WO2018206751A1 - Composition comprenant un extrait aqueux d'anethum graveolens enrichi en petits arn et ses utilisations cosmetiques - Google Patents

Composition comprenant un extrait aqueux d'anethum graveolens enrichi en petits arn et ses utilisations cosmetiques Download PDF

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WO2018206751A1
WO2018206751A1 PCT/EP2018/062186 EP2018062186W WO2018206751A1 WO 2018206751 A1 WO2018206751 A1 WO 2018206751A1 EP 2018062186 W EP2018062186 W EP 2018062186W WO 2018206751 A1 WO2018206751 A1 WO 2018206751A1
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WO
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extract
dill
skin
rna
enriched
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PCT/EP2018/062186
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Elodie OGER
Magali BONNANS
Jean-Marie Botto
Rachel CHABERT
Morgan DOS SANTOS
Shanshan Jiang
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Isp Investments Llc
Jala Group Co.
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    • A61K2800/805—Corresponding aspects not provided for by any of codes A61K2800/81 - A61K2800/95

Definitions

  • the invention relates to a process for obtaining an aqueous extract of Anethum graveolens enriched in small RNA (ribonucleic acids) of a maximum length of 150 nucleotides (nt) and the extracts obtained by the process and the compositions.
  • cosmetics comprising such extracts and their cosmetic uses.
  • the family Apiaceae (Apiaceae), also known as Umbelliferae, is composed of dicotyledonous plants and comprises nearly 3000 species distributed in 420 genera especially present in the temperate regions of the world. This family also includes herbs such as parsley, coriander, and fennel. Anethum graveolens, belongs to the family Apiaceae. Its species name admits several synonyms such as Anethum sowa, Peucedanum graveolens and Peucedanum sowa (Janeen et al, The Herb Society of America's Essential Guide to Dill, Kirtland, Ohio: The Herb Society of America, 2009).
  • the fragrant dill (Anethum graveolens) is widespread in the world and is a very rich species in different families of molecules such as essential oils, fatty acids, proteins, carbohydrates, furanocoumarin, polyphenols, minerals and many other biologically active molecules. It is particularly used in traditional medicine.
  • the name of dill derives from a Greek word “aneeson” or “aneeton” and means "strong smell”. This plant has a long and ancient history in many countries as a culinary and medicinal herb.
  • RNA of small molecular weight The protocols for extracting ribonucleic acids (RNA of small molecular weight) conventionally described are adapted to laboratory practices, and therefore carried out on a small scale. They use solvents that are not considered cosmetic solvents (Zumbo, P. 2014 "Phenol-chloroform Extraction", 2014). In addition, these extraction and purification protocols only make it possible to obtain the purified nucleic acid fraction. This fraction of nucleic acids RNA or DNA or small RNA is devoid of any other molecule of interest such as secondary metabolites, vitamins, sugars, peptides, etc. which can have beneficial effects for the skin and are therefore of cosmetic interest.
  • the invention firstly relates to a process for obtaining an aqueous extract of Anethum graveolens enriched in small RNAs having a length of at most 150 nucleotides from a plant material comprising the following steps:
  • EDTA tetrasodium ethylene diamine tetraacetic acid
  • At least one filtration of the aqueous crude extract is carried out to obtain the aqueous extract enriched in small RNAs of a length of at most 150 nucleotides whose pH is controlled and if necessary readjusted to a value between 6 and 8, preferably between 6 and 6.5.
  • the subject of the invention is an aqueous extract of the aerial parts of Anethum graveolens enriched in small RNAs of a length of at most 150 nucleotides and devoid of DNA, obtained by the process according to the invention, characterized in that it comprises by weight of the total weight of the extract, from 5 to 30 g / kg of dry extract, 0.5 to 10 g / kg of protein fragments, 0.5 to 10 g / kg of sugars 0.1 to 3 g / kg of amino acids, 50 to 2000 mg / kg of phenolic compounds and 10 to 100 mg / kg of small molecular weight RNA with a length of at most 150 nucleotides.
  • the third object of the invention is a composition comprising, as an anti-aging active agent, an extract according to the invention, and a physiologically acceptable medium.
  • the invention more particularly relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising, as an active agent, in a physiologically acceptable medium, an effective amount of an aqueous extract of the aerial parts of dill (Anethum graveolens) enriched in small amounts of RNA.
  • an aqueous extract of the aerial parts of dill Anethum graveolens
  • EDTA Tetrasodium
  • the pH is controlled and readjusted if necessary to a value between 6 and 8, preferably between 6 and 6.5.
  • the invention also relates to the cosmetic use of a composition according to the invention for the care of the skin, scalp and integuments.
  • Bioanalyzer representing the quantification of the RNAs of a dill extract from Himalayan China obtained according to Example 5;
  • FIG. 2 represents a graph resulting from a Bioanalyseur® analysis representing the quantification of the RNAs of a dill extract from Himalayan China obtained after the precipitation step of the small RNAs according to Example 6;
  • Figure 3 shows a graph resulting from a Bioanalyseur® analysis representing the quantitation of RNA from a dill extract from Himalayan China obtained by conventional extraction according to Example 7;
  • FIG. 4 represents the quantification of the length of the fibers after immunofluorescent staining of elastin on ex vivo skin treated for 72 h with different extracts of 1% dill;
  • FIG. 5 represents the quantification of the labeling of hyaluronic acid (HA) on ex vivo skin treated for 72 hours with different extracts of 1% dill;
  • Figure 6 represents the quantification of pl6 labeling on ex vivo skin treated for 48h with different extracts of 1% dill.
  • Figure 7 represents the quantification of E-cadherin labeling on ex vivo skin treated for 48 hours with different extracts of 1% dill.
  • the invention relates to a method for obtaining an aqueous extract enriched in small RNAs having a length of at most 150 nucleotides from dried or fresh aerial parts of dill. More particularly, the invention relates to a cosmetic composition comprising, as an active agent, in a physiologically acceptable medium, an effective amount of an aqueous extract of the aerial parts of dill (Anethum graveolens) enriched in small RNAs of a length. of at most 150 nucleotides obtained from a plant material according to the steps of the process according to the invention.
  • Dill (Anethum graveolens) means, for example, species from the Himalayas, Egypt and non-Himalayan China; preferentially the extract is obtained from Himalayan dill.
  • Heart parts means the leaves, stems and flowers of dill.
  • RNA Ribonucleic acid
  • RNA ribonucleic acid
  • a) of the process according to the invention the plant material is brought into contact with the ground aerated parts of dill with water, preferably in a vegetable matter / water ratio of 4 to 20% by weight. weight, more preferably in a ratio of 5 to 10%, for example in a ratio of 5.7 or 10 w / w.
  • the water used is a distilled or demineralised water or a water rich in mineral salts and / or trace elements, preferably distilled water.
  • Preferably the aerial parts of the dill are in dry form.
  • the plant material is milled before being placed in the presence of water in step a). Grinding is a mechanical action that allows better extraction. Mechanical grinding followed by alkaline lysis in the presence of EDTA promotes the complete destructuration of the cell membrane and in particular of the nuclear membrane.
  • Tetrasodium EDTA is then added in a step b) to the mixture obtained in a).
  • the pH at this stage is basic and should be adjusted, if necessary, to a value between 10.5 and 11 by the addition of sodium hydroxide (NaOH).
  • NaOH sodium hydroxide
  • step b) it is essential to maintain the basic pH between 10.5 and 11. In fact, this pH level, associated with the action of EDTA, causes the destructuring of the cell membrane, including nuclear membrane, lysis of cells and denaturation of DNA (the two strands of the double helix are separated).
  • the pH control in step b) shows that it remains basic and stabilizes between 9 and 11.
  • the concentration of tetrasodium EDTA is preferably between 2 and 15 mM, and more preferably 10 mM.
  • the concentration is chosen to optimize the extraction yield of the small molecular weight RNAs in the final extract.
  • Tetrasodium EDTA will weaken, destructure the pectocellulosic membranes of plant cells by sequestering by complexation divalent ions such as calcium ions that form ionic bridges between the pectin molecules surrounding the cellulose microfibrils. This has the effect of promoting the release of cellular content during extraction.
  • the EDTA treatment step is essential to enrich the small molecular weight RNA extract.
  • the EDTA treatment step preferably lasts at least 1 h at a temperature of between 20 and 80 ° C. During this step, the mixture obtained in a) is advantageously stirred.
  • a step c) the pH of the mixture obtained in b) is then adjusted to a value of between 6 and 8.
  • the pH is adjusted by addition of a solution of hydrochloric acid (HCl) or any acid that can regulate the pH that is compatible with a cosmetic use such as citric or lactic acid.
  • HCl hydrochloric acid
  • any acid that can regulate the pH that is compatible with a cosmetic use such as citric or lactic acid.
  • a step d) the mixture obtained in c) is purified so as to remove the plant material and recover an aqueous crude extract. Any method known to those skilled in the art may be used.
  • the mixture obtained in c) is centrifuged at low speed, for example for at least 10 min at 4000 g, so as to sediment the residual plant material in the pellet and recover an aqueous crude extract in the supernatant.
  • a step d) the pH is controlled and readjusted to a value between 6 and 8.
  • the pH is readjusted to a value between 6 and 6.5, even more preferably at 6.5.
  • the pH is readjusted by adding a solution of hydrochloric acid (HC1) or sodium hydroxide (NaOH).
  • a pH below 6 can lead to the precipitation of nucleic acids in general, so that of RNA of small molecular weight of up to 150 nucleotides in length.
  • step of adjusting the pH in step d) of the process according to the invention is an essential step for the optimal extraction of small molecular weight RNAs.
  • the readjustment of the pH of step d) is preceded by at least one filtration of the aqueous crude extract obtained in d).
  • successive filtrations will be carried out by lowering the filtration threshold from 50 to 20 ⁇ to 0.4, 0.3, 0.2, or 0.1 ⁇ .
  • the second subject of the invention is an aqueous extract of dill enriched with small RNAs having a length of at most 150 nucleotides of the invention obtained by the method described above.
  • This extract does not contain DNA (deoxyribonucleic acid).
  • Such an aqueous extract enriched in small RNAs having a length of at most 150 nucleotides comprises, before dilution, by weight of the total weight of the extract, 10 to 30 g / kg of dry weight extract, 2 to 10 g / kg of protein fragments, 2 to 10 g / kg of sugars, 0.2 to 3 g / kg of amino acids, 100 to 2000 mg / kg of phenolic compounds and 10 to 100 mg / kg of small weight RNA molecular weight of up to 150 nucleotides in length.
  • the extract thus obtained is considered concentrated. It can then be diluted in a physiologically acceptable solvent for cosmetic use, so that the concentration of the extract is then adjusted to a particular dry weight of interest.
  • physiologically acceptable solvents mention may be made of water, glycerol, ethanol, propanediol and its natural version called Zemea® from corn, butylene glycol, dipropylene glycol, ethoxylated or propoxylated diglycols, cyclic polyols or any mixture of these solvents.
  • the extract obtained by the process according to the invention is diluted in a solvent such as 30% of glycerol and water, and comprises by weight of the total weight of the extract.
  • the extract obtained by the process according to the invention further comprises from 5-15 g / kg of solids, from 50 to 1000 mg / kg of polyphenols, 0.5-10 g / kg of protein fragments, 0.5 -10 g / kg of sugars, 0.1 to 1 g / kg of amino acids and 10-100 mg / kg of small RNAs with a length of at most 150 nucleotides.
  • RNA RNA enriched in small molecular weight RNA (up to 150 nucleotides in length) is obtained from dill (Anethum graveolens) of the family Apiaceae.
  • a first step 5% of dried aerial parts of dill in powder form are placed in distilled water and 10 mM of tetrasodium EDTA are added, ie 50 g of dried dill powder in 950 g of distilled water and 3.8 g of tetrasodium EDTA.
  • the pH at this stage should be basic and between 10.5 and 11 for optimal enrichment of the low molecular weight RNA extract.
  • the mixture is then heated for 2 hours at 55 ° C. with stirring.
  • the mixture is then centrifuged for 10 min at 4000 g to remove the solid material.
  • the pH is controlled, before possible dilution, to place it if necessary between 6 and 6.5 and preserve the small RNA extract.
  • Sequential filtrations on decreasing porosity filters are then carried out in order to clarify the plant extract until a sterilizing filtration at 0.2 ⁇ m.
  • an aqueous extract of light green dill is obtained, grading 10 to 30 g / kg of weight extract. dry, 2 to 10 g / kg of protein fragments, 2 to 10 g / kg of sugars, 0.1 to 3 g / kg of amino acids, 300 to 750 mg / kg of phenolic compounds and 10 to 100 mg / kg small molecular weight RNA of up to 150 nucleotides in length.
  • the extracts obtained may show significant variability depending on factors such as the place of harvest, year of harvest, season, climatic conditions, etc.
  • Example 2 In the extraction of Example 1, an aqueous extract was obtained containing 12 g / kg of dry weight extract.
  • the physicochemical analysis shows that this extract has a concentration of 2.55 g / kg of protein fragments, 3 g / kg of sugars, 340 g / kg of amino acids, 650 mg / kg of phenolic compounds and 50 mg / kg of small molecular weight RNA with a length of at most 150 nucleotides.
  • the extract is then diluted with a cosmetic solvent, in particular with 30% glycerin or butylene glycol or propanediol.
  • the extract After dilution, the extract has a concentration of 1.7 g / kg of protein fragments, 2 g / kg of sugars, 240 g / kg of amino acids, 455 mg / kg of phenolic compounds and 35 mg / kg of RNA of small molecular weight of up to 150 nucleotides in length.
  • the total protein content of the dill extract was determined by a Lowry protein assay (Lowry et al., 1951). The absorbance of the sample is read on the spectrophotometer at 550 nm. The protein content is determined using a standard BSA curve.
  • the amino acid content of the extract was determined from a protocol published by Moore et al (1948), the free amino acid content of the extract was evaluated by the formation of a colored complex, continued at the break of the functions amine and carboxylic acid by the ninhydrin reagent. The absorbance of the complex is read on the spectrophotometer at 570 nm. The total amino acid content is determined relative to an amino acid pool as standard.
  • the total sugar content of the extract was determined by an adaptation of the assay described by Dubois et al. (1956) (Dubois et al., "Colorimetric method for the determination of sugars and related substances", Anal Chem, 1956, 28 (3), 350-356). This analysis consists of dissolving the raw material in concentrated sulfuric acid and then reacting with phenol to form a colored complex. The absorbance of the complex is read on the spectrophotometer at 490 nm. The sugar content is determined using a standard glucose curve.
  • the polyphenol content of the extract was determined using the Folin-Ciocalteu assay (Singleton et al., Analysis of Total Phenols and Other Oxidation and Antioxidant Substrates Using the Folin-Ciocalteu Reagent, 1999). , 299: 152).
  • the polyphenol compounds in the sample react with the Folin-Ciocalteu reagent, the oxidation of the reagent gives a blue color.
  • the absorbance of the sample is read on the spectrophotometer at 760 nm. The content was expressed in gallic acid equivalents using a standard gallic acid curve.
  • RNAs The quantification of low molecular weight RNAs by means of a Bioanalyseur® (Agilent) which allows miniaturized electrophoresis to be carried out using electronic chips specific to nucleic acid analysis such as small molecular weight RNAs. It allows to determine the size and concentration contained in an extract from a few microliters. The result is in the form of a graph with an arbitrary fluorescence unit on the ordinate (FU) and on the abscissa the number of nucleotides (nt). An internal marker is added to each analysis (peak at 25 nt in the figure 1, 2 and 3), and serves as an internal control to validate the smooth running of the analysis.
  • FU ordinate
  • abscissa the number of nucleotides
  • Example 3 Preparation of a dill extract from China non-Himalayan region (Anethum graveolens) of the family Apiaceae, enriched in small RNA
  • RNA RNA enriched in small molecular weight RNA (up to 150 nucleotides in length) is obtained from dill (Anethum graveolens) of the family Apiaceae.
  • a first step 5% of dried aerial parts of dill from China non-Himalayan region in powder form are placed in distilled water and 10 mM of tetrasodium EDTA are added, ie 50 g of dill powder dried in 950 g of distilled water and 3.8 g of tetrasodium EDTA.
  • the pH at this stage should be basic and between 10.5 and 11 for optimal enrichment of the low molecular weight RNA extract.
  • the mixture is then heated at 55 ° C. with stirring.
  • the mixture is then centrifuged for 10 min at 4000 g to remove the solid material.
  • the pH is controlled, before possible dilution, to place it if necessary between 6 and 6.5 and preserve the small RNA extract.
  • Sequential filtrations on decreasing porosity filters are then performed in order to clarify the plant extract to a filtration of 0.2 ⁇ m.
  • an aqueous extract of light green dill is obtained, titrating 10 to 30 g / kg of dry weight extract, 2 to 10 g / kg of protein fragments, 2 to 10 g / kg of sugars, 0, 1 to 3 g / kg of amino acids, 300 to 750 mg / kg of phenolic compounds and 10 to 100 mg / kg of small molecular weight RNA with a length of at most 150 nucleotides.
  • the extracts obtained may significant variability based on factors such as location of harvest, year of harvest, season, weather conditions, etc.
  • the physicochemical analysis shows that this extract has a concentration of 2.5 g / kg of protein fragments, 3 g / kg of sugars, 340 g / kg of amino acids, 650 mg / kg of phenolic compounds and 50 mg / kg of small molecular weight RNA with a length of at most 150 nucleotides.
  • the extract is then diluted with water or a mixture of water and a cosmetic solvent, especially with 30% glycerin or butylene glycol or propanediol to obtain an extract at 8 g / kg dry weight.
  • the extract After dilution, the extract has a concentration of 1.7 g / kg of protein fragments, 2 g / kg of sugars, 240 g / kg of amino acids, 455 mg / kg of phenolic compounds and 35 mg / kg of RNA of small molecular weight of up to 150 nucleotides in length.
  • the total protein content of the dill extract was determined by a Lowry protein assay (Lowry et al., 1951). The absorbance of the sample is read on the spectrophotometer at 550 nm. The protein content is determined using a standard BSA curve.
  • the amino acid content of the extract was determined from a protocol published by Moore et al (1948), the free amino acid content of the extract was evaluated by the formation of a colored complex, continued at the disruption of the amino and carboxyl functions by the ninhydrin reagent. The absorbance of the complex is read on the spectrophotometer at 570 nm. The total amino acid content is determined relative to an amino acid pool as standard. The total sugar content of the extract was determined by an adaptation of the assay described by Dubois et al. (1956) (Dubois et al., "Colorimetric method for the determination of sugars and related substances", Anal Chem, 1956, 28 (3), 350-356).
  • This analysis consists of dissolving the raw material in concentrated sulfuric acid and then reacting with phenol to form a colored complex.
  • the absorbance of the complex is read on the spectrophotometer at 490 nm.
  • the sugar content is determined using a standard glucose curve.
  • the polyphenol content of the extract was determined using the Folin-Ciocalteu assay (Singleton et al., Analysis of Total Phenols and Other Oxidation and Antioxidant Substrates Using the Folin-Ciocalteu Reagent, 1999). , 299: 152).
  • the polyphenol compounds in the sample react with the Folin-Ciocalteu reagent, the oxidation of the reagent gives a blue color.
  • the absorbance of the sample is read on the spectrophotometer at 760 nm. The content was expressed in gallic acid equivalents using a standard gallic acid curve.
  • Example 4 Preparation of an extract of dill (Anethum graveolens) of the family Apiaceae, enriched in small RNA from Egypt.
  • a first step 5% of dried aerial parts of Egyptian dill in powder form are placed in distilled water and 10 mM of tetrasodium EDTA are added, ie 50 g of dried dill powder in 950 ml. g distilled water and 3.8 g tetrasodium EDTA.
  • the pH at this stage should be basic and between 10.5 and 11 for optimal enrichment of the low molecular weight RNA extract.
  • the mixture is then heated at 55 ° C. with stirring.
  • the mixture is then centrifuged for 10 min at 4000 g to remove the solid material.
  • the pH is controlled, before possible dilution, to place it if necessary between 6 and 6.5 and preserve the small RNA extract.
  • Sequential filtrations on decreasing porosity filters are then performed in order to clarify the plant extract until filtration at 0.2 ⁇ m porosity.
  • the physico-chemical analysis shows that this extract has a concentration of 4.3 g / kg of protein fragments, 3.1 g / kg of sugars, 650 g / kg of amino acids, 720 mg / kg of phenolic compounds and 46 mg / kg of small molecular weight RNA with a length of at most 150 nucleotides.
  • the extract is then diluted with water or a mixture of water and a cosmetic solvent, in particular with 30% glycerin or butylene glycol or propanediol.
  • the extract After dilution, the extract has a concentration of 1.8 g / kg of protein fragments, 1.5 g / kg of sugars, 360 g / kg of amino acids, 490 mg / kg of phenolic compounds and 32 mg / kg of RNA of small molecular weight with a length of at most 150 nucleotides.
  • Example 5 Preparation of an extract of dill (Anethum graveolens) of the family Apiaceae, enriched in small RNA from China, Himalayan region.
  • the extraction process is the same as in Example 3 (and 4) only the geographical origin of origin of the dill is different here the Himalayan region.
  • a first step 5% of dried aerial parts of dill from China, Himalayan region, in powder form are placed in distilled water and 10 mM of tetrasodium EDTA are added, ie 50 g of powder of dried dill in 950 g of distilled water and 3.8 g of tetrasodium EDTA.
  • the pH at this stage should be basic and between 10.5 and 11 for optimal enrichment of the low molecular weight RNA extract.
  • the mixture is then heated at 55 ° C. with stirring.
  • the mixture is then centrifuged for 10 min at 4000 g to remove the solid material.
  • the pH is controlled, before possible dilution, to place it if necessary between 6 and 6.5 and preserve the small RNA extract.
  • Sequential filtrations on decreasing porosity filters are then performed in order to clarify the plant extract until filtration at 0.2 ⁇ m porosity.
  • this extract has a concentration of 4.5 g / kg of protein fragments, 2.8 g / kg of sugars, 670 g / kg of amino acids, 650 mg / kg of phenolic compounds and 90 mg / kg of small molecular weight RNA with a length of at most 150 nucleotides.
  • the extract is then diluted with water or a mixture of water and a cosmetic solvent, in particular with 30% glycerin or butylene glycol or propanediol.
  • the extract After dilution, the extract has a concentration of 2.3 g / kg of protein fragments, 1.7 g / kg of sugars, 470 g / kg of amino acids, 455 mg / kg of phenolic compounds and 65 mg / kg of RNA of small molecular weight with a length of at most 150 nucleotides.
  • RNA quantification of the low molecular weight RNAs was carried out using a Bioanalyseur® (Agilent) which makes it possible to perform miniaturized electrophoresis using specific electronic chips of nucleic acid analysis such as small molecular weight RNAs. . It allows to determine the size and concentration contained in an extract from a few microliters.
  • the result is as a graph with an arbitrary fluorescence unit on the ordinate (FU) and on the abscissa the number of nucleotides (nt) as shown in Figure 1.
  • An internal marker is added to each analysis (peak at 25 nt on Figure 1, 2 and 3), and serves as an internal control to validate the smooth running of the analysis.
  • Example 6 Study of the influence of the final pH in the preparation of extracts of dill (Anethum graveolens) from China, Himalayan region, in order to obtain a dill extract devoid of small RNAs
  • the extraction process is carried out under the same operating conditions as Example 3, 4 and 5, to enrich a small molecular weight RNA extract, except for the final pH adjustment step.
  • This extraction process is carried out with a tetrasodium EDTA treatment step, but with a final adjustment of the extract at an acidic pH of between 4 and 4.5 instead of a pH of between 6 and 8.
  • Example 7 Production of a conventional extract obtained by maceration of dill (Anethum graveolens) from China, Himalayan region. Demonstration of the role of an EDTA treatment step in the implementation of a small RNA extraction process
  • an extract of dill (Anethum graveolens) was also obtained, modifying certain essential steps of method according to the invention, not allowing to enrich the RNA extract of small molecular weight.
  • 5% of dill is crushed and then water is added, ie 50 g of dill in 950 g of distilled water.
  • the pH is measured and is 5.5, the mixture is stirred for 1 h at 55 ° C.
  • the extract is centrifuged for 10 min at 4000 g to remove the solid matter.
  • Sequential filtrations are then carried out on decreasing porosity filters with a size of between 50 and 20 ⁇ m and then up to a porosity of 0.4 to 0.3 ⁇ m.
  • a light green aqueous extract is then obtained, titrating at 13 g / kg of dry weight extract, containing 3.3 g / kg of protein fragments, 2.2 g / kg of sugars, 380 mg / kg of acids. amino, and 410 mg / kg of phenolic compounds.
  • the extract is then diluted to be 8 g / kg dry weight, by only adding water.
  • the physico-chemical analysis shows that, after dilution, the plant extract has a protein fragment concentration of 2.8 g / kg, and sugars of 1.7 g / kg, in amino acids of 240 mg / kg, and in phenol compounds of 280 mg / kg.
  • the Bioanalyseur® analysis indicates that the concentration of low molecular weight RNA is zero for this extract (as shown in Figure 3).
  • This result confirms that an extract obtained from an extraction process in the absence of EDTA treatment (at basic pH) does not contain low molecular weight RNA.
  • the EDTA treatment step is essential to obtain an extract rich in low molecular weight RNA according to the invention.
  • the aqueous extracts enriched in small RNA obtained according to the invention are advantageously used in the preparation of cosmetic compositions comprising, for active agent, an effective amount of such an extract of small RNA according to the invention, and a physiologically acceptable medium.
  • effective amount is meant the minimum amount of extract according to the invention which is necessary to obtain the activity of the extract, in particular cosmetic and more particularly to improve the appearance of the skin, to fight against the signs of aging cutaneous or for the improvement of the hydration of the skin, without this quantity being toxic.
  • the small RNA extract according to the invention is used, preferably diluted in a cosmetic solvent, at a dry weight of between 5 and 15 g / kg.
  • the small RNA extract according to the invention is present in the composition at a concentration of 0.1 to 5% by weight relative to the total weight of the composition, and preferably at a concentration of between 0.5%. and 2.5% by weight relative to the total weight of the composition.
  • a physiologically acceptable medium means a vehicle adapted for contact with the outer layers of the skin or mucous membranes, without toxicity, irritation, undue and similar allergic response or intolerance reaction, and proportionate to a reasonable benefit / risk ratio.
  • compositions that can be used according to the invention can be applied by any appropriate route, in particular oral or external topical, and the formulation of the compositions will be adapted by those skilled in the art.
  • composition according to the invention can be formulated to be administered orally.
  • the dosage forms used may be in solid or liquid form.
  • Solid oral forms are generally tablets, hard capsules (capsules), soft capsules, sachets comprising a powder or granules.
  • Liquid oral forms are usually oral solutions, syrups, elixirs, drinkable emulsions, oral suspensions, drinkable drops.
  • compositions according to the invention are in a form suitable for topical application.
  • These compositions must therefore contain a physiologically acceptable medium, that is to say compatible with the skin and integuments, without risk of discomfort during their application and cover all the appropriate cosmetic forms.
  • topical application it is meant to apply or spread the aqueous extract enriched in small RNA according to the invention, and more particularly a composition containing it, on the surface of the skin or mucosa.
  • Skin refers to the skin of the face, including the eye area and mouth, nose, forehead, neck, hands, but also the skin of the entire body.
  • compositions for the implementation of the invention may especially be in the form of an aqueous solution, hydro-alcoholic or oily, an oil-in-water emulsion, water-in-oil or multiple emulsions; they may also be in the form of suspensions, or powders, suitable for application to the skin, mucous membranes, lips and / or hair.
  • compositions may be more or less fluid and may also have the appearance of a cream, lotion, milk, serum, ointment, gel, paste or paste. a foam. They can also be in solid form, as a stick or be applied to the skin in aerosol form.
  • adjuvants necessary for the formulation such as solvents, thickeners, diluents, antioxidants, dyes, sunscreens, self-tanning agents, pigments, fillers, preservatives, perfumes, odor absorbers, essential oils, vitamins, essential fatty acids, surfactants, film-forming polymers, etc.
  • these adjuvants and their proportions are chosen so as not to adversely affect the desirable properties of the composition according to the invention.
  • These adjuvants may, for example, correspond to 0.01 to 20% of the total weight of the composition.
  • the fatty phase may represent from 5 to 80% by weight and preferably from 5 to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition are chosen from those conventionally used in the field under consideration. For example, they may be used in a proportion ranging from 0.3 to 30% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the aqueous extract enriched in small RNA according to the invention may be encapsulated or included in a cosmetic vector such as liposomes or any other nanocapsule or microcapsule used in the field of cosmetics or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites.
  • a cosmetic vector such as liposomes or any other nanocapsule or microcapsule used in the field of cosmetics or adsorbed on powdery organic polymers, mineral supports such as talcs and bentonites.
  • composition according to the invention may comprise, in addition to the active agent according to the invention, at least one other active agent having cosmetic effects similar to and / or complementary to those of the invention.
  • this active agent is defined as an "additional active agent”.
  • the additional active agent (s) may be chosen from: anti-aging, firming, lightening, moisturizing, draining, microcirculatory promoting agents, exfoliants, desquamating agents, stimulating the extracellular matrix, activating energy metabolism, antibacterials, antifungal agents, soothing, anti-radical, anti-UV, anti-acne, anti-inflammatory, anesthetic, providing a feeling of warmth, providing a feeling of freshness, slimming.
  • Such additional active agents may be selected from the groups comprising:
  • vitamin A and in particular retinoic acid, retinol, retinol proprionate, retinol palmitate;
  • vitamin B3 and more particularly niacinamide, tocopherol nicotinate;
  • vitamin B5 vitamin B6, vitamin B12, panthenol
  • vitamin C especially ascorbic acid, ascorbyl glucoside, ascorbyl tetrapalmitate, magnesium and sodium ascorbyl phosphate;
  • metalloproteinase inhibitors or a TIMP activator
  • amino acids such as arginine, ornithine, hydroxyproline, hydroxyproline dipalmitate, palmitoylglycine, hydroxylysine, methionine and its derivatives, N-acylated amino acid compounds;
  • the natural or synthetic peptides including di-, tri-, tetra-, penta- and hexapeptides and their lipophilic derivatives, isomers and complexed with other species such as a metal ion (for example copper, zinc, manganese) , magnesium, and others).
  • a metal ion for example copper, zinc, manganese
  • Examples include peptides commercially known under the name of Matrixyl ® (SEDERMA®) ARGIRELINE ® (LIPOTEC®) Chronogen TM, LAMINIXYL IS TM, Peptide Q10 TM, Collaxyl TM (patent FR2827170, ASHLAND® ), PEPTIDE VINCI 01 TM (patent FR2837098, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 02 TM (patent FR2841781, ASHLAND®), ATPeptide TM (patent FR2846883, ASHLAND®) or the synthetic peptide Arg-Gly-Ser-NH2 sequence marketed under the name ATPeptide TM by ASHLAND®; extract of Artemia salina, marketed under the name GP4G TM (FR2817748, ASHLAND®);
  • plant peptide extracts such as flax extracts (Lipigenin TM, patent FR2956818, ASHLAND®), extracts of soya, spelled, grapevine, rapeseed, flax, rice, maize, pea;
  • yeast extracts for example Dynagen TM (patent FR2951946, ASHLAND®) or Actopontine TM (patent FR2944526, ASHLAND®);
  • DHA - dehydroacetic acid
  • salicylic acid and its derivatives alpha- and beta-hydroxy acids, silanols;
  • extracts of polyphenols such as isoflavones, flavonoids, such as grape extracts, pine extracts, olive extracts;
  • lipids such as ceramides or phospholipids, oils of animal origin, such as squalene or squalane; vegetable oils, such as sweet almond oil, coconut oil, castor oil, jojoba oil, olive oil, rapeseed oil, peanut oil, sunflower oil, wheat germ oil, corn germ oil, soya bean oil, cotton, alfalfa, poppy, pumpkin, evening primrose, millet, barley, rye, safflower, passionflower, hazelnut, palm, apricot kernel, avocado, calendula ; ethoxylated vegetable oils, shea butter;
  • cyclic AMP and its derivatives the activating agents of the adenylate cyclase enzyme and the phosphodiesterase enzyme inhibiting agents, the Centella asiatica extract,
  • Asiaticoside and Asian acid methyl xanthines, theine, caffeine and its derivatives, theophylline, Theorobromine, forskolin, esculin and esculoside, ACE inhibitors, Val-Trp peptide, neuropeptide Y inhibitors, enkephalin, Ginkgo biloba extract, dioscorea extract, rutin, yerba mate extract, guarana extract, oligosaccharides, polysaccharides, carnitine, ivy extract, fucus extract, hydrolyzed Prunella vulgaris extract, hydrolyzed Celosia extract cristata, Anogeissus leiocarpus extract, Manihot utilisissima leaf extract, palmitoylcarnitine, carnosine, taurine, elderberry extract, seaweed extracts such as Palmaria Palmata extract.
  • Tetrasodium EDTA Tetrasodium EDTA 0.01
  • phase C In a separate beaker, mix until homogeneous. Sprinkle in phase D and mix well until well blended;
  • phase E At 25 ° C, add phase E to the main container and mix until homogeneous;
  • premix phase F add it to the main container and mix until homogeneous
  • the composition is thus in the form of a violet pearly cream gel, with a pH of between 5.70 and 6.20 and a viscosity (OD) of 80000 - 130000 cps (Brookfield RVT / Spindle C / 5 RPM / 1 minute / 25 ° C).
  • phase C is added to the main vessel and homogenize for 10 minutes;
  • phase E at 60 ° C. Mix well to homogenize for 10 minutes;
  • phase G before adding it to the main container; 10. Add phase G at 35 ° C. Mix well to homogenize;
  • phase H sprinkle Natrosol TM in water at room temperature and homogenize while heating at 60 ° C;
  • composition is thus in the form of a cream butter rose, with a pH between 4.90 and 5.40 and a viscosity (D0) of 160000 - 210000 cps (Brookfield RVT / Spindle D / 5 RPM / 1 minute / 25 ° C).
  • Disodium EDTA Disodium EDTA 0.10
  • phase A 1. In a beaker at room temperature, weigh the ingredients of phase A and mix. Sprinkle phase B and homogenize;
  • phase D At room temperature, add phase D to phase ABC and continue homogenizing;
  • the composition is thus in the form of a smooth gel, translucent, creamy yellow, with a pH between 6.30 and 7.10 and a viscosity (D0) of 10,000-15,000 cps (Brookfield RVT / Spindle B / 5 RPM / 1 minute / 25 ° C).
  • Tetrasodium EDTA Tetrasodium EDTA 0.05
  • phase D in a separate beaker and add to the main container at 25 ° C;
  • phase E is added to the main container and mix well;
  • phase G into a separate beaker and add to the main container until homogeneous
  • composition is thus in the form of a cream gel with scintillating green effects, with a pH of between 5.30 and 5.80 and a viscosity (D0) of 70000 - 100000 cps (Brookfield RVT / Spindle C / 5 RPM / 1 minute / 25 ° C).
  • composition is thus in the form of a smooth serum, semi-opaque, with a pH between 5.75 and 6.25 and a viscosity (D0) of 1,100 - 1,400 cps (Brookfield RVT / spindle 3/20 rpm / 25 ° C / 1 minute).
  • the invention relates to the cosmetic use of a composition according to the invention for the care of the skin, scalp and integuments.
  • the invention relates in particular to the cosmetic use of the composition according to the invention to improve the appearance of the skin, to fight against the signs of skin aging or to improve cutaneous hydration.
  • dander we mean substances naturally present in the human body or the animal body rich in keratin, and more particularly the hair, the hair, the eyelashes, the eyebrows and the nails.
  • the use and the compositions according to the present invention are particularly intended for the hair.
  • the invention relates more particularly to the cosmetic use of a composition according to the invention for improving the hydration of the skin and reinforcing the barrier function.
  • the invention also relates more particularly to the cosmetic use of a composition according to the invention for combating the signs of skin aging and improving the firmness and elasticity of the skin.
  • the invention also relates to the cosmetic use of a composition according to the invention for improving the health of the hair.
  • improving the appearance of the skin is meant that the grain of the skin appears finer, the brightness more intense and the complexion more homogeneous.
  • “Signs of skin aging” means any changes in the appearance of the skin due to aging such as, for example, fine lines and wrinkles, cracks, bags under the eyes, dark circles, wilting, loss of skin. elasticity, firmness and / or tone of the skin, but also any internal changes in the skin that do not systematically result in a modified external appearance such as, for example, thinning of the skin, or any internal damage to the skin. skin resulting from environmental stresses such as pollution and UV radiation.
  • skin hydration enhancement is meant any improvement in skin surface changes due to dehydration, such as drought, tightness and discomfort.
  • improving the health of the hair is meant a strengthening of the structure of the hair to improve their appearance and to promote their smoothing and resistance.
  • the aim of this study is to compare the effects on the extracellular matrix of the dermis of three extracts of Himalayan dill.
  • the first extract enriched in RNA of small molecular weight, obtained according to Example 5 the second extract containing no RNA of small molecular weight, obtained according to Example 6 and the last extract obtained after maceration according to Example 7 .
  • the aim of this study is to evaluate the effects of these three dill extracts on the expression of the collagen I, dermatopontin and elastin proteins involved in the structure of the extracellular matrix.
  • Collagen and elastin are very important for maintaining the elasticity and firmness of the skin.
  • Dermatopontin is localized on collagen fibers (Forbes EG, Cronshaw AD, MacBeath JRE, Hulmes DJS, tyrosine-rich acidic matrix protein (TRAMP) is a tyrosine-sulphated and widespread distributed protein of the extracellular matrix, FEBS Lett 1994 351 (3): 433-6). It facilitates fibrogenesis, stabilizes collagen fibers and regulates their diameter (Macbeath J, Shackleton D, and Hulmes D. Tyrosine-rich Acidic Matrix Protein (TRAMP) accelerated collagen fibril formation in vitro J. Biol Chem 1993 268: 19826-32).
  • TRAMP tyrosine-rich Acidic Matrix Protein
  • Human skin biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • the biopsies are cultured for 48 hours (dermatopontin) or 72 hours (collagen I and elastin) and receive 2 applications per day of a dill extract according to examples 5, 6 and 7 diluted 1/100 in PBS, either at the final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • the biopsies are then fixed in formaldehyde and then included in the paraffin.
  • the labels of collagen I, dermatopontin and elastin are made after unmasking specific sites.
  • the immunolabelings are carried out using a polyclonal rabbit antibody specific for collagen I (Rockland, Ref 600-401-103-0.5), a mouse monoclonal antibody specific for dermatopontin (Santa Cruz, Ref. Sc-376863), a polyclonal rabbit antibody specific for elastin (Abcam, Ref Ab21610), followed by a fluorochrome-coupled anti-rabbit or anti-mouse secondary antibody (Invitrogen, Ref A21206 and A21202). ).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M).
  • a quantification of the intensity of the fluorescence obtained after labeling of collagen I is carried out using the software Volocity® (Improvision).
  • Quantification of the dermatopontin content in the dermis is performed using Volocity® software (Improvision).
  • a quantification of the length of the fibers obtained after marking elastin is carried out using the ImageJ software.
  • Himalayan dill extract enriched in small RNA (Example 5) further stimulates the expression of collagen I, dermatopontin and elastin in human ex vivo skin compared to Himalayan dill extracts. not enriched in small RNA (Examples 6 and 7). These proteins are involved in the firmness and elasticity of the skin, so their synthesis allows a firming effect.
  • the dill extract obtained according to the invention thus makes it possible to effectively combat the signs of skin aging by improving the firmness and elasticity of the skin.
  • Example 14 Evaluation of the effects of dill extracts of different origins (non-Himalayan China, Egypt, China
  • the purpose of this study is to compare the effects on the extracellular matrix of the dermis of three dill extracts obtained according to Examples 3, 4 and 5 having different geographical origins.
  • the first small molecular weight RNA enriched extract obtained from dill from non - Himalayan China obtained from non - Himalayan China
  • the second small - molecular - weight RNA enriched extract obtained from dill from Egypt obtained from dill from Himalayan China.
  • the aim of this study is to evaluate the effects of these three dill extracts on the expression of the collagen I, dermatopontin and elastin proteins involved in the structure of the extracellular matrix.
  • Human skin biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • the biopsies are cultured for 48h (dermatopontine) or 72h (collagen I and elastin) and receive 2 applications per day of a dill extract of different geographical origins, diluted to 1/100 in PBS, that is to the final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • the biopsies are then fixed in formaldehyde and then included in the paraffin.
  • the labels of collagen I, dermatopontin and elastin are carried out after unmasking specific sites.
  • the immunolabelings are carried out using a polyclonal rabbit antibody specific for collagen I (Rockland, Ref 600-401-103-0.5), a mouse monoclonal antibody specific for dermatopontin (Santa Cruz, Ref. Sc-376863), a polyclonal rabbit antibody specific for elastin (Abcam, Ref Ab21610), followed by a fluorochrome-coupled anti-rabbit or anti-mouse secondary antibody (Invitrogen, Ref. A21206 and A21202).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M).
  • a quantification of the intensity of the fluorescence obtained after labeling of collagen I is carried out using the software Volocity® (Improvision).
  • Quantification of the dermatopontin content in the dermis is performed using Volocity® software (Improvision).
  • a quantification of the length of the fibers obtained after marking elastin is carried out using the ImageJ software.
  • Himalayan dill extract enriched in small RNAs (Example 5) further stimulates the expression of collagen I and elastin in ex vivo human skin compared with extracts of dill enriched with small RNA (Examples 3). and 4) from non-Himalayan China and Egypt. These proteins are involved in the firmness and elasticity of the skin, so their synthesis allows a firming effect.
  • the dill extract, and in particular dill from Himalaya, obtained according to the invention thus makes it possible to effectively combat the signs of skin aging by improving the firmness and elasticity of the skin.
  • the purpose of this study is to compare the effects on the synthesis of hyaluronic acid of three extracts of Himalayan dill.
  • the first extract enriched in RNA of small molecular weight, obtained according to Example 5 the second extract containing no RNA of small molecular weight, obtained according to Example 6 and the last extract obtained after maceration according to Example 7 .
  • hyaluronic acid is a major component of the extracellular matrix of the dermis, also present in the epidermis, and is involved in cutaneous hydration.
  • Biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • Biopsies are grown for 72 hours and receive 2 daily applications of a dill extract according to Examples 5, 6 and 7 diluted 1/100 in PBS, ie to the final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • the biopsies are then fixed in formaldehyde and then included in the paraffin. Skin sections of 4 ⁇ m thick are then made.
  • the labeling of hyaluronic acid is carried out using a biotinylated hyaluronic acid-specific binding protein (Coger-Seikagaki, Ref 400-763-1A), and fluorochrome-coupled streptavidin (Invitrogen). , S32354).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M).
  • a quantification of the fluorescence intensity obtained after labeling the hyaluronic acid is carried out using the software Volocity® (Improvision).
  • Himalayan dill extract enriched in small RNA (Example 5) further stimulates the synthesis of hyaluronic acid in the epidermis and the dermis of ex vivo human skin in comparison with non-enriched Himalayan dill extracts. in small RNAs (Examples 6 and 7). Hyaluronic acid is involved in the hydration of the skin.
  • Example 16 Evaluation of the effects of dill extracts of different origins (non-Himalayan China, Egypt, Himalayan China) respectively according to Examples 3, 4 and 5 on hydration by the study of hyaluronic acid
  • the purpose of this study is to compare the effects on the synthesis of hyaluronic acid of three extracts of dill obtained according to Examples 3, 4 and 5 having different geographical origins.
  • the first small molecular weight RNA enriched extract obtained from dill from non - Himalayan China obtained from dill from non - Himalayan China
  • the second small - molecular - weight RNA enriched extract obtained from dill from Egypt obtained from dill from Himalayas.
  • hyaluronic acid is a major component of the matrix extracellular dermis, also present in the epidermis, and is involved in cutaneous hydration.
  • Human skin biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • the biopsies are cultured for 72 hours and receive 2 applications per day of a dill extract of different geographical origins, diluted 1/100 in PBS, or at the final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • the biopsies are then fixed in formaldehyde and then included in the paraffin. Skin sections of 4 ⁇ m thick are then made.
  • the labeling of hyaluronic acid is carried out using a biotinylated hyaluronic acid-specific binding protein (Coger-Seikagaki, Ref 400-763-1A), and fluorochrome-coupled streptavidin (Invitrogen). , S32354).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M).
  • a quantification of the intensity of the fluorescence obtained after labeling of collagen I is carried out using the software Volocity® (Improvision).
  • Himalayan dill extract enriched in small RNA (Example 5) further stimulates the synthesis of hyaluronic acid in the epidermis and the dermis of ex vivo human skin in comparison with extracts of dill enriched with small RNA ( examples 3 and 4) from non-Himalayan China and Egypt.
  • Hyaluronic acid is involved in the hydration of the skin.
  • the purpose of this study is to compare the effects on skin aging of three extracts of Himalayan dill.
  • the first extract enriched in RNA of small molecular weight, obtained according to Example 5 the second extract containing no RNA of small molecular weight, obtained according to Example 6 and the last extract obtained after maceration according to Example 7 .
  • pl6 is a cell cycle regulator that increases with age (Ressler S, Bartkova J, Niederegger H, Bartek J, Scharffetter- Kochanek K, Jansen-Diirr P, Wlaschek M.
  • pl6INK4A is a robust in vivo biomarker of cell aging in human skin.Agging Cell 2006 5 (5): 379 -89).
  • Keratin 14 is a component of the keratinocyte cytoskeleton of the basal lamina of the epidermis, which disappears with the differentiation of these cells.
  • Fibrillin 1 is a component of elastic fibers that is particularly sensitive to photoinduced aging (Watson RE, Griffiths CE, Craven NM, Shuttleworth CA, Kielty CM, Fibrillin-rich microfibrils are reduced in photoaged skin, and distribution at the dermal-epidermal junction. Dermatol 1999, 112 (5): 782-7).
  • Human skin biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • the biopsies are cultured for 48h (p16 and K14) or 72h (fibrillin 1) and receive 2 applications per day of a dill extract according to examples 5, 6 and 7 diluted 1/100 in PBS, that is to say final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • biopsies are then frozen (fibrillin 1) or fixed in formaldehyde and then included in the paraffin (p16 and K14). Skin cuts of 4 ⁇ m are then made. The pl6, keratin 14 and fibrillin 1 markings are carried out after eventual unmasking of the specific sites.
  • the immunolabelings are carried out using a p16-specific mouse monoclonal antibody (Abcam, Ref Ab54210), a rabbit monoclonal antibody specific for keratin 14 (Abcam, Ref Ab51054), an antibody mouse monoclonal specific for fibrillin 1 (Abcam, Ref Ab3090), followed by a fluorochrome-coupled anti-mouse or anti-rabbit secondary antibody (Invitrogen, Ref A21202 and A21206).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M).
  • a quantization of the fluorescence intensity obtained after pl6 and K14 labeling is carried out using the software Volocity® (Improvision). Quantification of the length of the fibers obtained after labeling fibrillin 1 is performed using ImageJ software.
  • Treatments with dill extract enriched in small RNA obtained according to Example 5 from dill from Himalayas at 1% for 48 h, allow to observe a significant decrease in the expression of p16 and an increase Significant expression of keratin 14 compared with control condition treated with IX PBS and compared with treatments with dill extracts obtained according to Examples 6 (absence of low molecular weight RNA) and 7 (maceration) at from plants from the Himalayas.
  • Treatments with dill extract enriched in small RNA obtained according to Example 5 from dill from Himalayas at 1% for 72 hours, allow to observe a significant increase in the length of the fibers compared to the condition.
  • Control 100 100 100 Himalayan dill extract
  • Himalayan dill extract enriched in small RNA limits p16 expression and further stimulates K14 expression in human ex vivo skin compared to non-enriched Himalayan dill extracts.
  • small RNAs (Examples 6 and 7).
  • Himalayan dill extract enriched in small RNA (Example 5) also stimulates the expression of fibrillin 1 in comparison with the maceration, not enriched in small RNA, of Himalayan dill (Example 7) but not in comparison with the extract not containing small RNA (Example 6).
  • These proteins are involved in the aging of the skin.
  • the dill extract obtained according to the invention thus makes it possible to fight effectively against the signs of skin aging.
  • Example 18 Evaluation of the effects of dill extracts of different origins (non-Himalayan China, Egypt, Himalayan China) respectively according to Examples 3, 4 and 5 on the aging of the skin by the study of P16, the keratin 14 and fibrillin 1
  • the purpose of this study is to compare the effects on skin aging of three extracts of dill obtained according to Examples 3, 4 and 5 with different geographical origins.
  • the first small molecular weight RNA enriched extract obtained from dill from non - Himalayan China obtained from dill from non - Himalayan China
  • the second small - molecular - weight RNA enriched extract obtained from dill from Egypt obtained from dill from Himalayas.
  • the aim of this study is to evaluate the effects of these three dill extracts on the expression of the proteins pl6, keratin 14 (K14) and fibrillin 1, involved in cutaneous aging.
  • Human skin biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • the biopsies are cultured for 48h (pl6 and K14) or 72h (fibrillin 1) and receive 2 applications per day of an extract of dill of different geographical origins, diluted to 1/100 in PBS, or to the final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • the biopsies are then frozen (fibrillin 1) or fixed in formaldehyde and then included in the paraffin (p16 and K14). Skin cuts are then made.
  • the pl6, keratin 14 and fibrillin 1 markings are carried out after eventual unmasking of the specific sites.
  • the immunolabelings are carried out using a p16-specific mouse monoclonal antibody (Abcam, Ref Ab54210), a rabbit monoclonal antibody specific for keratin 14 (Abcam, Ref Ab51054), an antibody mouse monoclonal specific for fibrillin 1 (Abcam, Ref Ab3090), followed by a fluorochrome-coupled anti-mouse or anti-rabbit secondary antibody (Invitrogen, Ref A21202 and A21206).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M).
  • a quantification of the intensity of the fluorescence obtained after labeling of collagen I is carried out using the software Volocity® (Improvision).
  • a quantization of the fluorescence intensity obtained after pl6 and K14 labeling is carried out using the software Volocity® (Improvision).
  • Quantification of the length of the fibers obtained after labeling fibrillin 1 is performed using ImageJ software.
  • results are compiled in Table 6 below.
  • Treatments with dill extract enriched in small RNA, obtained according to example 5 from dill from Himalayas at 1% for 48h (p16 and K14) or 72h (fibrillin 1) make it possible to observe a significant decrease in p16 expression, a significant increase in keratin 14 expression and an increase in fiber length compared to control condition treated with IX PBS and compared to treatments with dill extracts obtained according to examples 3 and 4 from plants from non-Himalayan China and Egypt.
  • the results obtained on the quantification of pl6 labeling on ex vivo skin treated for 48 h with different extracts of 1% dill (Table 6) are more particularly illustrated in FIG.
  • Himalayan dill extract enriched in small RNAs limits the expression of p16 and further stimulates the expression of K14 and fibrillin 1 in ex vivo human skin as compared to extracts of dill enriched with small RNAs (examples 3 and 4) from non-Himalayan China and Egypt. These proteins are involved in the aging of the skin.
  • the dill extract, and in particular dill from Himalaya, obtained according to the invention thus makes it possible to fight effectively against the signs of cutaneous aging.
  • Example 19 Evaluation of the effects of dill extracts according to Examples 5, 6 and 7 on the barrier function of the skin by the study of E-cadherin
  • the purpose of this study is to compare the effects on skin barrier function of three extracts of Himalayan dill.
  • the first extract enriched in RNA of small molecular weight, obtained according to Example 5 the second extract containing no RNA of small molecular weight, obtained according to Example 6 and the last extract obtained after maceration according to Example 7 .
  • E-cadherin a tight junction protein involved in cell adhesion
  • Constreras RG Shoshani L, Flores-Maldonado C , Lazaro A, Monroy AO, Roldan ML, Fiorentino R, Cereijido M.
  • E-cadherin and tight junstions between epithelial cells of different animal species Eur J Physiol., 2002 444: 467-475).
  • Human skin biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • the biopsies are cultured for 48 hours and receive 2 applications per day of a dill extract according to Examples 5, 6 and 7 diluted 1/100 in PBS, ie to the final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • the biopsies are then fixed in formaldehyde and then included in the paraffin. Skin cuts of 4 ⁇ m are made.
  • the immunostaining is carried out using a polyclonal rabbit antibody specific for E-cadherin (Abcam, Ref Abl5148), followed by a fluorochrome-coupled anti-rabbit secondary antibody (Invitrogen, Ref A21206).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M). Quantification of the intensity of the fluorescence obtained is carried out using the software Volocity® (Improvision).
  • Himalayan dill extract enriched in small RNAs stimulates the expression of E-cadherin in human ex vivo skin compared to extracts of Himalayan dill not enriched in small RNA (Examples 6). and 7).
  • the dill extract obtained according to the invention makes it possible to reinforce the cutaneous barrier.
  • Example 20 Evaluation of the effects of dill extracts of different origins (non-Himalayan China, Egypt, Himalayan China) respectively according to Examples 3, 4 and 5 on the barrier function of the skin by the study of E -cadhérine
  • the purpose of this study is to compare the effects on the barrier function of the skin of three extracts of dill obtained according to Examples 3, 4 and 5 having different geographical origins.
  • the first small molecular weight RNA enriched extract obtained from dill from non - Himalayan China obtained from dill from non - Himalayan China
  • the second small - molecular - weight RNA enriched extract obtained from dill from Egypt obtained from dill from Himalayas.
  • the aim of this study is to evaluate the effects of these three dill extracts on the expression of E - cadherin, a tight junction protein, involved in cell adhesion.
  • Human skin biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • the biopsies are cultured for 48 hours and receive 2 applications per day of a dill extract of different geographical origins, diluted 1/100 in PBS, or at the final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • the biopsies are then fixed in formaldehyde and then included in the paraffin. Skin cuts of 4 ⁇ m are made.
  • the immunostaining is carried out using a polyclonal rabbit antibody specific for E-cadherin (Abcam, Ref Abl5148), followed by a fluorochrome-coupled anti-rabbit secondary antibody (Invitrogen, Ref A21206).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M). Quantification of the intensity of the fluorescence obtained is achieved using the software Volocity® (Improvision).
  • Himalayan dill extract enriched in small RNA stimulates the expression of E-cadherin in human ex vivo skin in comparison with extracts of dill enriched with small RNA (Examples 3 and 4) from from non-Himalayan China and Egypt.
  • the dill extract obtained according to the invention makes it possible to reinforce the cutaneous barrier.
  • Example 21 Evaluation of the effects of dill extracts according to Examples 5, 6 and 7 on the skin barrier function by studying the penetration of Lucifer Yellow in stressed reconstructed epidermis (RHE)
  • the aim of this study is to compare the effects of three Himalayan dill extracts on the maintenance of the barrier function of reconstructed skin constricted by SDS and coarse particles of pollution (PM10).
  • the first extract enriched in RNA of small molecular weight, obtained according to Example 5 the second extract containing no RNA of small molecular weight, obtained according to Example 6 and the last extract obtained after maceration according to Example 7 .
  • Reconstructed epidermis of human skin (RHE) 8 mm in diameter is maintained in culture in the presence of a specific medium on inserts.
  • Biopsies are grown for 72 hours. They receive 2 applications per day for 48 hours of an extract of dill according to Examples 5, 6 and 7 diluted 1/100 in PBS, ie to the final concentration of 1% volume / volume, then 1 application of SDS to 0.15% for 3 hours, then 1 application of PM10 at 100 ⁇ g / ml for 24 hours.
  • Two control conditions are carried out using PBS IX, followed, or not, by the application of SDS and PM10.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 150 ⁇ deposited on the surface of the RHE.
  • Lucifer Yellow is applied on the RHE at 0.5 mg / ml for 1h.
  • the RHEs are then fixed in formaldehyde and then embedded in paraffin. Sections 4 ⁇ m thick are then made.
  • the RHEs are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M). A quantification of the penetration of the fluorescence obtained after application of the Lucifer Yellow is carried out using the software Volocity® (Improvision). Results:
  • the Himalayan dill extract enriched in small RNA makes it possible to limit the penetration of Lucifer Yellow, and thus to reinforce the barrier function, in RHEs stressed with SDS and PM10. Extracts of Himalayan dill not enriched in small RNA (Examples 6 and 7) do not allow this reinforcement.
  • Example 22 Evaluation of the effects of dill extracts of different origins (non-Himalayan China, Egypt, Himalayan China) respectively according to Examples 3, 4 and 5 on the skin barrier function by studying the penetration of Lucifer Yellow into stressed reconstructed epidermis (RHE)
  • the purpose of this study is to compare, on the maintenance of the barrier function of a reconstructed skin constricted by SDS and coarse particles of pollution (PM10), the effects of three extracts of dill obtained according to the examples 3, 4 and 5 having different geographical origins.
  • the first small molecular weight RNA enriched extract obtained from dill from non - Himalayan China obtained from dill from non - Himalayan China
  • the second small - molecular - weight RNA enriched extract obtained from dill from Egypt and the third enriched RNA of small molecular weight, obtained from dill from Himalayas.
  • Lucifer Yellow The study of fluorescent dye penetration, Lucifer Yellow, is a way of judging the state of the skin barrier.
  • Reconstructed epidermis of human skin (RHE) 8 mm in diameter is maintained in culture in the presence of a specific medium on inserts.
  • Biopsies are grown for 72 hours. They receive 2 applications per day for 48 hours of a dill extract of different geographical origins diluted 1/100 in PBS, ie to the final concentration of 1% volume / volume, then 1 application of SDS at 0.15%. for 3 hours, then 1 application of PM10 at 100 ⁇ g / ml for 24 hours.
  • Two control conditions are carried out using PBS IX, followed, or not, by the application of SDS and PM10.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 150 ⁇ deposited on the surface of the RHE.
  • Lucifer Yellow is applied on the RHE at 0.5 mg / ml for 1h.
  • the RHEs are then fixed in formaldehyde and then embedded in paraffin. Sections 4 ⁇ m thick are then made.
  • the RHEs are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M). Quantification of fluorescence penetration obtained after application of Lucifer Yellow is performed, using the software Volocity® (Improvision).
  • the Himalayan dill extract enriched in small RNA makes it possible to limit the penetration of Lucifer Yellow, and thus to reinforce the barrier function, in RHEs stressed with SDS and PM10. Extracts of dill enriched with small RNA (examples 3 and 4) from non-Himalayan China and Egypt do not allow this reinforcement.
  • the dill extract, and in particular dill from Himalaya, obtained according to the invention thus makes it possible to reinforce the barrier function of the skin.
  • Example 23 Evaluation of the effects of dill extracts according to Examples 5, 6 and 7 on the scalp
  • the purpose of this study is to compare the effects of three extracts of Himalayan dill on the scalp.
  • the first extract enriched in RNA of small molecular weight, obtained according to Example 5 the second extract containing no RNA of small molecular weight, obtained according to Example 6 and the last extract obtained after maceration according to Example 7 .
  • Human scalp biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • the biopsies are cultured for 48 hours and receive 2 applications per day of a dill extract according to Examples 5, 6 and 7 diluted 1/100 in PBS, ie to the final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • the biopsies are then fixed in formaldehyde and then included in the paraffin. Skin cuts of 4 ⁇ m are then made.
  • the labeling of keratin 14 is performed after unmasking specific sites.
  • the immunolabeling is carried out using a rabbit monoclonal antibody specific for keratin 14 (Abcam, Ref Ab51054) and then a secondary anti-rabbit antibody coupled to a fluorochrome (Invitrogen, Ref. A21206).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M). Quantitation of the fluorescence intensity obtained after K14 labeling is performed using the software Volocity® (Improvision).
  • Himalayan dill extract enriched in small RNA (Example 5) further stimulates the expression of K14 in ex vivo human skin as compared to extracts of Himalayan dill not enriched in small RNA (Examples 6 and 7). ). Keratin 14 is involved in the good health of the hair.
  • the dill extract obtained according to the invention thus makes it possible to strengthen the structure of the hair, to improve their appearance and to promote their smoothing and resistance.
  • Example 24 Evaluation of the effects of dill extracts of different origins (non-Himalayan China, Egypt, China Himalaya) respectively according to Examples 3, 4 and 5 on the scalp
  • the purpose of this study is to compare the effects on the scalp of three extracts of dill obtained according to Examples 3, 4 and 5 having different geographical origins.
  • the first small molecular weight RNA enriched extract obtained from dill from non - Himalayan China obtained from dill from non - Himalayan China
  • the second small - molecular - weight RNA enriched extract obtained from dill from Egypt obtained from dill from Himalayas.
  • Human scalp biopsies 6 mm in diameter are maintained in culture ex vivo in the presence of a specific medium (DMEM 1 g / L, HAMS F12, SVF and antibiotics) on inserts.
  • the biopsies are cultured for 48 hours and receive 2 applications per day of a dill extract of different geographical origins, diluted 1/100 in PBS, or at the final concentration of 1% volume / volume.
  • the control condition is carried out using PBS IX.
  • the applications are carried out in the form of a drop of 10 ⁇ deposited on the surface of the biopsy.
  • the biopsies are then fixed in formaldehyde and then included in the paraffin. Skin cuts of 4 ⁇ m are then made.
  • the labeling of keratin 14 is performed after unmasking specific sites.
  • the immunolabeling is carried out using a rabbit monoclonal antibody specific for keratin 14 (Abcam, Ref Ab51054) and then a secondary anti-rabbit antibody coupled to a fluorochrome (Invitrogen, Ref A21206).
  • the biopsies are then examined under an Epi-fluorescence microscope (Zeiss Axiovert 200M). Quantification of the intensity of the fluorescence obtained after K14 labeling is performed using the software Volocity® (Improvision).
  • dill extract and in particular derived from Himalayan dill, obtained according to the invention thus makes it possible to strengthen the structure of the hair, to improve their appearance and to promote their smoothing and resistance.

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Abstract

L'invention concerne une composition cosmétique comprenant, en tant qu'agent actif, dans un milieu physiologiquement acceptable, une quantité efficace d'un extrait aqueux des parties aériennes d'aneth (Anethum graveolens) enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides obtenu à partir d'une matière végétale suivant les étapes suivantes selon lesquelles : a) on met en présence des parties aériennes d'Anethum graveolens avec de l'eau; b) on ajoute de l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) tétrasodique dans le mélange obtenu en a) à un pH compris entre 10,5 et 11; c) on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8; d) on purifie le mélange obtenu en c) de manière à éliminer la matière végétale solide résiduelle et obtenir un extrait brut aqueux purifié; et e) on contrôle le pH et on le réajuste si nécessaire à une valeur comprise entre 6 et 8, préférentiellement entre 6 et 6,5. L'invention concerne également l'utilisation cosmétique d'une composition selon l'invention pour le soin de la peau, du cuir chevelu et des phanères.

Description

COMPOSITION COMPRENANT UN EXTRAIT AQUEUX D' ANETHUM GRAVEOLENS ENRICHI EN PETITS ARN ET SES UTILISATIONS COSMETIQUES
L'invention concerne un procédé d'obtention d'un extrait d' Anethum graveolens aqueux enrichi en petits ARN (acides ribonucléiques ) d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides (nt) ainsi que les extraits obtenus par le procédé et les compositions cosmétiques comprenant de tels extraits et leurs utilisations cosmétiques .
La famille des Apiacées (Apiaceae) , appelées aussi Ombellifères , est constituée de plantes dicotylédones et comprend près de 3 000 espèces réparties en 420 genres surtout présentes dans les régions tempérées du monde. Cette famille inclut aussi des herbes comme le persil, la coriandre, le fenouil. Anethum graveolens, fait partie de la famille des Apiaceae. Son nom d'espèce admet plusieurs synonymes tels que Anethum sowa, Peucedanum graveolens et Peucedanum sowa (Janeen et al ; The Herb Society of America 's Essential Guide to Dill. Kirtland, Ohio: The Herb Society of America, 2009) . L'aneth odorant (Anethum graveolens) est largement répandue dans le monde et est une espèce très riche en différentes familles de molécules telles que des huiles essentielles, des acides gras, des protéines, des carbohydrates , de la furanocoumarine, des polyphénols, des minéraux et encore beaucoup d'autres molécules biologiquement actives. Elle est notamment très utilisée en médecine traditionnelle. Le nom de l'aneth dérive d'un mot grec «aneeson» ou « aneeton » et signifie « forte odeur ». Cette plante a une histoire longue et ancienne dans de nombreux pays comme une herbe culinaire et médicinale. Son utilisation est commune en médecine ayurvédique (médecines traditionnelles de l'Inde), principalement pour lutter contre 1' inconfort abdominal et l'indigestion) (Jana et Shekhawat Shekhawat GS . Phytochemical Analysis and Antibacterial Screening of in vivo and in vitro Extracts of Indian Médicinal Herb: Anethum graveolens. Res. J. Med. Plant. 2010a; 4 ( 4 ) : 206-212. 2010; Janeen et al., The Herb Society of America' s Essential Guide to Dill. Kirtland, Ohio: The Herb Society of America, 2009) . En France et dans plusieurs autres pays de l'Europe de l'ouest cette plante fait partie de nombreuses préparations médicinales traditionnelles pour ses propriétés digestives et fortifiantes qui subsistent encore aujourd'hui. La littérature scientifique décrit notamment des effets antimicrobien, anti¬ inflammatoire, analgésique, une protection des muqueuses respiratoires et des effets comme relaxant musculaire.
De nombreux extraits de graines d' aneth sont décrits dans la littérature en partie pour l'utilisation de ses huiles essentielles, en revanche peu d'études ont été réalisées sur des extraits issus des parties aériennes de l' aneth. De plus la plupart des extractions décrites d' aneth sont effectuées avec des solvants organiques de type apolaire et peu sont issus d'extraction avec un solvant polaire comme l'eau. De plus très peu de ces extraits sont revendiqués pour une utilisation cosmétique .
Malgré les différents produits cosmétiques anti-âge sur le marché pour le traitement de la peau, il reste un besoin de compositions cosmétiques efficaces appliquées topiquement qui présentent des effets anti-âges pour la peau et les cheveux en utilisant des ingrédients naturels comme agent actif.
Les produits dits « non naturels » et synthétisés chimiquement peuvent être perçus comme dangereux pour l'environnement ainsi que pour les personnes. En revanche, les produits naturels sont perçus comme supérieurs aux produits synthétisés chimiquement. De nombreux produits naturels extraits de plantes ou d'herbes sont connus pour contenir des agents antioxydants / radicaux libres qui peuvent neutraliser les effets des dégâts des radicaux libres tels que les polyphénols. L' aneth est une plante très riche en composés phénoliques et d'autres familles de molécules reconnues pour leurs effets bénéfiques sur la peau. En particulier, le procédé d'extraction décrit dans l'invention permet d'enrichir l'extrait final avec des ARN de petit poids moléculaire .
Les protocoles d'extraction des acides ribonucléiques (ARN de petit poids moléculaire) classiquement décrits sont adaptés aux pratiques de laboratoire, et donc réalisés à petite échelle. Ils utilisent des solvants qui ne sont pas considérés comme des solvants cosmétiques (Zumbo, P. 2014 "Phenol-chloroform Extraction", 2014) . De plus, ces protocoles d'extraction et purification ne permettent d'obtenir que la fraction d'acides nucléiques purifiée. Cette fraction d'acides nucléiques ARN ou ADN ou petits ARN est dépourvue de toute autre molécule d' intérêt telle que les métabolites secondaires, vitamines, sucres, peptides, etc. qui peuvent avoir des effets bénéfiques pour la peau et présentent donc un intérêt cosmétique.
L'invention a pour premier objet un procédé d'obtention d'un extrait aqueux d' Anethum graveolens enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides à partir d'une matière végétale comprenant les étapes suivantes :
a) Solubilisation des parties aériennes d' aneth avec de l'eau ;
b) auquel on ajoute de l'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) tétrasodique dans le mélange obtenu en a) , le pH du mélange étant compris entre 10,5 et 11 ;
c) on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8 ;
d) on purifie le mélange obtenu en séparant la matière soluble de celle qui est insoluble c) de manière à récupérer un extrait brut aqueux ; et
e) on réalise au moins une filtration de l'extrait brut aqueux pour obtenir l'extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides dont le pH est contrôlé et si nécessaire réajusté à une valeur comprise entre 6 et 8, préférentiellement entre 6 et 6,5. De plus, l'invention a pour deuxième objet un extrait aqueux des parties aériennes d' Anethum graveolens enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides et dépourvu d'ADN, obtenu par le procédé selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend en poids du poids total de l'extrait, de 5 à 30 g/kg d'extrait sec, 0,5 à 10 g/kg de fragments protéiques, 0,5 à 10 g/kg de sucres, 0,1 à 3 g/kg d'acides aminés, 50 à 2000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
L'invention a pour troisième objet une composition comprenant, en tant qu'agent actif anti-âge, un extrait selon l'invention, et un milieu physiologiquement acceptable.
L'invention a plus particulièrement pour objet une composition cosmétique comprenant, en tant qu'agent actif, dans un milieu physiologiquement acceptable, une quantité efficace d'un extrait aqueux des parties aériennes d' aneth (Anethum graveolens) enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum
150 nucléotides obtenu à partir d'une matière végétale suivant les étapes suivantes selon lesquelles :
a) on met en présence des parties aériennes d' Anethum graveolens avec de l'eau ;
b) on ajoute de l'acide éthylène diamine tétraacétique
(EDTA) tétrasodique dans le mélange obtenu en a) à un pH compris entre 10,5 et 11 ;
c) on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8 ;
d) on purifie le mélange obtenu en c) de manière à éliminer la matière végétale solide résiduelle et obtenir un extrait brut aqueux purifié ; et
e) on contrôle le pH et on le réajuste si nécessaire à une valeur comprise entre 6 et 8, préférentiellement entre 6 et 6,5.
L'invention a également pour objet l'utilisation cosmétique d'une composition selon l'invention pour le soin de la peau, du cuir chevelu et des phanères. L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, au regard des dessins annexés dans lesquels :
- la Figure 1 est un graphique résultant d'une analyse au
Bioanalyseur® représentant la quantification des ARN d'un extrait d' aneth provenant de Chine d'Himalaya obtenu selon l'exemple 5 ;
la Figure 2 représente un graphique résultant d'une analyse au Bioanalyseur® représentant la quantification des ARN d'un extrait d' aneth provenant de Chine d'Himalaya obtenu après étape de précipitation des petits ARN selon l'exemple 6 ;
la Figure 3 représente un graphique résultant d'une analyse au Bioanalyseur® représentant la quantification des ARN d'un extrait d' aneth provenant de Chine d'Himalaya obtenu par extraction conventionnelle selon l'exemple 7 ;
- la Figure 4 représente la quantification de la longueur des fibres après marquage immunofluorescent de l'élastine sur peau ex vivo traitée pendant 72h avec différents extraits d' aneth à 1% ;
- la Figure 5 représente la quantification du marquage de l'acide hyaluronique (HA) sur peau ex vivo traitée pendant 72h avec différents extraits d' aneth à 1% ; et
- la Figure 6 représente la quantification du marquage de pl6 sur peau ex vivo traitée pendant 48h avec différents extraits d' aneth à 1% .
- la Figure 7 représente la quantification du marquage d'E- cadhérine sur peau ex vivo traitée pendant 48h avec différents extraits d' aneth à 1%.
L' invention concerne un procédé mis en œuvre pour l'obtention d'un extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides à partir des parties aériennes séchées ou fraîches d' aneth. L' invention concerne plus particulièrement une composition cosmétique comprenant, en tant qu'agent actif, dans un milieu physiologiquement acceptable, une quantité efficace d'un extrait aqueux des parties aériennes d' aneth (Anethum graveolens) enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides obtenu à partir d'une matière végétale suivant les étapes du procédé selon l'invention.
Par aneth (Anethum graveolens) , on entend par exemple les espèces provenant d'Himalaya, d'Egypte et de Chine non himalayenne ; préférentiellement l'extrait est obtenu à partir d' aneth d'Himalaya.
Par « parties aériennes » on entend les feuilles, tiges et fleurs de l' aneth.
Les graines ne sont pas comprises dans les « parties aériennes » au sens de l'invention.
Dans le cours de la description les termes « aneth » et « Anethum graveolens » seront utilisées indifféremment, avec la même signification.
Par « petits ARN » ou « ARN de petit poids moléculaire », on entend des ARN (acides ribonucléiques ) non codants de petit poids moléculaire, d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides, tels que tous types de petits ARN non messager, simple et/ou double brins, par exemple les micro-ARN, les ARN interférents , les introns, les petits ARN nucléaires ou encore tous fragments d'ARN.
Dans une première étape a) du procédé selon l'invention, on met en présence la matière végétale soit les parties aériennes broyées séchées d' aneth avec de l'eau, préférentiellement dans un rapport matière végétale / eau de 4 à 20% en poids/poids, plus préférentiellement dans un rapport de 5 à 10%, par exemple dans un rapport de 5,7 ou 10 en poids/poids.
L'eau utilisée est une eau distillée, déminéralisée ou encore une eau riche en sels minéraux et/ou oligo-éléments, préférentiellement une eau distillée. De préférence les parties aériennes de l'aneth sont sous forme sèche.
Préférentiellement , la matière végétale est broyée avant d'être mise en présence d'eau dans l'étape a) . Le broyage est une action mécanique qui permet une meilleure extraction. Le broyage mécanique, suivi d'une lyse alcaline en présence d'EDTA favorise la complète déstructuration de la membrane cellulaire et notamment de la membrane nucléaire.
On ajoute ensuite dans une étape b) de l'EDTA tétrasodique dans le mélange obtenu en a) . Le pH à cette étape est basique et doit être ajusté, si nécessaire, à une valeur comprise entre 10,5 et 11 par l'ajout de soude (NaOH) . Lors de l'étape b) il est essentiel de maintenir le pH basique entre 10,5 et 11. En effet, ce niveau de pH, associé à l'action de l'EDTA, provoque la déstructuration de la membrane cellulaire, y compris la membrane nucléaire, la lyse des cellules et la dénaturation de l'ADN (les 2 brins de la double hélice sont séparés) . Le contrôle du pH lors de l'étape b) montre que celui-ci reste basique et se stabilise entre 9 et 11.
La concentration en EDTA tétrasodique est préférentiellement comprise entre 2 et 15 mM, et plus préférentiellement de 10 mM.
Cette concentration est choisie pour optimiser le rendement d'extraction des ARN de petit poids moléculaire dans l'extrait final. L'EDTA tétrasodique va fragiliser, déstructurer les membranes pecto-cellulosiques des cellules végétales en séquestrant par complexation les ions divalents tels que les ions calcium qui forment des ponts ioniques entre les molécules de pectines entourant les microfibrilles de cellulose. Ceci a pour conséquence de favoriser la libération du contenu cellulaire au cours de l'extraction. L'étape de traitement par EDTA est essentielle pour enrichir l'extrait en ARN de petit poids moléculaire. L'étape de traitement par l'EDTA dure préférentiellement au moins lh, à une température comprise entre 20 et 80 °C. Pendant cette étape, le mélange obtenu en a) est avantageusement mis sous agitation.
Dans une étape c) , on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8.
Par exemple, on ajuste le pH par ajout d'une solution d'acide chlorhydrique (HC1) ou encore n'importe quel acide pouvant réguler le pH qui soit compatible avec une utilisation cosmétique tel que l'acide citrique ou lactique.
Cette étape d'acidification provoque la renaturation brutale de l'ADN (réappariement des brins du duplex) . Néanmoins l'ADN chromosomique, très long, ne parvient pas à se réapparier complètement et forme des enchevêtrements insolubles. Au contraire, les petits ARN, beaucoup plus courts, restent en solution. L'ADN et les petits ARN sont ainsi séparés en deux phases distinctes ; une phase solide contenant entre autres l'ADN chromosomique, et une phase liquide contenant, entre autres, les petits ARN.
Dans une étape d) on purifie le mélange obtenu en c) de manière à éliminer la matière végétale et récupérer un extrait brut aqueux. Toute méthode connue par l'homme du métier pourra être utilisé. Préférentiellement le mélange obtenu en c) est centrifugé à faible vitesse, par exemple pendant au moins 10 min à 4000 g, de manière à sédimenter la matière végétale résiduelle dans le culot et récupérer un extrait brut aqueux dans le surnageant .
Dans une étape d) on contrôle le pH et on le réajuste à une valeur comprise entre 6 et 8. Préférentiellement le pH est réajusté à une valeur comprise entre 6 et 6,5, encore plus préférentiellement à 6,5. Le pH est réajusté par l'ajout d'une solution d'acide chlorhydrique (HC1) ou de soude (NaOH) .
En effet, un pH inférieur à 6 peut entraîner la précipitation des acides nucléiques en général, donc celle des ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides .
L'étape d'ajustement du pH à l'étape d) du procédé selon l'invention est une étape indispensable à l'extraction optimale des ARN de petit poids moléculaire.
Avantageusement le réajustement du pH de l'étape d) est précédé par au moins une filtration de l'extrait brut aqueux obtenu en d) . Préférentiellement des filtrations successives seront réalisées en abaissant le seuil de filtration de 50 à 20 μιη jusqu'à 0,4, 0,3, 0,2, ou 0,1 μιη.
L'invention a pour deuxième objet un extrait aqueux d' aneth enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides de l'invention obtenu par le procédé décrit ci-dessus.
Cet extrait ne contient pas d'ADN (acide désoxyribonucléique) .
Un tel extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides comprend, avant dilution, en poids du poids total de l'extrait, 10 à 30 g/kg d'extrait de poids sec, 2 à 10 g/kg de fragments protéiques, 2 à 10 g/kg de sucres, 0, 2 à 3 g/kg d'acides aminés, 100 à 2000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. L'extrait ainsi obtenu est considéré comme concentré. Il peut être ensuite dilué dans un solvant physiologiquement acceptable pour un usage cosmétique, de telle sorte que la concentration de l'extrait est alors ajustée à un poids en extrait sec particulier d'intérêt.
A titre d'exemples illustratifs et non limitatifs de solvants physiologiquement acceptables, on peut citer l'eau, le glycérol, l'éthanol, le propanediol ainsi que sa version naturelle appelée Zemea® issue du maïs, le butylène glycol, le dipropylène glycol, les diglycols éthoxylés ou propoxylés, les polyols cycliques ou tout mélange de ces solvants.
Préférentiellement , l'extrait obtenu par le procédé selon l'invention est dilué dans un solvant tel que 30% de glycérol et de l'eau, et comprend en poids du poids total de l'extrait. L'extrait obtenu par le procédé selon l'invention comprend en outre de 5-15 g/kg d'extrait sec, de 50 à 1000 mg/kg de polyphénols 0,5-10 g/kg de fragments protéiques, 0,5-10 g/kg de sucres, de 0,1 à 1 g/kg d'acides aminés et 10-100 mg/kg de petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
A titre illustratif, des exemples préférés de mode de réalisation du procédé selon l'invention sont décrits ci- dessous .
Exemple 1 : Préparation d'un extrait d' aneth (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae, enrichi en petits ARN
Un extrait aqueux enrichi en ARN de petit poids moléculaire (d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides) est obtenu à partir d' aneth (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae.
Dans une première étape, 5% de parties aériennes séchées d' aneth sous forme de poudre sont placés dans de l'eau distillée et 10 mM d'EDTA tétrasodique sont ajoutés, soit 50 g de poudre d' aneth séchée dans 950 g d'eau distillée et 3,8 g d'EDTA tétrasodique. Le pH à cette étape doit être basique et compris entre 10,5 et 11 pour un enrichissement optimal de l'extrait en ARN de petit poids moléculaire.
Le mélange est ensuite chauffé 2h à 55°C sous agitation. Le mélange est ensuite centrifugé 10 min à 4000 g, pour ôter la matière solide.
A l'issue de cette étape, le pH est contrôlé, avant dilution éventuelle, afin de le placer si nécessaire entre 6 et 6,5 et préserver les petits ARN de l'extrait.
Des filtrations séquentielles sur filtres de porosité décroissante sont alors réalisées afin de clarifier l'extrait végétal jusqu'à une filtration stérilisante à 0,2 ym.
Exemple 2 : Caractérisation de l'extrait d' aneth
D'une manière générale, on obtient un extrait aqueux d' aneth de couleur vert clair titrant de 10 à 30 g/kg d'extrait de poids sec, 2 à 10 g/kg de fragments protéiques, 2 à 10 g/kg de sucres, 0,1 à 3 g/kg d'acides aminés, 300 à 750 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
Néanmoins, pour des parties aériennes d' aneth de l'espèce
Anethum graveolens, les extraits obtenus peuvent présenter une variabilité importante en fonction de facteurs tels que le lieu de récolte, l'année de récolte, la saison, les conditions climatiques, etc.
Dans l'extraction de l'exemple 1, on a obtenu un extrait aqueux titrant 12 g/kg d'extrait de poids sec.
L'analyse physico-chimique montre que cet extrait présente une concentration de 2,55 g/kg de fragments protéiques, 3 g/kg de sucres, 340 g/kg d'acides aminés, 650 mg/kg de composés phénoliques et 50 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. L'extrait est ensuite dilué avec un solvant cosmétique notamment avec 30% de glycérine ou de butylène glycol ou propanediol. Après dilution l'extrait présente une concentration de 1,7 g/kg de fragments protéiques, 2 g/kg de sucres, 240 g/kg d'acides aminés, 455 mg/kg de composés phénoliques et 35 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
Méthodes utilisées dans le dosage de spectrophotométrie pour déterminer la quantité de composés différents dans l'extrait d' aneth :
La teneur totale en protéines de l'extrait d' aneth a été déterminée par un dosage de protéines de Lowry (Lowry et al, 1951) . L'absorbance de l'échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 550 nm. La teneur en protéines est déterminée à l'aide d'une courbe standard de BSA.
La teneur en acides aminés de l'extrait a été déterminée à partir d'un protocole publié par Moore et al (1948), la teneur en acides aminés libre de l'extrait a été évaluée par la formation d'un complexe coloré, suite à la rupture des fonctions aminé et carboxylique par le Réactif ninhydrine. L'absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 570 nm. La teneur totale en acide aminées est déterminée par rapport à un pool d'acide aminés comme standard.
La teneur totale en sucres de l'extrait a été déterminée par une adaptation du dosage décrit par Dubois et al. (1956) (Dubois et al., "Méthode colorimétrique pour la détermination des sucres et des substances apparentées", Anal. Chem., 1956, 28 (3) , 350-356) . Cette analyse consiste en la dissolution de la matière première dans l'acide sulfurique concentré puis en réagissant avec du phénol pour former un complexe coloré. L'absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 490 nm. La teneur en sucre est déterminée à l'aide d'une courbe standard de glucose.
La teneur en polyphénols de l'extrait a été déterminée à l'aide du dosage de Folin-Ciocalteu (Singleton et al., Analyse des phénols totaux et d'autres substrats d'oxydation et antioxydants au moyen du réactif folin-ciocalteu, 1999, 299: 152) . Les composés de type polyphénols dans l'échantillon réagissent avec le réactif Folin-Ciocalteu, l'oxydation du réactif donne une couleur bleue. L'absorbance de l'échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 760 nm. Le contenu a été exprimé en équivalents d'acide gallique à l'aide d'une courbe standard d'acide gallique.
La quantification des ARN de bas poids moléculaires au moyen d'un Bioanalyseur® (Agilent) qui permet de réaliser des électrophorèses miniaturisées grâce à des puces électroniques spécifiques de l'analyse des acides nucléiques telle que celle des ARN de petit poids moléculaire. Il permet de déterminer la taille et la concentration contenues dans un extrait à partir de quelques microlitres. Le résultat se présente sous forme d'un graphique avec une unité arbitraire de fluorescence en ordonnée (FU) et en abscisse le nombre de nucléotides (nt) . Un marqueur interne est ajouté à chaque analyse (pic à 25 nt sur la figure 1, 2 et 3), et sert de contrôle interne pour valider le bon déroulement de l'analyse.
Exemple 3 : Préparation d'un extrait d' aneth provenant de Chine région non himalayenne (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae, enrichi en petits ARN
Un extrait aqueux enrichi en ARN de petit poids moléculaire (d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides) est obtenu à partir d' aneth (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae.
Dans une première étape, 5% de parties aériennes séchées d' aneth provenant de Chine région non himalayenne sous forme de poudre sont placés dans de l'eau distillée et 10 mM d'EDTA tétrasodique sont ajoutés, soit 50 g de poudre d' aneth séchée dans 950 g d'eau distillée et 3,8 g d'EDTA tétrasodique. Le pH à cette étape doit être basique et compris entre 10,5 et 11 pour un enrichissement optimal de l'extrait en ARN de petit poids moléculaire .
Le mélange est ensuite chauffé lh à 55°C sous agitation.
Le mélange est ensuite centrifugé 10 min à 4000 g, pour ôter la matière solide.
A l'issue de cette étape, le pH est contrôlé, avant dilution éventuelle, afin de le placer si nécessaire entre 6 et 6,5 et préserver les petits ARN de l'extrait.
Des filtrations séquentielles sur filtres de porosité décroissante sont alors réalisées afin de clarifier l'extrait végétal jusqu'à une filtration de 0,2 ym.
D'une manière générale, on obtient un extrait aqueux d' aneth de couleur vert clair titrant de 10 à 30 g/kg d'extrait de poids sec, 2 à 10 g/kg de fragments protéiques, 2 à 10 g/kg de sucres, 0, 1 à 3 g/kg d'acides aminés, 300 à 750 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
Néanmoins, pour des parties aériennes d' aneth de l'espèce Anethum graveolens, les extraits obtenus peuvent présenter une variabilité importante en fonction de facteurs tels que le lieu de récolte, l'année de récolte, la saison, les conditions climatiques, etc.
Dans cet exemple, on a obtenu un extrait aqueux titrant à 12 g/kg d'extrait de poids sec.
L'analyse physico-chimique montre que cet extrait présente une concentration de 2,5 g/kg de fragments protéiques, 3 g/kg de sucres, 340 g/kg d'acides aminés, 650 mg/kg de composés phénoliques et 50 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. L'extrait est ensuite dilué avec de l'eau ou un mélange eau et un solvant cosmétique notamment avec 30% de glycérine ou de butylène glycol ou propanediol pour obtenir un extrait à 8 g/Kg en poids sec. Après dilution, l'extrait présente une concentration de 1,7 g/kg de fragments protéiques, 2 g/kg de sucres, 240 g/kg d'acides aminés, 455 mg/kg de composés phénoliques et 35 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
Méthodes utilisées dans le dosage de spectrophotométrie pour déterminer la quantité des différents composés dans l'extrait d' aneth selon l'exemple 3 :
La teneur totale en protéines de l'extrait d' aneth a été déterminée par un dosage de protéines de Lowry (Lowry et al, 1951) . L'absorbance de l'échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 550 nm. La teneur en protéines est déterminée à l'aide d'une courbe standard de BSA.
La teneur en acides aminés de l'extrait a été déterminée à partir d'un protocole publié par Moore et al (1948), la teneur en acides aminés libre de l'extrait a été évaluée par la formation d'un complexe coloré, suite à la rupture des fonctions aminé et carboxylique par le Réactif ninhydrine. L'absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 570 nm. La teneur totale en acide aminées est déterminée par rapport à un pool d'acide aminés comme standard. La teneur totale en sucres de l'extrait a été déterminée par une adaptation du dosage décrit par Dubois et al. (1956) (Dubois et al., "Méthode colorimétrique pour la détermination des sucres et des substances apparentées", Anal. Chem., 1956, 28 (3) , 350-356) . Cette analyse consiste en la dissolution de la matière première dans l'acide sulfurique concentré puis en réagissant avec du phénol pour former un complexe coloré. L'absorbance du complexe est lue sur le spectrophotomètre à 490 nm. La teneur en sucre est déterminée à l'aide d'une courbe standard de glucose.
La teneur en polyphénols de l'extrait a été déterminée à l'aide du dosage de Folin-Ciocalteu (Singleton et al., Analyse des phénols totaux et d'autres substrats d'oxydation et antioxydants au moyen du réactif folin-ciocalteu, 1999, 299: 152) . Les composés de type polyphénols dans l'échantillon réagissent avec le réactif Folin-Ciocalteu, l'oxydation du réactif donne une couleur bleue. L'absorbance de l'échantillon est lue sur le spectrophotomètre à 760 nm. Le contenu a été exprimé en équivalents d'acide gallique à l'aide d'une courbe standard d'acide gallique.
Exemple 4 : Préparation d'un extrait d' aneth (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae, enrichi en petits ARN provenant d'Egypte.
Le procédé d'extraction est le même que dans l'exemple 3, seule l'origine géographique de provenance de l' aneth est différente ici l'Egypte.
Dans une première étape, 5% de parties aériennes séchées d' aneth d'Egypte sous forme de poudre sont placés dans de l'eau distillée et 10 mM d'EDTA tétrasodique sont ajoutés, soit 50 g de poudre d' aneth séchée dans 950 g d'eau distillée et 3,8 g d'EDTA tétrasodique. Le pH à cette étape doit être basique et compris entre 10,5 et 11 pour un enrichissement optimal de l'extrait en ARN de petit poids moléculaire. Le mélange est ensuite chauffé lh à 55°C sous agitation. Le mélange est ensuite centrifugé 10 min à 4000 g, pour ôter la matière solide.
A l'issue de cette étape, le pH est contrôlé, avant dilution éventuelle, afin de le placer si nécessaire entre 6 et 6,5 et préserver les petits ARN de l'extrait.
Des filtrations séquentielles sur filtres de porosité décroissante sont alors réalisées afin de clarifier l'extrait végétal jusqu'à une filtration à 0,2 ym de porosité.
Dans cet exemple on a obtenu un extrait aqueux titrant 20,4 g/kg d'extrait de poids sec.
L'analyse physico-chimique montre que cet extrait présente une concentration de 4,3 g/kg de fragments protéiques, 3,1 g/kg de sucres, 650 g/kg d'acides aminés, 720 mg/kg de composés phénoliques et 46 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. L'extrait est ensuite dilué avec de l'eau ou un mélange d'eau et d'un solvant cosmétique notamment avec 30% de glycérine ou de butylène glycol ou propanediol. Après dilution l'extrait présente une concentration de 1,8 g/kg de fragments protéiques, 1,5 g/kg de sucres, 360 g/kg d'acides aminés, 490 mg/kg de composés phénoliques et 32 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. Exemple 5 : Préparation d'un extrait d' aneth (Anethum graveolens) de la famille des Apiaceae, enrichi en petits ARN provenant de Chine, région Himalayenne.
Le procédé d'extraction est le même que dans l'exemple 3 (et 4) seule l'origine géographique de provenance de l' aneth est différente ici la région Himalayenne.
Dans une première étape, 5% de parties aériennes séchées d' aneth provenant de Chine, région Himalayenne, sous forme de poudre sont placées dans de l'eau distillée et 10 mM d'EDTA tétrasodique sont ajoutés, soit 50 g de poudre d' aneth séchée dans 950 g d'eau distillée et 3,8 g d'EDTA tétrasodique . Le pH à cette étape doit être basique et compris entre 10,5 et 11 pour un enrichissement optimal de l'extrait en ARN de petit poids moléculaire. Le mélange est ensuite chauffé lh à 55°C sous agitation.
Le mélange est ensuite centrifugé 10 min à 4000 g, pour ôter la matière solide.
A l'issue de cette étape, le pH est contrôlé, avant dilution éventuelle, afin de le placer si nécessaire entre 6 et 6,5 et préserver les petits ARN de l'extrait.
Des filtrations séquentielles sur filtres de porosité décroissante sont alors réalisées afin de clarifier l'extrait végétal jusqu'à une filtration à 0,2 ym de porosité.
Dans cet exemple on a obtenu un extrait aqueux titrant 20 g/kg d'extrait de poids sec.
L'analyse physico-chimique montre que cet extrait présente une concentration de 4,5 g/kg de fragments protéiques, 2,8 g/kg de sucres, 670 g/kg d'acides aminés, 650 mg/kg de composés phénoliques et 90 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides. L'extrait est ensuite dilué avec de l'eau ou un mélange eau et un solvant cosmétique notamment avec 30% de glycérine ou de butylène glycol ou propanediol. Après dilution l'extrait présente une concentration de 2,3 g/kg de fragments protéiques, 1,7 g/kg de sucres, 470 g/kg d'acides aminés, 455 mg/kg de composés phénoliques et 65 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
La quantification des ARN de bas poids moléculaires a été réalisée au moyen d'un Bioanalyseur® (Agilent) qui permet de réaliser des électrophorèses miniaturisées grâce à des puces électroniques spécifiques de l'analyse des acides nucléiques telle que celle des ARN de petit poids moléculaire. Il permet de déterminer la taille et la concentration contenues dans un extrait à partir de quelques microlitres. Le résultat se présente sous forme d'un graphique avec une unité arbitraire de fluorescence en ordonnée (FU) et en abscisse le nombre de nucléotides (nt) tel qu'illustré par la Figure 1. Un marqueur interne est ajouté à chaque analyse (pic à 25 nt sur la Figure 1, 2 et 3), et sert de contrôle interne pour valider le bon déroulement de l'analyse.
Exemple 6 : Etude de l'influence du pH final dans la préparation d'extraits d' aneth (Anethum graveolens) provenant de Chine, région Himalayenne, afin d'obtenir un extrait d' aneth dépourvu de petits ARN
Le procédé d'extraction est réalisé dans les mêmes conditions opératoires que l' exemple 3, 4 et 5, pour enrichir un extrait en ARN de petit poids moléculaire, hormis l'étape finale d'ajustement du pH.
Ce procédé d'extraction est réalisé avec une étape de traitement par EDTA tétrasodique, mais avec un ajustement final de l'extrait à un pH acide compris entre 4 et 4,5 au lieu d'un pH compris entre 6 et 8.
Ceci entraine la précipitation des ARN de petit poids moléculaire, résultats confirmés par l'analyse au Bioanalyseur® qui donne une concentration nulle en ARN de petit poids moléculaire (tel qu'illustré à la Figure 2) . Exemple 7 : Réalisation d'un extrait conventionnel obtenu par macération d' aneth (Anethum graveolens) provenant de Chine, région Himalayenne. Mise en évidence du rôle d'une étape de traitement par EDTA pour la mise en œuyre d'un procédé d'extraction de petits ARN
Dans le but de mettre en évidence le rôle d'une étape de traitement par EDTA lors de l'extraction des ARN de petit poids moléculaire, un extrait d' aneth (Anethum graveolens) a également été obtenu, en modifiant certaines étapes essentielles du procédé selon l'invention, ne permettant pas d'enrichir l'extrait en ARN de petit poids moléculaire.
Dans une première étape, 5% d' aneth sont broyés puis de l'eau est ajoutée, soit 50 g d' aneth dans 950 g d'eau distillée.
Le pH est mesuré et est de 5,5, le mélange est mis sous agitation pendant lh à 55°C.
Ensuite, l'extrait est centrifugé 10 min à 4000 g pour ôter la matière solide.
Des filtrations séquentielles sont alors réalisées sur des filtres de porosité décroissante de taille comprise entre 50 et 20 ym puis jusqu'à une porosité de 0,4 à 0,3 ym.
On obtient alors un extrait aqueux de couleur vert clair titrant à 13 g/kg d'extrait de poids sec, contenant 3,3 g/kg de fragments protéiques, 2,2 g/kg de sucres, 380 mg/kg d'acides aminés, et 410 mg/kg de composés phénoliques.
L'extrait est alors dilué pour être à 8 g/Kg en poids sec, par seul ajout d'eau.
L'analyse physico-chimique montre qu'après dilution l'extrait végétal présente une concentration en fragments protéiques de 2,8 g/kg, et en sucres de 1,7 g/kg, en acides aminés de 240 mg/kg, et en composés phénoliques de 280 mg/kg. Dans ces conditions d'extraction dite conventionnelle (absence de traitement par EDTA) , l'analyse au Bioanalyseur® indique que la concentration en ARN de petit poids moléculaire est nulle pour cet extrait (tel qu'illustré à la Figure 3) . Ce résultat confirme qu'un extrait obtenu à partir d'un procédé d'extraction en l'absence de traitement par EDTA (à pH basique) ne contient pas d'ARN de petit poids moléculaire. L'étape de traitement par EDTA est essentielle pour obtenir un extrait riche en ARN de petit poids moléculaire selon l'invention.
Plus particulièrement, selon un troisième aspect de l'invention, les extraits aqueux enrichis en petits ARN obtenus selon l'invention sont avantageusement utilisés dans la préparation de compositions cosmétiques comprenant, à titre d'agent actif, une quantité efficace d'un tel extrait de petits ARN selon l'invention, et un milieu physiologiquement acceptable .
Par quantité efficace, on désigne la quantité minimum d'extrait selon l'invention qui est nécessaire pour obtenir l'activité de l'extrait, en particulier cosmétique et plus particulièrement pour améliorer l'aspect de la peau, lutter contre les signes du vieillissement cutané ou pour l'amélioration de l'hydratation de la peau, sans que cette quantité soit toxique.
Avantageusement, l'extrait de petits ARN selon l'invention est utilisé, de préférence dilué dans un solvant cosmétique, à un poids sec compris entre 5 à 15 g/kg.
Avantageusement, l'extrait de petits ARN selon l'invention est présent dans la composition à une concentration de 0,1 à 5% en poids par rapport au poids total de la composition, et de préférence à une concentration comprise entre 0,5% et 2,5% en poids par rapport au poids total de la composition.
Un milieu physiologiquement acceptable désigne un véhicule adapté pour une mise en contact avec les couches externes de la peau ou des muqueuses, sans toxicité, irritation, réponse allergique indue et similaire ou réaction d'intolérance, et proportionné à un rapport avantage/risque raisonnable.
La composition utilisable selon l'invention pourra être appliquée par toute voie appropriée, notamment orale, ou topique externe, et la formulation des compositions sera adaptée par l'homme du métier.
La composition selon l'invention peut être formulée pour être administrée par voie orale. Les formes galéniques utilisées peuvent être sous forme solide ou liquide. Les formes orales solides sont généralement des comprimés, capsules dures (gélules) , capsule molle, sachets comprenant une poudre ou des granulés. Les formes orales liquides sont généralement des solutions buvables, sirops, élixirs, émulsions buvables, suspensions buvables, gouttes buvables.
Préférentiellement , les compositions selon l'invention se présentent sous une forme adaptée à l'application par voie topique. Ces compositions doivent donc contenir un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau et les phanères, sans risque d' inconfort lors de leur application et couvrent toutes les formes cosmétiques adaptées.
Par application topique, on désigne le fait d'appliquer ou d'étaler l'extrait aqueux enrichi en petits ARN selon l'invention, et plus particulièrement une composition le contenant, à la surface de la peau ou d'une muqueuse.
« Peau » désigne la peau du visage, notamment le contour des yeux et la bouche, le nez, le front, le cou, les mains, mais aussi la peau de l'ensemble du corps.
Les compositions pour la mise en œuvre de l'invention pourront notamment se présenter sous forme d'une solution aqueuse, hydro-alcoolique ou huileuse, d'une émulsion huile- dans-eau, eau-dans-huile ou émulsions multiples ; elles peuvent aussi se présenter sous forme de suspensions, ou encore poudres, adaptées à une application sur la peau, les muqueuses, les lèvres et/ou les cheveux.
Ces compositions peuvent être plus ou moins fluides et avoir également l'aspect d'une crème, d'une lotion, d'un lait, d'un sérum, d'une pommade, d'un gel, d'une pâte ou d'une mousse. Elles peuvent aussi se présenter sous forme solide, comme un stick ou être appliquées sur la peau sous forme d'aérosol.
A titre de milieu physiologiquement acceptable communément utilisé dans le domaine d'application envisagé, on peut citer par exemple des adjuvants nécessaires à la formulation, tels que des solvants, des épaississants, des diluants, des antioxydants, des colorants, des filtres solaires, des agents auto-bronzants, des pigments, des charges, des conservateurs, des parfums, des absorbeurs d'odeur, des huiles essentielles, des vitamines, des acides gras essentiels, des tensioactifs , des polymères filmogènes, etc.
Dans tous les cas, l'homme de métier veillera à ce que ces adjuvants ainsi que leurs proportions soient choisis de telle manière à ne pas nuire aux propriétés avantageuses recherchées de la composition selon l'invention. Ces adjuvants peuvent, par exemple, correspondre à 0,01 à 20% du poids total de la composition. Lorsque la composition selon l'invention est une émulsion, la phase grasse peut représenter de 5 à 80% en poids et de préférence de 5 à 50% en poids par rapport au poids total de la composition. Les émulsionnants et co-émulsionnants utilisés dans la composition sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine considéré. Par exemple, ils peuvent être utilisés en une proportion allant de 0,3 à 30% en poids par rapport au poids total de la composition.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, l'extrait aqueux enrichi en petits ARN selon l'invention peut être encapsulé ou inclus dans un vecteur cosmétique tels que les liposomes ou toute autre nanocapsule ou microcapsule utilisée dans le domaine de la cosmétique ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, des supports minéraux comme les talcs et bentonites.
Avantageusement, la composition selon l'invention peut comprendre, outre l'agent actif selon l'invention, au moins un autre agent actif présentant des effets cosmétiques similaires et/ou complémentaires à ceux de l'invention. Selon l'invention, cet agent actif est défini comme un « agent actif additionnel ».
Par exemple, le ou les agents actifs additionnels peuvent être choisis parmi : les agents anti-âge, raffermissants, éclaircissants , hydratants, drainants, favorisant la microcirculation, exfoliants, desquamants, stimulant la matrice extracellulaire, activant le métabolisme énergétique, antibactériens, antifongiques, apaisants, anti-radicalaires , anti-UV, anti-acné, anti-inflammatoires, anesthésiques , procurant une sensation de chaleur, procurant une sensation de fraîcheur, amincissants.
De tels agents actifs additionnels peuvent être choisis dans les groupes comprenant :
- la vitamine A et notamment l'acide rétinoïque, le rétinol, le rétinol proprionate, le rétinol palmitate ;
- la vitamine B3 et plus particulièrement le niacinamide, le nicotinate de tocophérol ;
- la vitamine B5, la vitamine B6, la vitamine B12, le panthénol ;
- la vitamine C, notamment l'acide ascorbique, l'ascorbyl glucoside, l'ascorbyl tétrapalmitate, magnésium et sodium ascorbyl phosphate ;
- les vitamines E, F, H, K, PP, le coenzyme Q10 ;
- les inhibiteurs de métalloprotéinase, ou un activateur des TIMP ;
- la DHEA, ses précurseurs et dérivés ;
les acides aminés tels que l'arginine, ornithine, hydroxyproline, hydroxyproline dipalmitate, palmitoylglycine, hydroxylysine, méthionine et ses dérivés, composés acides aminés N-acylés ;
- les peptides naturels ou de synthèse, incluant les di-, tri-, tetra-, penta- et hexapeptides et leurs dérivés lipophiles, isomères et complexés avec d'autres espèces telles qu'un ion métal (par exemple cuivre, zinc, manganèse, magnésium, et autres) . A titre d'exemples, on peut citer les peptides commercialement connus sous le nom de MATRIXYL® (SEDERMA®) , ARGIRELINE® (LIPOTEC®) , CHRONOGEN™, LAMINIXYL IS™, PEPTIDE Q10™, COLLAXYL ™ (brevet FR2827170, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 01™ (brevet FR2837098, ASHLAND®), PEPTIDE VINCI 02™ (brevet FR2841781, ASHLAND®), ATPeptide™ (brevet FR2846883, ASHLAND®) ou encore le peptide de synthèse de séquence Arg-Gly-Ser-NH2, commercialisé sous le nom ATPeptide™ par ASHLAND® ; - l'extrait d' Artémia salina, commercialisé sous le nom GP4G™ (FR2817748, ASHLAND®) ;
- les extraits peptidiques végétaux tels que les extraits de lin (Lipigénine™, brevet FR2956818, ASHLAND®), les extraits de soja, d'épeautre, de vigne, de colza, de lin, de riz, de maïs, de pois ;
- les extraits de levures, par exemple le Dynagen™, (brevet FR2951946, ASHLAND®) ou 1 ' Actopontine™ (brevet FR2944526, ASHLAND®) ;
- l'acide déhydroacétique (DHA) ;
- les phystostérols d'origine synthétique ou naturelle ;
- l'acide salicylique et ses dérivés, les alpha- et bêta- hydroxyacides , les silanols ;
- les sucres aminés, glucosamine, D-glucosamine, N-acetyl glucosamine, N-acetyl-D-glucosamine, mannosamine, N-acetyl mannosamine, galactosamine, N-acetyl galactosamine ;
- les extraits de polyphénols, isoflavones, flavonoïdes, tels que les extraits de raisin, les extraits de pin, les extraits d'olive ;
- les lipides tels que les céramides ou les phospholipides, les huiles d'origine animale, telles que le squalène ou le squalane ; les huiles végétales, telles que l'huile d'amande douce, de coprah, de ricin, de jojoba, d'olive, de colza, d'arachide, de tournesol, de germes de blé, de germes de maïs, de soja, de coton, de luzerne, de pavot, de potiron, d'onagre, de millet, d'orge, de seigle, de carthame, de passiflore, de noisette, de palme, de noyau d'abricot, d'avocat, de calendula ; les huiles végétales éthoxylées, le beurre de karité ;
- tous écrans UV et filtres solaires ;
- l'AMP cyclique et ses dérivés, les agents activateurs de l'enzyme adénylate cyclase et les agents inhibiteurs de l'enzyme phosphodiestérase, l'extrait de Centella asiatica,
1 ' asiaticoside et l'acide asiatique, les méthyls xanthines, la théine, la caféine et ses dérivés, la théophylline, la théobromine, la forskoline, l'esculine et l' esculoside, les inhibiteurs d'ACE, le peptide Val-Trp, 1 ' inhibiteurs du neuropeptide Y, l' enkephaline, l'extrait de Ginkgo biloba, l'extrait de dioscorea, la rutine, l'extrait de yerba mate, l'extrait de guarana, les oligosaccharides, les polysaccharides , la carnitine, l'extrait de lierre, l'extrait de fucus, l'extrait hydrolysé de Prunella vulgaris, l'extrait hydrolysé de Celosia cristata, l'extrait d' Anogeissus leiocarpus, l'extrait de feuilles de Manihot utilissima, la palmitoylcarnitine, la carnosine, la taurine, l'extrait de sureau, les extraits d'algue tel que l'extrait de Palmaria Palmata.
A titre d'illustration, il est mentionné ci-après des exemples de formulations d'une composition cosmétique contenant un extrait aqueux enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides obtenu selon l'invention :
Exemple 8 : Baume pour le contour des yeux
Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w
Phase A
Eau purifiée Aqua Qsp 100
EDTA tétrasodique Tetrasodium EDTA 0,01
Phase B
RapiThix™ A-100 polymer Sodium Polyacrylate 1,80
Phase C
Vegetable oil (and) Hydrogenated
Cegesoft VP vegetable oil (and) Euphorbia 3,00
Cerifera {Candelilla) Wax
Si-Tec™ GF 3096 silicone Dimethicone (and) Dimethiconol 10,00
Phase D
Dimethicone/Vinyl Dimethicone
DC 9701 Cosmetic Powder 1,00
Crosspolymer (and) Silica
Phase E
Phenoxyethanol (and) Caprylyl
Optiphen™ preservative 0, 50
Glycol
Phase F
Water/Aqua (and) Glycerin (and)
Extrait selon l'exemple 1 Peucedanum Graveolens (Dill) 1,00
extract
Zemea® Propanediol 5,00
CI 77891 (Titanium Dioxide) (and)
Timiron Splendid Violet 1,00
Mica (and) Silica Procédé de préparation:
1. Homogénéiser la phase A dans le récipient principal jusqu'à ce qu'elle soit claire ;
2. A 25°C, saupoudrer dans la Phase B et homogénéiser pendant 10 minutes jusqu'à homogénéité ;
3. A 25°C, préparer la phase C dans un bêcher à part, mélanger jusqu'à homogénéité. Saupoudrer dans la phase D et bien mélanger jusqu'à homogénéité ;
4. A 25°C, ajouter la phase C + D dans le récipient principal et mélanger jusqu'à homogénéité ;
5. À 25°C, ajouter la phase E dans le récipient principal et mélanger jusqu'à homogénéité ;
6. A 25°C, Prémélanger la phase F, l'ajouter dans le récipient principal et mélanger jusqu'à homogénéité ;
7. Arrêter à 25°C.
La composition se présente ainsi sous forme d'un gel crème nacré violet, avec un pH compris entre 5,70 et 6,20 et une viscosité (D0) de 80000 - 130000 cps (Brookfield RVT/Spindle C/5 RPM/1 minute/25 °C) .
Exemple 9 : Crème riche
Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w
Phase A
Eau purifiée Aqua Qsp 100
Optiphen™ Plus Phenoxyethanol (and) Caprylyl Glycol 1, 50 préservâtive (and) Sorbic Acid
Phase B
Stabileze™ QM polymer PVM/MA Decadiene Crosspolymer 0,15
Phase C
Glyceryl Stéarate (and) Behenyl Alcohol
(and) Palmitic Acid (and) Stearic Acid
ProLipid™ 141 lamellar gel (and) Lecithin (and) Lauryl Alcohol (and) 5,00
Myristyl Alcohol (and) Cetyl Alcohol
Ceraphyl™ 494 ester Isocetyl Stéarate 4,00
Ceraphyl™ SLK ester Isodecyl Neopentanoate 4,00
DC 580 Wax Stearoxytrimethylsilane (and) Stearyl 2,00
Alcohol
Emulsynt™ GDL ester Glyceryl Dilaurate 3,00 Phase D
Gransil DM-5 Dimethicone (and) Polysilicone-11 3,00
Phase E
Hydroxyde de sodium Sodium Hydroxide 0,04
Eau purifiée Aqua 0, 50
Phase F
PF Bois Précieux Parfum/Fragrance 0, 30
CI 77491 (Iron oxides) (and) Isopropyl
Titanium Triisostearate (and) Bis-
Unipure* Red LC 381 ADT-C Hydroxyethoxypropyl Dimethicone (and) 0,03
PEG-2-Soyamine (and) Isophorone
Diisocyanate
Phase G
Water/Aqua (and) Glycerin (and) 3,00
Extrait selon l'exemple 1
Peucedanum Graveolens (Dill) extract
Ronaflair Balance Gold CI 77891 (Titanium Dioxide) (and) Mica 0, 30
(and) Tin Oxide
Covabead Velvet 10 Polymethyl Methacrylate 1,00
Ronaflair Balance Red CI 77891 (Titanium Dioxide) (and) Mica 1,20
(and) Tin Oxide
Phase H
Eau purifiée Aqua 15,00
Natrosol™ Plus 330 CS Cetyl Hydroxyethylcellulose 0, 50
Procédé de préparation:
1. Homogénéiser la phase A dans le récipient principal et commencer à chauffer à 75-80 °C ;
2. A 30°C, saupoudrer dans la Phase B et homogénéiser tout en chauffant ;
3. Dans un bêcher à part, préparer la phase C, chauffer à 75- 80 °C jusqu'à homogénéité ;
4. A 75°C, ajouter la phase C dans le récipient principal et homogénéiser pendant 10 minutes ;
5. Laisser refroidir la température et ajouter la phase D à 65°C. Bien mélanger pour homogénéiser pendant 10 minutes ;
6. Prémélanger la phase E avant de l'ajouter dans le récipient principal ;
7. Ajouter la phase E à 60 °C. Bien mélanger pour homogénéiser pendant 10 minutes ;
8. A 35°C, prémélanger la phase F avant de l'ajouter et de bien mélanger ;
9. Prémélanger la phase G avant de l'ajouter dans le récipient principal ; 10. Ajouter la phase G à 35°C. Bien mélanger pour homogénéiser ;
11. Dans un bêcher à part, préparer la phase H: saupoudrer Natrosol™ dans l'eau à température ambiante et homogénéiser tout en chauffant à 60 °C ;
12. Ajouter la phase H à 30 °C. Bien mélanger pour homogénéiser ; 13. Arrêter à 25°C.
La composition se présente ainsi sous forme d'une crème beurre rose, avec un pH compris entre 4,90 et 5,40 et une viscosité (D0) de 160000 - 210000 cps (Brookfield RVT/Spindle D/5 RPM/1 minute/25°C) .
Exemple 10: Sérum visage
Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w
Phase A
Eau purifiée Aqua Qsp 100
Propylène Glycol Propylène Glycol 35, 10
SD Alcohol 40B Absolute Alcohol 10,00
Butylène Glycol Butylène Glycol 5,00
EDTA disodique Disodium EDTA 0,10
Phase B
Flexithix™ polymer PVP 2,00
Phase C
Gomme xanthane Xanthan Gum 0,25
Phase D
Sodium Polyacrylate (and) Hydrogenated
Rapithix™ A-60 polymer 1,00
Polydecene (and) Trideceth-6
Rokonsal™/LiquaPar™ MEP Phenoxyethanol (and) Methylparaben (and)
0,70 préservâtive Ethylparaben (and) Propylparaben
Phase E
Water/Aqua (and) Glycerin (and)
Extrait selon l'exemple 1 5,00
Peucedanum Graveolens (Dil) extract
Phase F
Cyclopentasiloxane Cyclopentasiloxane 6,00
DM 350 Dimethicone 3,00
Dimethicone (and) Cyclopentasiloxane
Gransil* DMCM-5 1, 50
(and) Polysilicone-11
Vinyl Dimethicone/Methicone
KSP* 100 1,00
Silsesquioxane Crosspolymer
Phase G
Unicert* Yellow 08006-J Water/Aqua (and) CI 15985 (Yellow 6) 0, 60 Procédé de préparation :
1. Dans un bêcher à température ambiante, peser les ingrédients de la phase A et mélanger. Saupoudrer la phase B et homogénéiser ;
2. A température ambiante, saupoudrer dans la phase C et continuer à homogénéiser l'ensemble ;
3. A température ambiante, ajouter la phase D à la phase ABC et continuer à homogénéiser ;
4. A température ambiante, ajouter la phase E et homogénéiser ; 5. A température ambiante, ajouter la phase F et homogénéiser l'ensemble ;
6. A température ambiante, ajouter la phase G et mélanger jusqu'à homogénéité ;
7. Arrêter à 25°C. La composition se présente ainsi sous forme d'un gel lisse, translucide, jaune crème, avec un pH compris entre 6,30 et 7,10 et une viscosité (D0) de 10000 - 15000 cps (Brookfield RVT/Spindle B/5 RPM/1 minute/25°C) .
Exemple 11 : Masque anti-âge
Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w
Phase A
Qsp
Eau purifiée Aqua
100
EDTA tétrasodique Tetrasodium EDTA 0,05
Phase B
N-Hance™ HP40S guar Hydroxypropyl Guar 0,10
Phase C
Glycerin (and) Glyceryl Acrylate/Acrylic
Lubrajel™ DV Free hydrogel 6,00
Acid Copolymer
Phase D
Si-Tec™ GF 3096 silicone Dimethicone (and) Dimethiconol 12,00
Sodium Polyacrylate (and) Hydrogenated
RapiThix™ A-60 polymer 2,40
Polydecene (and) Trideceth-6
Phase E
Optiphen™ Plus Phenoxyethanol (and) Caprylyl Glycol (and)
1, 50 préservâtive Sorbic Acid
Phase F Surfin* 96 Alcohol Denat. 3, 50
PF Cucumber & Aloe Parfum/ ragrance 0, 50
Phase G
Water/Aqua (and) Glycerin (and) Peucedanum
Extrait selon l'exemple 1 1,00
Graveolens (Dil) extract
Achromaxyl™ ISR Water/Aqua (and) Glycerin (and) Hydrolyzed
3,00 biofunctional Brassica Napus Seedcake Extract
Mica (and) CI 77891 (Titanium Dioxide)
Xirona Carribean Blue 1,00
(and) Silica (and) Tin Oxide
Procédé de préparation:
1. A 25°C, homogénéiser la phase A dans le récipient principal ;
2. A 25°C, saupoudrer dans la phase B et bien mélanger jusqu'à homogénéité ;
3. A 25°C, ajouter la phase C et bien mélanger jusqu'à homogénéité ;
4. Prémélanger la phase D dans un bêcher à part et ajouter dans le récipient principal à 25°C ;
5. A 25°C, ajouter la phase E dans le récipient principal et bien mélanger ;
6. Prémélanger la phase F et l'ajouter lentement. Bien mélanger bien jusqu'à homogénéité ;
7. Prémélanger la phase G dans un bêcher à part et ajouter dans le récipient principal jusqu'à homogénéité ;
8. Arrêter à 25°C.
La composition se présente ainsi sous forme d'un gel crème avec des effets vert scintillant, avec un pH compris entre 5,30 et 5,80 et une viscosité (D0) de 70000 - 100000 cps (Brookfield RVT/Spindle C/5 RPM/1 minute/25°C) .
Exemple 12 : Sérum
Ingrédients (Nom de marque) INCI % w/w
Phase A
Eau déminéralisée Aqua 87,40
Sodium Hyaluronate Sodium Hyaluronate 0,20
Sodium Polyacrylate (and)
RapiThix™ A-60 polymer Hydrogenated Polydecene (and) 0,40
Trideceth-6 Glycerin (and) Glyceryl
Lubrajel™ DV hydrogel Acrylate/Acrylic Acid Copolymer 6,00
(and) Propylene Glycol
Glycerin (and) Glyceryl
Acrylate/Acrylic Acid Copolymer
Lubrajel™ Oil hydrogel 1,00
(and) Propylene Glycol (and)
PVM/MA Copolymer
Wacker-Belsil* DM 100 Dimethicone 2,00
Cyclopentasiloxane NF Cyclopentasiloxane 0, 50
Water/Aqua (and) Glycerin (and)
Extrait selon l'exemple 1 Peucedanum Graveolens (Dil) 1,00
extract
Phenoxyethanol (and) Caprylyl
Optiphen™ preservative 1, 50
Glycol
Procédé de préparation :
1. Ajouter de l'eau dans le récipient principal et de commencer le mélange avec une pale d'hélice hi-lo ;
2. Ajouter le reste des ingrédients, un après l'autre tout en mélangeant entre chaque addition.
La composition se présente ainsi sous forme d'un sérum lisse, semi-opaque, avec un pH compris entre 5,75 et 6,25 et une viscosité (D0) de 1,100 - 1,400 cps (Brookfield RVT/spindle 3/20 rpm/25° C/l minute) .
Selon un quatrième aspect, l'invention concerne l'utilisation cosmétique d'une composition selon l'invention pour le soin de la peau, du cuir chevelu et des phanères. L'invention concerne notamment l'utilisation cosmétique de la composition selon l'invention pour améliorer l'aspect de la peau, lutter contre les signes du vieillissement cutané ou améliorer l'hydratation cutanée.
Par phanères, on entend des substances naturellement présentes dans l'organisme humain ou l'organisme animal riches en kératine, et plus particulièrement les cheveux, les poils, les cils, les sourcils et les ongles. L'utilisation et les compositions selon la présente invention sont particulièrement destinées aux cheveux. L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation cosmétique d'une composition selon l'invention pour améliorer l'hydratation de la peau et renforcer la fonction barrière.
L' invention concerne également plus particulièrement l'utilisation cosmétique d'une composition selon l'invention pour lutter contre les signes du vieillissement cutané et améliorer la fermeté et l'élasticité de la peau.
Enfin, l'invention concerne aussi l'utilisation cosmétique d'une composition selon l'invention pour améliorer la santé du cheveu .
On entend par « améliorer l'aspect de la peau » que le grain de la peau apparaît plus fin, la luminosité plus intense et le teint plus homogène.
Par « signes du vieillissement cutané » on entend toutes modifications de l'aspect extérieur de la peau dues au vieillissement comme, par exemple, les rides et ridules, les crevasses, les poches sous les yeux, les cernes, le flétrissement , la perte d'élasticité, de fermeté et/ou de tonus de la peau, mais également toutes modifications internes de la peau qui ne se traduisent pas systématiquement par un aspect extérieur modifié comme, par exemple, l'amincissement de la peau, ou toutes dégradations internes de la peau consécutives à des stress environnementaux tels que la pollution et les rayonnements UV.
On entend par « amélioration de l'hydratation cutanée », toutes améliorations des modifications de l'aspect extérieur de la peau dues à la déshydratation comme, par exemple, la sécheresse, les tiraillements et l' inconfort.
Par « améliorer la santé du cheveu » on entend un renforcement de la structure du cheveu permettant d'améliorer leur apparence et de favoriser leur lissage et leur résistance.
A ce titre, l'invention est illustrée ci-après, par des résultats de tests d' activité pour le soin de la peau et du cuir chevelu . Exemple 13 : Evaluation des effets des extraits d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 sur la matrice extracellulaire du derme par l'étude du collagène I, de la dermatopontine et de 1 ' élastine
Le but de cette étude est de comparer les effets sur la matrice extracellulaire du derme de trois extraits d' aneth d'Himalaya. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 5, le deuxième extrait ne contenant pas d'ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 6 et le dernier extrait obtenu après macération selon 1 ' exemple 7.
Le but de cette étude est d'évaluer les effets de ces trois extraits d' aneth sur l'expression des protéines collagène I, dermatopontine et élastine impliquées dans la structure de la matrice extracellulaire. Le collagène et l'élastine sont très importants pour le maintien de l'élasticité et de la fermeté de la peau. La dermatopontine est localisée sur les fibres de collagène (Forbes EG, Cronshaw AD, MacBeath JRE, Hulmes DJS . Tyrosine-rich acidic matrix protein (TRAMP) is a tyrosine- sulphated and widely distributed protein of the extracellular matrix. FEBS Lett. 1994 351 (3) : 433-6) . Elle facilite la fibrogénèse, stabilise les fibres de collagène et régule leur diamètre (Macbeath J, Shackleton D, and Hulmes D. Tyrosine-rich Acidic Matrix Protein (TRAMP) accélérâtes collagen fibril formation in vitro. J. Biol. Chem. 1993 268:19826-32) .
Protocole :
Des biopsies de peau humaine de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 48h (dermatopontine) ou 72h (collagène I et élastine) et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de peau de 4 ym d'épaisseur sont ensuite réalisées. Les marquages du collagène I, de la dermatopontine et de l'élastine sont effectués après démasquage des sites spécifiques. Les immunomarquages sont réalisés à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène I (Rockland, Réf. 600-401-103-0.5), d'un anticorps monoclonal de souris spécifique de la dermatopontine (Santa Cruz, Réf. Sc- 376863), d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique de l'élastine (Abcam, Réf. Ab21610), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin ou anti-souris couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. A21206 et A21202) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue après marquage du collagène I est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) . Une quantification du contenu de dermatopontine dans le derme est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) . Une quantification de la longueur des fibres obtenues après marquage de l'élastine est réalisée, à l'aide du logiciel ImageJ.
Résultats :
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 1 ci- après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h (dermatopontine) ou 72h (collagène I et élastine) permettent d'observer une augmentation significative de l'expression de collagène I et de dermatopontine et de la longueur des fibres d' élastine comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 6 (absence d'ARN de petit poids moléculaire) et 7 (macération) à partir de plantes provenant d'Himalaya. Les résultats obtenus sur la quantification de la longueur des fibres après marquage immunofluorescent de l' élastine sur peau ex vivo traitée pendant 72h avec les différents extraits d' aneth à 1% (Tableau 1) sont plus particulièrement illustrés dans la Figure 4, dans laquelle : moyenne +/- sem ; n=3 ; ***: hautement significatif, *: significatif, ns : non significatif, avec le test t de Student. Tableau 1 :
Figure imgf000037_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) stimule davantage l'expression du collagène I, de la dermatopontine et de l' élastine dans la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth d'Himalaya non enrichis en petits ARN (exemples 6 et 7) . Ces protéines sont impliquées dans la fermeté et l'élasticité de la peau, leur synthèse permet donc un effet raffermissant. L'extrait d' aneth obtenu selon l'invention permet donc de lutter efficacement contre les signes du vieillissement cutané en améliorant la fermeté et l'élasticité de la peau. Exemple 14 : Evaluation des effets des extraits d' aneth de différentes origines (Chine non himalayenne, Egypte, Chine
Himalaya) respectivement selon les exemples 3, 4 et 5 sur la matrice extracellulaire du derme par l'étude du collagène I, de la dermatopontine et de l' élastine
Le but de cette étude est de comparer les effets sur la matrice extracellulaire du derme de trois extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3, 4 et 5 ayant des origines géographiques différentes. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant de Chine non himalayenne, le deuxième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Egypte et le troisième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant de Chine d' Himalaya .
Le but de cette étude est d'évaluer les effets de ces trois extraits d' aneth sur l'expression des protéines collagène I, dermatopontine et élastine impliquées dans la structure de la matrice extracellulaire.
Protocole :
Des biopsies de peau humaine de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 48h (dermatopontine) ou 72h (collagène I et élastine) et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth de différentes origines géographiques, dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de peau de 4 ym d'épaisseur sont ensuite réalisées. Les marquages du collagène I, de la dermatopontine et de l' élastine sont effectués après démasquage des sites spécifiques. Les immunomarquages sont réalisés à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique du collagène I (Rockland, Réf. 600-401-103-0.5), d'un anticorps monoclonal de souris spécifique de la dermatopontine (Santa Cruz, Réf. Sc- 376863), d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique de l'élastine (Abcam, Réf. Ab21610), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin ou anti-souris couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. A21206 et A21202) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue après marquage du collagène I est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) . Une quantification du contenu de dermatopontine dans le derme est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) . Une quantification de la longueur des fibres obtenues après marquage de l' élastine est réalisée, à l'aide du logiciel ImageJ. Résultats :
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 2 ci- après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h (dermatopontine) ou 72h (collagène I et élastine) permettent d'observer une augmentation significative de l'expression de collagène I et de dermatopontine et de la longueur des fibres d' élastine comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3 et 4 à partir de plantes provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte. Les résultats obtenus sur la quantification de la longueur des fibres après marquage immunofluorescent de l' élastine sur peau ex vivo traitée pendant 72h avec les différents extraits d' aneth à 1% (Tableau 2) sont plus particulièrement illustrés dans la Figure 4.
Tableau 2 :
Longueur
Expression Contenu en
des fibres du col I DPT
d' élastine (%) (%)
(%)
Contrôle 100 100 100
Extrait d' aneth d'Egypte
139 119 134 selon l'exemple 4
Extrait d' aneth de Chine
non himalayenne selon 81 115 125 l'exemple 3
Figure imgf000040_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) stimule davantage l'expression du collagène I et de l'élastine dans la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth enrichi en petits ARN (exemples 3 et 4) provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte. Ces protéines sont impliquées dans la fermeté et l'élasticité de la peau, leur synthèse permet donc un effet raffermissant. L'extrait d' aneth, et notamment d' aneth provenant d'Himalaya, obtenu selon l'invention permet donc de lutter efficacement contre les signes du vieillissement cutané en améliorant la fermeté et l'élasticité de la peau.
Exemple 15 : Evaluation des effets des extraits d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 sur l'hydratation par l'étude de l'acide hyaluronique
Le but de cette étude est de comparer les effets sur la synthèse de l'acide hyaluronique de trois extraits d' aneth d'Himalaya. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 5, le deuxième extrait ne contenant pas d'ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 6 et le dernier extrait obtenu après macération selon 1 ' exemple 7.
L'étude de l'expression de l'acide hyaluronique est un moyen de juger de l'effet hydratant de l'invention. En effet, l'acide hyaluronique est un composant majoritaire de la matrice extracellulaire du derme, également présent dans l'épiderme, et est impliqué dans l'hydratation cutanée.
Protocole :
Des biopsies de peau humaine de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 72h et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de peau de 4 ym d'épaisseur sont ensuite réalisées. Le marquage de l'acide hyaluronique est réalisé à l'aide d'une protéine de liaison spécifique de l'acide hyaluronique, biotinylé (Coger-Seikagaki , Réf. 400-763-1A), et de streptavidine couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. S32354) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi- fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue après marquage de l'acide hyaluronique est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® ( Improvision) .
Résultats :
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 3 ci-après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 72h permettent d'observer une augmentation significative de la synthèse d'acide hyaluronique aussi bien dans le derme que dans l'épiderme, comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 6 (absence d'ARN de petit poids moléculaire) et 7 (macération) à partir de plantes provenant d'Himalaya. Les résultats obtenus sur la quantification du marquage de l'acide hyaluronique sur peau ex vivo traitée pendant 72h avec différents extraits d' aneth à 1% (Tableau 3) sont plus particulièrement illustrés dans la Figure 5, dans laquelle : moyenne +/- sem ; n=3 ; ***: hautement significatif, **: très significatif, ns : non significatif, avec le test t de Student. Tableau 3 :
Figure imgf000042_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) stimule davantage la synthèse d'acide hyaluronique dans l'épiderme et le derme de la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth d'Himalaya non enrichis en petits ARN (exemples 6 et 7) . L'acide hyaluronique est impliqué dans l'hydratation de la peau.
Exemple 16 : Evaluation des effets des extraits d' aneth de différentes origines (Chine non himalayenne, Egypte, Chine d'Himalaya) respectivement selon les exemples 3, 4 et 5 sur l'hydratation par l'étude de l'acide hyaluronique
Le but de cette étude est de comparer les effets sur la synthèse de l'acide hyaluronique de trois extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3, 4 et 5 ayant des origines géographiques différentes. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant de Chine non himalayenne, le deuxième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Egypte et le troisième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Himalaya.
L'étude de l'expression de l'acide hyaluronique est un moyen de juger de l'effet hydratant de l'invention. En effet, l'acide hyaluronique est un composant majoritaire de la matrice extracellulaire du derme, également présent dans l'épiderme, et est impliqué dans l'hydratation cutanée.
Protocole :
Des biopsies de peau humaine de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 72h et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth de différentes origines géographiques, dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de peau de 4 ym d'épaisseur sont ensuite réalisées. Le marquage de l'acide hyaluronique est réalisé à l'aide d'une protéine de liaison spécifique de l'acide hyaluronique, biotinylé (Coger-Seikagaki , Réf. 400-763-1A), et de streptavidine couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. S32354) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue après marquage du collagène I est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) .
Résultats :
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 4 ci- après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 72h permettent d'observer une augmentation significative de la synthèse d'acide hyaluronique aussi bien dans le derme que dans l'épiderme, comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3 et 4 à partir de plantes provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte. Les résultats obtenus sur la quantification du marquage de l'acide hyaluronique sur peau ex vivo traitée pendant 72h avec différents extraits d' aneth à 1% (Tableau 4) sont plus particulièrement illustrés dans la Figure 5.
Tableau 4 :
Figure imgf000044_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) stimule davantage la synthèse d'acide hyaluronique dans l'épiderme et le derme de la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth enrichi en petits ARN (exemples 3 et 4) provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte. L'acide hyaluronique est impliqué dans l'hydratation de la peau.
Exemple 17 : Evaluation des effets des extraits d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 sur le vieillissement de la peau par l'étude de P16, de la kératine 14 et de la fibrilline 1
Le but de cette étude est de comparer les effets sur le vieillissement de la peau de trois extraits d' aneth d'Himalaya. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 5, le deuxième extrait ne contenant pas d'ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 6 et le dernier extrait obtenu après macération selon l'exemple 7.
Le but de cette étude est d'évaluer les effets de ces trois extraits d' aneth sur l'expression des protéines pl6, kératine 14 (K14) et fibrilline 1, impliquées dans le vieillissement cutané. pl6 est un régulateur du cycle cellulaire qui augmente avec l'âge (Ressler S, Bartkova J, Niederegger H, Bartek J, Scharffetter- Kochanek K, Jansen-Diirr P, Wlaschek M. pl6INK4A is a robust in vivo biomarker of cellular aging in human skin. Aging Cell. 2006 5 (5) : 379-89) . La kératine 14 est un composant du cytosquelette des kératinocytes de la lame basale de l'épiderme, qui disparait avec la différentiation de ces cellules. La fibrilline 1 est un composant des fibres élastiques particulièrement sensible au vieillissement photoinduit (Watson RE, Griffiths CE, Craven NM, Shuttleworth CA, Kielty CM. Fibrillin-rich microfibrils are reduced in photoaged skin. Distribution at the dermal-epidermal junction. J Invest Dermatol. 1999 112 (5) : 782-7) .
Protocole :
Des biopsies de peau humaine de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 48h (pl6 et K14) ou 72h (fibrilline 1) et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite congelées (fibrilline 1) ou fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine (pl6 et K14) . Des coupes de peau de 4 ym sont ensuite réalisées. Les marquages pl6, kératine 14 et fibrilline 1 sont effectués après un éventuel démasquage des sites spécifiques. Les immunomarquages sont réalisés à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris spécifique de pl6 (Abcam, Réf. Ab54210), d'un anticorps monoclonal de lapin spécifique de la kératine 14 (Abcam, Réf. Ab51054), d'un anticorps monoclonal de souris spécifique de la fibrilline 1 (Abcam, Réf. Ab3090), puis d'un anticorps secondaire anti-souris ou anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. A21202 et A21206) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue après marquage pl6 et K14 est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) . Une quantification de la longueur des fibres obtenues après marquage fibrilline 1 est réalisée, à l'aide du logiciel ImageJ.
Résultats :
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 5 ci-après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h permettent d'observer une diminution significative de l'expression de pl6 et une augmentation significative de l'expression de la kératine 14 comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 6 (absence d'ARN de petit poids moléculaire) et 7 (macération) à partir de plantes provenant d'Himalaya. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 72h permettent d'observer une augmentation significative de la longueur des fibres comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec l'extrait d' aneth obtenu selon l'exemple 7 (macération) à partir de plantes provenant d'Himalaya. Les résultats obtenus sur la quantification du marquage de pl6 sur peau ex vivo traitée pendant 48h avec différents extraits d' aneth à 1% (Tableau 5) sont plus particulièrement illustrés dans la Figure 6, dans laquelle : moyenne +/- sem ; n=3-6 ; ***: hautement significatif, **: très significatif, *: significatif, ~: presque significatif (p=0.055), ns : non significatif, avec le test t de Student.
Tableau 5 :
Longueur des
Expression Expression fibres de de pl6 (%) de K14 (%) fibrilline 1
(%)
Contrôle 100 100 100 Extrait d' aneth d'Himalaya
65 122 138 selon l'exemple 5
Extrait d' aneth d'Himalaya
83 113 162 selon l'exemple 6
Extrait d' aneth d'Himalaya
89 108 98 selon l'exemple 7
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) limite l'expression de pl6 et stimule davantage l'expression de K14 dans la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth d'Himalaya non enrichis en petits ARN (exemples 6 et 7) . L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) stimule également davantage l'expression de la fibrilline 1 en comparaison de la macération, non enrichis en petits ARN, d' aneth d'Himalaya (exemple 7) mais pas en comparaison de l'extrait ne contenant pas de petits ARN (exemple 6) . Ces protéines sont impliquées dans le vieillissement de la peau. L'extrait d' aneth obtenu selon l'invention permet donc de lutter efficacement contre les signes du vieillissement cutané. Exemple 18 : Evaluation des effets des extraits d' aneth de différentes origines (Chine non himalayenne, Egypte, Chine d'Himalaya) respectivement selon les exemples 3, 4 et 5 sur le vieillissement de la peau par l'étude de P16, de la kératine 14 et de la fibrilline 1
Le but de cette étude est de comparer les effets sur le vieillissement de la peau de trois extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3, 4 et 5 ayant des origines géographiques différentes. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant de Chine non himalayenne, le deuxième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Egypte et le troisième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Himalaya. Le but de cette étude est d'évaluer les effets de ces trois extraits d' aneth sur l'expression des protéines pl6, kératine 14 (K14) et fibrilline 1, impliquées dans le vieillissement cutané.
Protocole :
Des biopsies de peau humaine de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 48h (pl6 et K14) ou 72h (fibrilline 1) et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth de différentes origines géographiques, dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite congelées (fibrilline 1) ou fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine (pl6 et K14) . Des coupes de peau sont ensuite réalisées. Les marquages pl6, kératine 14 et fibrilline 1 sont effectués après un éventuel démasquage des sites spécifiques. Les immunomarquages sont réalisés à l'aide d'un anticorps monoclonal de souris spécifique de pl6 (Abcam, Réf. Ab54210), d'un anticorps monoclonal de lapin spécifique de la kératine 14 (Abcam, Réf. Ab51054), d'un anticorps monoclonal de souris spécifique de la fibrilline 1 (Abcam, Réf. Ab3090), puis d'un anticorps secondaire anti-souris ou anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. A21202 et A21206) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue après marquage du collagène I est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue après marquage pl6 et K14 est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) . Une quantification de la longueur des fibres obtenues après marquage fibrilline 1 est réalisée, à l'aide du logiciel ImageJ.
Résultats : Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 6 ci- après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h (pl6 et K14) ou 72h (fibrilline 1) permettent d'observer une diminution significative de l'expression de pl6, une augmentation significative de l'expression de la kératine 14 et une augmentation de la longueur des fibres comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3 et 4 à partir de plantes provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte. Les résultats obtenus sur la quantification du marquage de pl6 sur peau ex vivo traitée pendant 48h avec différents extraits d' aneth à 1% (Tableau 6) sont plus particulièrement illustrés dans la Figure 6.
Tableau 6 :
Figure imgf000049_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) limite l'expression de pl6 et stimule davantage l'expression de K14 et de fibrilline 1 dans la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth enrichi en petits ARN (exemples 3 et 4) provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte. Ces protéines sont impliquées dans le vieillissement de la peau. L'extrait d' aneth, et notamment d' aneth provenant d'Himalaya, obtenu selon l'invention permet donc de lutter efficacement contre les signes du vieillissement cutané. Exemple 19 : Evaluation des effets des extraits d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 sur la fonction barrière de la peau par l'étude de 1 ' E-cadhérine
Le but de cette étude est de comparer les effets sur la fonction barrière de la peau de trois extraits d' aneth d'Himalaya. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 5, le deuxième extrait ne contenant pas d'ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 6 et le dernier extrait obtenu après macération selon 1 ' exemple 7.
Le but de cette étude est d'évaluer les effets de ces trois extraits d' aneth sur l'expression d' E-cadhérine, protéine des jonctions serrées, impliquée dans l'adhésion cellulaire (Contreras RG, Shoshani L, Flores-Maldonado C, Lazaro A, Monroy AO, Roldan ML, Fiorentino R, Cereijido M. E-cadherin and tight junstions between epithelial cells of différent animal species. Eur J Physiol. 2002 444 :467-475) .
Protocole :
Des biopsies de peau humaine de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 48h et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de peau de 4 ym sont réalisées. Après démasquage, 1 ' immunomarquage est réalisé à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique de 1 ' E-cadhérine (Abcam, Réf. Abl5148), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. A21206) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) .
Résultats :
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 7 ci-après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h permettent d'observer une augmentation significative de l'expression d' E-cadhérine comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples
6 (absence d'ARN de petit poids moléculaire) et 7 (macération) à partir de plantes provenant d'Himalaya. Les résultats obtenus sur la quantification du marquage d' E-cadhérine sur peau ex vivo traitée pendant 48h avec différents extraits d' aneth à 1% (Tableau 7) sont plus particulièrement illustrés dans la Figure
7 dans laquelle : moyenne +/- sem ; n=3 ; *: significatif, ~: presque significatif (p=0.057), ns : non significatif, avec le test t de Student.
Tableau 7 :
Figure imgf000051_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) stimule l'expression d' E-cadhérine dans la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth d'Himalaya non enrichis en petits ARN (exemples 6 et 7) . Cette protéine étant impliquée dans l'adhésion cellulaire, l'extrait d' aneth obtenu selon l'invention permet de renforcer la barrière cutanée. Exemple 20 : Evaluation des effets des extraits d' aneth de différentes origines (Chine non himalayenne, Egypte, Chine d'Himalaya) respectivement selon les exemples 3, 4 et 5 sur la fonction barrière de la peau par l'étude de 1 ' E-cadhérine
Le but de cette étude est de comparer les effets sur la fonction barrière de la peau de trois extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3, 4 et 5 ayant des origines géographiques différentes. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant de Chine non himalayenne, le deuxième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Egypte et le troisième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Himalaya.
Le but de cette étude est d'évaluer les effets de ces trois extraits d' aneth sur l'expression d' E-cadhérine, protéine des jonctions serrées, impliquée dans l'adhésion cellulaire.
Protocole :
Des biopsies de peau humaine de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 48h et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth de différentes origines géographiques, dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de peau de 4 ym sont réalisées. Après démasquage, 1 ' immunomarquage est réalisé à l'aide d'un anticorps polyclonal de lapin spécifique de l'E- cadhérine (Abcam, Réf. Abl5148), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. A21206) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi- fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision).
Résultats :
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 8 ci- après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h permettent d'observer une augmentation significative de l'expression d' E-cadhérine comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3 et 4 à partir de plantes provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte. Les résultats obtenus sur la quantification du marquage d' E-cadhérine sur peau ex vivo traitée pendant 48h avec différents extraits d' aneth à 1% (Tableau 8) sont plus particulièrement illustrés dans la Figure 7,
Tableau 8 :
Figure imgf000053_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) stimule l'expression d' E-cadhérine dans la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth enrichi en petits ARN (exemples 3 et 4) provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte. Cette protéine étant impliquée dans l'adhésion cellulaire, l'extrait d' aneth obtenu selon l'invention permet de renforcer la barrière cutanée. Exemple 21 : Evaluation des effets des extraits d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 sur la fonction barrière de la peau par l'étude de la pénétration du Lucifer Yellow dans des épidermes reconstruits (RHE) stressés
Le but de cette étude est de comparer les effets de trois extraits d' aneth d'Himalaya sur le maintien de la fonction barrière d'une peau reconstruite stréssée par du SDS et des particules grossières de pollution (PM10) . Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 5, le deuxième extrait ne contenant pas d'ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 6 et le dernier extrait obtenu après macération selon l'exemple 7.
L'étude de la pénétration du colorant fluorescent, Lucifer Yellow, est un moyen de juger de l'état de la barrière cutanée. Protocole :
Des épidermes reconstruits de peau humaine (RHE) de 8 mm de diamètre sont maintenues en culture en présence d'un milieu spécifique sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 72h. Elles reçoivent 2 applications par jour pendant 48h d'un extrait d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume, puis 1 application de SDS à 0,15% pendant 3h, puis 1 application de PM10 à 100 yg/ml pendant 24h. Deux conditions contrôles sont réalisées à l'aide de PBS IX, suivi, ou non, de l'application de SDS et de PM10. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 150 μΐ déposée à la surface des RHE. Après les traitements le Lucifer Yellow est appliqué sur les RHE à 0,5 mg/ml pendant lh. Les RHE sont ensuite fixés dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de 4 ym d'épaisseur sont ensuite réalisées. Les RHE sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de la pénétration de la fluorescence obtenue après application du Lucifer Yellow est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) . Résultats :
L'application des stress SDS et PM10 induit une perméabilisation de la barrière cutanée qui laisse pénétrer le Lucifer Yellow.
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 9 ci- après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h avant stress SDS et PM10 permettent d'observer une pénétration du Lucifer Yellow moins profonde, comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX avant stress SDS et PM10 et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 6 (absence d'ARN de petit poids moléculaire) et 7 (macération) à partir de plantes provenant d'Himalaya. L'extrait d' aneth obtenu selon l'invention permet donc de renforcer la fonction barrière de la peau.
Tableau 9 :
Figure imgf000055_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) permet de limiter la pénétration du Lucifer Yellow, donc de renforcer la fonction barrière, dans des RHE stressés au SDS et PM10. Les extraits d' aneth d'Himalaya non enrichis en petits ARN (exemples 6 et 7) ne permettent pas ce renforcement.
Exemple 22 : Evaluation des effets des extraits d' aneth de différentes origines (Chine non himalayenne, Egypte, Chine d'Himalaya) respectivement selon les exemples 3, 4 et 5 sur la fonction barrière de la peau par l'étude de la pénétration du Lucifer Yellow dans des épidermes reconstruits (RHE) stressés
Le but de cette étude est de comparer, sur le maintien de la fonction barrière d'une peau reconstruite stréssée par du SDS et des particules grossières de pollution (PM10), les effets de trois extraits d' aneth obtenu selon les exemples 3, 4 et 5 ayant des origines géographiques différentes. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant de Chine non himalayenne, le deuxième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Egypte et le troisième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d' Himalaya .
L'étude de la pénétration du colorant fluorescent, Lucifer Yellow, est un moyen de juger de l'état de la barrière cutanée.
Protocole :
Des épidermes reconstruits de peau humaine (RHE) de 8 mm de diamètre sont maintenues en culture en présence d'un milieu spécifique sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 72h. Elles reçoivent 2 applications par jour pendant 48h d'un extrait d' aneth de différentes origines géographiques dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume, puis 1 application de SDS à 0,15% pendant 3h, puis 1 application de PM10 à 100 yg/ml pendant 24h. Deux conditions contrôles sont réalisées à l'aide de PBS IX, suivi, ou non, de l'application de SDS et de PM10. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 150 μΐ déposée à la surface des RHE. Après les traitements le Lucifer Yellow est appliqué sur les RHE à 0,5 mg/ml pendant lh. Les RHE sont ensuite fixés dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de 4 ym d'épaisseur sont ensuite réalisées. Les RHE sont alors examinées au microscope à Epi-fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de la pénétration de la fluorescence obtenue après application du Lucifer Yellow est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision).
Résultats :
L'application des stress SDS et PM10 induit une perméabilisation de la barrière cutanée qui laisse pénétrer le Lucifer Yellow.
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 10 ci- après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h avant stress SDS et PM10 permettent d'observer une pénétration du Lucifer Yellow moins profonde, comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX avant stress SDS et PM10 et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3 et 4 à partir de plantes provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte.
Tableau 10 :
Figure imgf000057_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) permet de limiter la pénétration du Lucifer Yellow, donc de renforcer la fonction barrière, dans des RHE stressés au SDS et PM10. Les extraits d' aneth enrichi en petits ARN (exemples 3 et 4) provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte ne permettent pas ou moins ce renforcement. L'extrait d' aneth, et notamment d' aneth provenant d'Himalaya, obtenu selon l'invention permet donc de renforcer la fonction barrière de la peau. Exemple 23 : Evaluation des effets des extraits d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 sur le cuir chevelu
Le but de cette étude est de comparer les effets de trois extraits d' aneth d'Himalaya sur le cuir chevelu. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 5, le deuxième extrait ne contenant pas d'ARN de petit poids moléculaire, obtenu selon l'exemple 6 et le dernier extrait obtenu après macération selon l'exemple 7.
Le but de cette étude est d'évaluer les effets de ces trois extraits d' aneth sur l'expression de la kératine 14 (K14) qui est exprimée dans l'épiderme et dans les cheveux. Cette protéine est remplacée par d'autres kératines avec la différentiation des cellules de l'épiderme. Dans les cheveux, elle est exprimée dans la gaine externe (Coulombe PA, Kopan R, Fuchs E. Expression of keratin K14 in the epidermis and hair follicle: insights into complex programs of differentiation . JCB 1989 109(5) : 2295-312) et est un marqueur de bonne santé du cheveux.
Protocole :
Des biopsies de cuir chevelu humain de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 48h et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth selon les exemples 5, 6 et 7 dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de peau de 4 ym sont ensuite réalisées. Le marquage de la kératine 14 est effectués après démasquage des sites spécifiques. L' immunomarquages est réalisé à l'aide d'un anticorps monoclonal de lapin spécifique de la kératine 14 (Abcam, Réf. Ab51054), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. A21206) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi- fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue après marquage K14 est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision).
Résultats :
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 11 ci- après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h permettent d'observer une augmentation significative de l'expression de la kératine 14 comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 6 (absence d'ARN de petit poids moléculaire) et 7 (macération) à partir de plantes provenant d'Himalaya.
Tableau 11 :
Figure imgf000059_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple 5) stimule davantage l'expression de K14 dans la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth d'Himalaya non enrichis en petits ARN (exemples 6 et 7) . La kératine 14 est impliquée dans la bonne santé des cheveux. L'extrait d' aneth obtenu selon l'invention permet donc de renforcer la structure du cheveu, d'améliorer leur apparence et de favoriser leur lissage et leur résistance.
Exemple 24 : Evaluation des effets des extraits d' aneth de différentes origines (Chine non himalayenne, Egypte, Chine d' Himalaya) respectivement selon les exemples 3, 4 et 5 sur le cuir chevelu
Le but de cette étude est de comparer les effets sur le cuir chevelu de trois extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3, 4 et 5 ayant des origines géographiques différentes. Le premier extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant de Chine non himalayenne, le deuxième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Egypte et le troisième extrait enrichi en ARN de petit poids moléculaire, obtenu à partir d' aneth provenant d'Himalaya.
Le but de cette étude est d'évaluer les effets de ces trois extraits d' aneth sur l'expression de la kératine 14 (K14) qui est exprimée dans l'épiderme et dans les cheveux. Protocole :
Des biopsies de cuir chevelu humain de 6 mm de diamètre sont maintenues en culture ex vivo en présence d'un milieu spécifique (DMEM 1 g/L, HAM' S F12, SVF et antibiotiques) sur des inserts. Les biopsies sont cultivées pendant 48h et reçoivent 2 applications par jour d'un extrait d' aneth de différentes origines géographiques, dilué au l/100eme dans du PBS, soit à la concentration finale de 1% volume/volume. La condition contrôle est réalisée à l'aide de PBS IX. Les applications sont réalisées sous forme d'une goutte de 10 μΐ déposée à la surface de la biopsie. Les biopsies sont ensuite fixées dans le formaldéhyde puis incluses dans la paraffine. Des coupes de peau de 4 ym sont ensuite réalisées. Le marquage de la kératine 14 est effectués après démasquage des sites spécifiques. L' immunomarquages est réalisé à l'aide d'un anticorps monoclonal de lapin spécifique de la kératine 14 (Abcam, Réf. Ab51054), puis d'un anticorps secondaire anti-lapin couplé à un fluorochrome (Invitrogen, Réf. A21206) . Les biopsies sont alors examinées au microscope à Epi- fluorescence (Zeiss Axiovert 200M) . Une quantification de l'intensité de la fluorescence obtenue après marquage K14 est réalisée, à l'aide du logiciel Volocity® (Improvision) .
Résultats :
Les résultats obtenus sont compilés dans le Tableau 12 ci- après. Les traitements avec l'extrait d' aneth enrichi en petits ARN, obtenu selon l'exemple 5 à partir d' aneth provenant d'Himalaya à 1% pendant 48h permettent d'observer une augmentation significative de l'expression de la kératine 14 comparé à la condition contrôle traitée avec du PBS IX et comparé aux traitements avec les extraits d' aneth obtenus selon les exemples 3 et 4 à partir de plantes provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte.
Tableau 12 :
Figure imgf000061_0001
Conclusion :
L'extrait d' aneth d'Himalaya enrichi en petits ARN (exemple
5) stimule davantage l'expression de K14 dans la peau ex vivo humaine en comparaison des extraits d' aneth enrichi en petits ARN (exemples 3 et 4) provenant de Chine non himalayenne et d'Egypte. La kératine 14 est impliquée dans la bonne santé des cheveux. L'extrait d' aneth, et notamment provenant d' aneth d'Himalaya, obtenu selon l'invention permet donc de renforcer la structure du cheveu, d'améliorer leur apparence et de favoriser leur lissage et leur résistance.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition cosmétique caractérisée en ce qu'elle comprend, en tant qu'agent actif, dans un milieu physiologiquement acceptable, une quantité efficace d'un extrait aqueux des parties aériennes d' aneth (Anethum graveolens) enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides obtenu à partir d'une matière végétale suivant les étapes suivantes selon lesquelles :
a) on met en présence des parties aériennes d' Anethum graveolens avec de l'eau ;
b) on ajoute de l'acide éthylène diamine tétraacétique
(EDTA) tétrasodique dans le mélange obtenu en a) à un pH compris entre 10,5 et 11 ;
c) on ajuste ensuite le pH du mélange obtenu en b) à une valeur comprise entre 6 et 8 ;
d) on purifie le mélange obtenu en c) de manière à éliminer la matière végétale solide résiduelle et obtenir un extrait brut aqueux purifié ; et
e) on contrôle le pH et on le réajuste si nécessaire à une valeur comprise entre 6 et 8, préférentiellement entre 6 et 6,5.
2. Composition cosmétique selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'extrait aqueux de partie aérienne d' aneth enrichi en petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides et dépourvu d'ADN, comprend en poids du poids total de l'extrait, 10 à 30 g/kg d'extrait de poids sec, 2 à 10 g/kg de fragments protéiques, 2 à 10 g/kg de sucres, 0,2 à 3 g/kg d'acides aminés, 100 à 2000 mg/kg de composés phénoliques et 10 à 100 mg/kg d'ARN de petit poids moléculaire d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides et ne comprend pas d'ADN.
3. Composition cosmétique selon la revendication 2, caractérisée en ce que l'extrait est dilué dans un solvant et comprend en poids du poids total de l'extrait, 5-15 g/kg d'extrait sec, de 50 à 1000 mg/kg de polyphénols 0,5-10 g/kg de fragments protéiques, 0,5-10 g/kg de sucres, de 0,1 à 1 g/kg d'acides aminés et 10-100 mg/kg de petits ARN d'une longueur d'au maximum 150 nucléotides.
4. Composition cosmétique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que l'extrait est obtenu à partir d' aneth d' Himalaya .
5. Composition cosmétique selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que l'extrait est présent à une concentration comprise entre 0,1 et 5% en poids du poids total de la composition.
6. Composition cosmétique selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'extrait est présent à une concentration comprise entre 0,5 et 2,5% en poids du poids total de la composition.
7. Composition cosmétique selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle est formulée pour être administrée par voie orale ou être appliquée topiquement sur la peau .
8. Utilisation cosmétique d'une composition selon l'une des revendications 1 à 7 pour le soin de la peau, du cuir chevelu et des phanères.
9. Utilisation cosmétique selon la revendication 8, pour améliorer l'hydratation de la peau et renforcer la fonction barrière.
10. Utilisation cosmétique selon la revendication 8, pour lutter contre les signes du vieillissement cutané et améliorer la fermeté et l'élasticité de la peau.
11. Utilisation cosmétique selon la revendication 8, pour améliorer la santé du cheveu.
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