉雅莳萝和埃及莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到真皮和表皮中透明质酸合成的明显提高。对于经不同的1％莳萝提取物离体处理72小时的皮肤，在透明质酸标记定量时得到的结果(表4)在图5中得到更具体地体现。
表4：
结论：
与来自中国非喜马拉雅地区和埃及的富含小RNA的莳萝提取物(实施例3和4)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会进一步刺激离体人类皮肤的表皮和真皮中透明质酸的合成。透明质酸对皮肤有滋润作用。
实施例17：通过P16、角蛋白14和原纤维蛋白1的研究，评价根据实施例5、6和7的莳 萝提取物对于皮肤衰老的作用
这项研究的目的是，比较三种喜马拉雅莳萝提取物对于皮肤衰老的作用。根据实施例5获得的富含小分子量RNA的第一提取物，根据实施例6获得的不含小分子量RNA的第二提取物，以及根据实施例7经浸渍后获得的第三提取物。
这项研究的目的是，评价这三种莳萝提取物对影响皮肤衰老的p16蛋白、角蛋白14(K14)和原纤维蛋白1的作用。p16为随年龄延长的细胞周期调节剂(Ressler S、BartkovaJ、Niederegger H、Bartek J、Scharffetter-Kochanek K、Jansen-Dürr P、Wlaschek M.，p16INK4A是人类皮肤细胞衰老的一种稳健的体内生物标记物。Aging Cell.20065(5):379-89)。角蛋白14是表皮基底层中角质形成细胞的一种细胞骨架组分，它会随着这些细胞的分化而消失。原纤维蛋白1是对光致老化特别敏感的一种弹性纤维组分(Watson RE、Griffiths CE、Craven NM、Shuttleworth CA、Kielty CM。Fibrillin-rich microfibrilsare reduced in photoaged skin.Distribution at the dermal-epidermal junction.(富含原纤维蛋白的微纤维在光致老化皮肤中减少。分布在真皮-表皮交界处。)J InvestDermatol。1999 112(5):782-7)。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类皮肤活检组织离体培养。活检组织培养48小时(p16和K14)或72小时(原纤维蛋白1)，并且每天施用2次根据实施例5、6和7的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS 1X实现对照状况。施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织冷冻(原纤维蛋白1)或固定在甲醛中，再包含在石蜡中(p16和K14)。然后制成4μm厚的皮肤切片。对特定部位去标记后，进行p16、角蛋白14和原纤维蛋白1标记。免疫标记采用p16的特异性小鼠单克隆抗体(Abcam，参考号Ab54210)、角蛋白14的特异性兔单克隆抗体(Abcam，参考号Ab51054)、原纤维蛋白1的特异性小鼠单克隆抗体(Abcam，参考号Ab3090)，再采用与荧光色素偶联的抗小鼠或抗兔二次抗体(Invitrogen，参考号A21202和A21206)。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对经p16和K14标记后获得的荧光强度进行定量。利用ImageJ软件对经原纤维蛋白1标记后获得的纤维长度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表5中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理48小时，对比经PBS1X处理后的对照状况，对比根据实施例6(不含小分子量的RNA)和7(浸渍)，从喜马拉雅莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到p16表达的明显下降以及角蛋白14表达的明显增强。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理72小时，对比经PBS 1X处理后的对照状况，并对比根据实施例7(浸渍)，从喜马拉雅莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到纤维长度的明显增加。对于经不同的1％莳萝提取物离体处理48小时的皮肤，在p16标记定量时得到的结果(表5)在图6中得到更具体地体现，其中在史蒂顿特氏t检验中：平均值+/-sem；n＝3-6；***：非常明显，**：很明显，*：明显，～：基本明显(p＝0.055)，ns：不明显。
表5：
结论：
与不富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例6和7)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会抑制离体人类皮肤中p16的表达并进一步刺激K14的表达。与不富含小RNA的喜马拉雅莳萝浸渍提取物(实施例7)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)还会进一步刺激原纤维蛋白1的表达，但与不含小RNA的提取物(实施例6)相比不是这样。这些蛋白与皮肤衰老有关。因此，根据本发明获得的莳萝提取物能有效地对抗皮肤衰老迹象。
实施例18：通过P16、角蛋白14和原纤维蛋白1的研究，分别评价根据实施例3、4和5 的不同产地(中国非喜马拉雅地区、埃及、中国喜马拉雅地区)的莳萝提取物对于皮肤衰老 的作用
这项研究的目的是，比较根据实施例3、4、5，从不同地理产区获得的三种莳萝提取物对于皮肤衰老的作用。从中国非喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第一提取物，从埃及莳萝中获得的富含小分子量RNA的第二提取物，以及从喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第三提取物。
这项研究的目的是，评价这三种莳萝提取物对于与皮肤衰老有关的p16蛋白、角蛋白14(K14)和原纤维蛋白1表达的作用。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类皮肤活检组织离体培养。活检组织培养48小时(p16和K14)或72小时(原纤维蛋白1)，并且每天施用2次来自不同地理产区的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS 1X实现对照状况。施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织冷冻(原纤维蛋白1)或固定在甲醛中，再包含在石蜡中(p16和K14)。然后制成皮肤切片。对特定部位去标记后，进行p16、角蛋白14和原纤维蛋白1标记。免疫标记采用p16的特异性小鼠单克隆抗体(Abcam，参考号Ab54210)、角蛋白14的特异性兔单克隆抗体(Abcam，参考号Ab51054)、原纤维蛋白1的特异性小鼠单克隆抗体(Abcam，参考号Ab3090)，再采用与荧光色素偶联的抗小鼠或抗兔二次抗体(Invitrogen，参考号A21202和A21206)。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对经胶原蛋白I标记后获得的荧光强度进行定量。利用(Improvision)软件对经p16和K14标记后获得的荧光强度进行定量。利用ImageJ软件对经原纤维蛋白1标记后获得的纤维长度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表6中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理48小时(p16和K14)或72小时(原纤维蛋白1)，对比经PBS 1X处理后的对照状况，并对比根据实施例3和4，从中国非喜马拉雅莳萝和埃及莳萝中获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到p16表达的明显下降，角蛋白14表达的明显增强，以及纤维长度的明显增加。对于经不同的1％莳萝提取物离体处理48小时的皮肤，在p16标记定量时得到的结果(表6)在图6中得到更具体地体现。
表6：
结论：
与来自中国非喜马拉雅地区和埃及的富含小RNA的莳萝提取物(实施例3和4)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会抑制离体人类皮肤中p16的表达，并进一步刺激K14和原纤维蛋白1的表达。这些蛋白与皮肤衰老有关。因此，根据本发明获得的莳萝提取物，特别是喜马拉雅莳萝提取物，可以有效地对抗皮肤衰老迹象。
实施例19：通过E-钙粘蛋白研究，评价根据实施例5、6和7的莳萝提取物对于皮肤 屏障功能的作用
这项研究的目的是，比较三种喜马拉雅莳萝提取物对于皮肤屏障功能的作用。根据实施例5获得的富含小分子量RNA的第一提取物，根据实施例6获得的不含小分子量RNA的第二提取物，以及根据实施例7经浸渍后获得的第三提取物。
这项研究的目的是，评价这三种莳萝提取物对于影响细胞粘附作用的紧密连接蛋白，即E-钙粘蛋白表达的作用(Contreras RG，Shoshani L，Flores-Maldonado C，LazaroA，Monroy AO，Roldan ML，Fiorentino R，Cereijido M.E-cadherin and tight junstionsbetween epithelial cells of different animal species(E-钙粘蛋白以及不同动物物种上皮细胞之间的紧密连接)。Eur J Physiol.2002 444:467-475)。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类皮肤活检组织离体培养。活检组织培养48小时，并且每天施用2次根据实施例5、6和7的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS1X实现对照状况。施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。去标记后，利用E-钙粘蛋白的特异性兔多克隆抗体(Abcam，参考号Ab15148)，再利用与荧光色素偶联的抗兔二次抗体进行免疫标记(Invitrogen，参考号A21206)。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对获得的荧光强度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表7中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理48小时，对比经PBS1X处理后的对照状况，并对比根据实施例6(不含小分子量的RNA)和7(浸渍)，从喜马拉雅莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到E-钙粘蛋白表达的明显增强。对于经不同的1％莳萝提取物离体处理48小时的皮肤，在E-钙粘蛋白标记定量时得到的结果(表7)在图7中得到更具体地体现，其中在史蒂顿特氏t检验中：平均值+/-sem；n＝3；*：明显，～：基本明显(p＝0.057)，ns：不明显。
表7：
结论：
与不富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例6和7)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会进一步刺激离体人类皮肤中E-钙粘蛋白的表达。由于这种蛋白影响细胞粘附作用，因此根据本发明获得的莳萝提取物能够强化皮肤屏障。
实施例20：通过E-钙粘蛋的研究，分别评价根据实施例3、4和5的不同产地(中国非 喜马拉雅地区、埃及、中国喜马拉雅地区)的莳萝提取物对于皮肤屏障功能的作用
这项研究的目的是，比较根据实施例3、4、5，从不同地理产区获得的三种莳萝提取物对于皮肤屏障功能的作用。从中国非喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第一提取物，从埃及莳萝中获得的富含小分子量RNA的第二提取物，以及从喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第三提取物。
这项研究的目的是，评价这三种莳萝提取物对于影响细胞粘附作用的紧密连接蛋白，即E-钙粘蛋白表达的作用。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类皮肤活检组织离体培养。活检组织培养48小时，并且每天施用2次来自不同地理产区的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS1X实现对照状况。施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。去标记后，利用E-钙粘蛋白的特异性兔多克隆抗体(Abcam，参考号Ab15148)，再利用与荧光色素偶联的抗兔二次抗体进行免疫标记(Invitrogen，参考号A21206)。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对获得的荧光强度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表8中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理48小时，对比经PBS1X处理后的对照状况，并对比根据实施例3和4，从中国非喜马拉雅莳萝和埃及莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到E-钙粘蛋白表达的明显增强。对于经不同的1％莳萝提取物离体处理48小时的皮肤，在E-钙粘蛋白标记定量时得到的结果(表8)在图7中得到更具体地体现，
表8：
结论：
与来自中国非喜马拉雅地区和埃及的富含小RNA的莳萝提取物(实施例3和4)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会刺激离体人类皮肤中E-钙粘蛋白的表达。由于这种蛋白影响细胞粘附作用，因此根据本发明获得的莳萝提取物能够强化皮肤屏障。
实施例21：通过研究荧光黄在应激重组表皮(RHE)中的渗透，评价根据实施例5、6 和7的莳萝提取物对于皮肤屏障功能的作用
这项研究的目的是，对于受到SDS及大颗粒污染物(PM10)应激的重组皮肤，比较三种喜马拉雅莳萝提取物保持皮肤屏障功能的作用。根据实施例5获得的富含小分子量RNA的第一提取物，根据实施例6获得的不含小分子量RNA的第二提取物，以及根据实施例7经浸渍后获得的第三提取物。
荧光染料荧光黄渗透研究，是判断皮肤屏障状态的一种手段。
方案：
在插件上存在特异性培养基的情况下，培养直径8mm的人类皮肤的重组表皮(RHE)。活检组织培养72小时。每天施用2次根据实施例5、6和7的莳萝提取物，持续48小时，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％，然后施用1次0.15％的SDS，持续3小时，再施用1次100μg/ml的PM10，持续24小时。这两种对照状况是利用PBS 1X实现的，然后施用或不施用SDS和PM10。施用是采取150μl液滴覆盖在RHE表面上的方式实现的。处理后，对RHE施用0.5mg/ml的荧光黄，持续1小时。然后将RHE固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M)下检查RHE。利用(Improvision)软件对施用荧光黄后获得的荧光渗透情况进行定量。
结果：
SDS和PM10应激的施用导致皮肤屏障的可渗透性，这使得荧光黄产生渗透。
所得结果收录在下面的表9中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物在受到SDS和PM10应激前处理48小时，对比SDS和PM10应激前经PBS 1X处理后的对照状况，并对比根据实施例6(不含小分子量的RNA)和7(浸渍)，从喜马拉雅莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到荧光黄渗透深度减小。因此，根据本发明获得的莳萝提取物能增强皮肤屏障功能。
表9：
荧光黄的渗透(％)
应激对照 100
根据实施例5的喜马拉雅莳萝提取物+应激 77
根据实施例6的喜马拉雅莳萝提取物+应激 103
根据实施例7的喜马拉雅莳萝提取物+应激 112
结论：
富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)能够抑制荧光黄的渗透，因此能够在RHE受到SDS和PM10应激时增强屏障功能。不富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例6和7)没有此增强作用。
实施例22：通过研究荧光黄在应激重组表皮(RHE)中的渗透，分别评价根据实施例 3、4和5的不同产地(中国非喜马拉雅地区、埃及、中国喜马拉雅地区)的莳萝提取物对于皮 肤屏障功能的作用
这项研究的目的是，对于受到SDS及大颗粒污染物(PM10)应激的重组皮肤，比较根据实施例3、4、5，从不同地理产区获得的三种莳萝提取物使皮肤保持屏障功能的作用。从中国非喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第一提取物，从埃及莳萝中获得的富含小分子量RNA的第二提取物，以及从喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第三提取物。
荧光染料荧光黄在重组表皮中的渗透研究，是判断皮肤屏障状态的一种手段。
方案：
在插件上存在特异性培养基的情况下，培养直径为8mm的人类皮肤的重组表皮(RHE)。活检组织培养72小时。每天施用2次来自不同地理产区的莳萝提取物，持续48小时，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％，然后施用0.15％的SDS，持续3小时，再施用100μg/ml的PM10，持续24小时。这两种对照状况是利用PBS1X来实现的，然后施用或不施用SDS和PM10。施用是采取150μl液滴覆盖在RHE表面上的方式来实现的。处理后，对RHE施用0.5mg/ml的荧光黄，持续1小时。然后将RHE固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200M)下检查RHE。利用(Improvision)软件对施用荧光黄后获得的荧光黄渗透情况进行定量。
结果：
SDS和PM10应激的施用导致皮肤屏障的可渗透性，这使得荧光黄产生渗透。
所得结果收录在下面的表10中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物SDS和PM10应激前处理48小时，对比SDS和PM10应激前经PBS 1X处理后的对照状况，并对比根据实施例3和4，从中国非喜马拉雅地区莳萝和埃及莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到荧光黄渗透深度减小。
表10：
结论：
富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)能够抑制荧光黄的渗透，因此能够在RHE受到SDS和PM10应激时增强屏障功能。来自中国非喜马拉雅地区和埃及的富含小RNA的莳萝提取物(实施例3和4)没有此增强作用或作用较差。因此，根据本发明获得的莳萝提取物，特别是喜马拉雅莳萝提取物，能增强皮肤屏障功能。
实施例23：评价根据实施例5、6和7的莳萝提取物对于头皮的作用
这项研究的目的是，比较三种喜马拉雅莳萝提取物对于头皮的作用。根据实施例5获得的富含小分子量RNA的第一提取物，根据实施例6获得的不含小分子量RNA的第二提取物，以及根据实施例7经浸渍后获得的第三提取物。
这项研究的目的是，评价这三种莳萝提取物对于角蛋白14(K14)表达的作用，这种角蛋白是在表皮和头皮中表达的。这种蛋白质通过表皮细胞分化而被其他角蛋白所替代。在头发中，它在外根鞘中表达(Coulombe PA、Kopan R、Fuchs E.，Expression of keratinK14in the epidermis and hair follicle:insights into complex programs ofdifferentiation(角蛋白K14在表皮和头发毛囊中的表达：对复杂分化程序的见解)。JCB1989 109(5)：2295-312)是头皮健康良好状况的标志物。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类头皮活检组织离体培养。活检组织培养48小时，并且每天施用2次根据实施例5、6和7的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS1X实现对照状况。施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。对特定部位去标记后，进行角蛋白14标记。利用角蛋白14的特异性兔单克隆抗体(Abcam，参考号Ab51054)，再利用与荧光色素偶联的抗兔二次抗体进行免疫标记(Invitrogen，参考号A21206)。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对经K14标记后获得的荧光强度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表11中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理48小时，对比经PBS1X处理后的对照状况，并对比根据实施例6(不含小分子量的RNA)和7(浸渍)，从喜马拉雅莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到角蛋白14表达的明显增强。
表11：
K14的表达(％)
对照 100
根据实施例5的喜马拉雅莳萝提取物 123
根据实施例6的喜马拉雅莳萝提取物 104
根据实施例7的喜马拉雅莳萝提取物 93
结论：
与不富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例6和7)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会进一步刺激离体人类皮肤中K14的表达。角蛋白14与头皮健康良好状况有关。因此，根据本发明获得的莳萝提取物能够强化头发结构，改善其外观并提高其光滑度和韧性。
实施例24：分别评价根据实施例3、4和5的不同产地(中国非喜马拉雅地区、埃及、 中国喜马拉雅地区)的莳萝提取物对于头皮的作用
这项研究的目的是，比较根据实施例3、4、5，从不同地理产区获得的三种莳萝提取物对于头皮的作用。从中国非喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第一提取物，从埃及莳萝中获得的富含小分子量RNA的第二提取物，以及从喜马拉雅地区莳萝中获得的富含小分子量RNA的第三提取物。
这项研究的目的是，评价这三种莳萝提取物对于角蛋白14(K14)表达的作用，这种角蛋白是在表皮和头皮中表达的。
方案：
在插件上存在特异性培养基(DMEM 1g/L、HAM'S F12、SVF和抗生素)的情况下，维持直径6mm的人类头皮活检组织离体培养。活检组织培养48小时，并且每天施用2次来自不同地理产区的莳萝提取物，所述提取物用PBS稀释至1/100，即最终体积浓度为1％。利用PBS1X实现对照状况。施用是采取10μl液滴覆盖在活检组织表面上的方式来实现的。然后将活检组织固定在甲醛中，再包含在石蜡中。然后制成4μm厚的皮肤切片。对特定部位去标记后，进行角蛋白14标记。利用角蛋白14的特异性兔单克隆抗体(Abcam，参考号Ab51054)，再利用与荧光色素偶联的抗兔二次抗体进行免疫标记(Invitrogen，参考号A21206)。然后在Epi-荧光显微镜(Zeiss Axiovert200M)下检查活检组织。利用(Improvision)软件对经K14标记后获得的荧光强度进行定量。
结果：
所得结果收录在下面的表12中。利用根据实施例5，从喜马拉雅莳萝获得的富含小RNA的1％莳萝提取物处理48小时，对比经PBS1X处理后的对照状况，并对比根据实施例3和4，从中国非喜马拉雅地区莳萝和埃及莳萝获得的莳萝提取物处理结果，可以观察到角蛋白14表达的明显增强。
表12：
结论：
与来自中国非喜马拉雅地区和埃及的富含小RNA的莳萝提取物(实施例3和4)相比，富含小RNA的喜马拉雅莳萝提取物(实施例5)会进一步刺激离体人类皮肤中K14的表达。角蛋白14与头皮健康良好状况有关。因此，根据本发明获得的莳萝提取物，特别是喜马拉雅莳萝提取物，能够强化头发结构，改善其外观并提高其光滑度和韧性。

Claims (11)

1.一种化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品组合物中含有有效含量的莳萝(Anethum graveolens)地上部分的水性提取物，所述提取物富含最大长度为150个核苷酸的小RNA，该提取物作为活性成分包含在生理学上可接受的介质中，它是按照下述步骤从植物原料中获得的，其中：
a)将莳萝地上部分与水混合；
b)向a)中获得的混合物中加入乙二胺四乙酸(EDTA)四钠，其中混合物的pH值在10.5到11之间；
c)然后将b)中获得的混合物的pH值调节至6到8之间的值；
d)对c)中获得的混合物提纯，以除去残留的固态植物原料并获得纯化的水性粗提取物；以及
e)检测pH值并且在必要时重新调节至6到8之间，优选6到6.5之间的值。
2.根据权利要求1所述的化妆品组合物，其特征在于，所述富含最大长度为150个核苷酸的小RNA并且不含DNA的莳萝地上部分的水性提取物，以所述提取物的总重量计，含有10到30g/kg干提取物、2到10g/kg蛋白质片段、2到10g/kg糖类、0.2到3g/kg氨基酸、100到2000mg/kg酚类化合物以及10到100mg/kg最大长度为150个核苷酸的小分子量RNA，并且不含DNA。
3.根据权利要求2所述的化妆品组合物，其特征在于，所述提取物经溶剂稀释，并且以所述提取物的总重量计，含有5-15g/kg干提取物、50-1000mg/kg多酚、0.5-10g/kg蛋白质片段、0.5-10g/kg糖类、0.1到1g/kg氨基酸以及10-100mg/kg最大长度为150个核苷酸的小RNA。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的化妆品组合物，其特征在于，所述提取物是从喜马拉雅莳萝中获得的。
5.根据上述权利要求中任一项所述的化妆品组合物，其特征在于，所述提取物的浓度为组合物总重量的0.1到5％之间。
6.根据权利要求5所述的化妆品组合物，其特征在于，所述提取物的浓度为组合物总重量的0.5到2.5％之间。
7.根据上述权利要求中任一项所述的化妆品组合物，其特征在于，所述组合物被制成经口服施用或局部施用于皮肤的剂型。
8.一种根据权利要求1到7中任一项所述的组合物在化妆品中用于皮肤、头皮和表皮性组织护理的用途。
9.一种根据权利要求8所述的组合物在化妆品中用于改善皮肤滋润情况和增强屏障功能的用途。
10.一种根据权利要求8所述的组合物在化妆品中用于对抗皮肤衰老迹象和改善皮肤紧致度和弹性的用途。
11.一种根据权利要求8所述的组合物在化妆品中用于改善头发健康状况的用途。
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