CN117503623A - 一种micro RNA在制备皮肤抗衰产品中的应用 - Google Patents

一种micro RNA在制备皮肤抗衰产品中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种micro RNA在制备皮肤抗衰产品中的应用，所述micro RNA为MIR146A，本发明通过皮肤成纤维细胞ECM蛋白检测实验验证了MIR146A能通过上调细胞Col1a1、Col3a1、Col4a1、Col7a1、Eln和Lmna基因表达，从而提高胶原蛋白分泌起抗衰、抗皱功效，经检测，MIR146A对HaCaT细胞无细胞毒性，进而为抗衰产品功效的提升提供了新的选择。

Description

一种micro RNA在制备皮肤抗衰产品中的应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种micro RNA在制备皮肤抗衰产品中的应用。
背景技术
皮肤衰老是指皮肤功能衰老性损伤，使皮肤对机体的防护能力、调节能力等减退，皮肤不能适应内外环境的变化，出现颜色、色泽、形态、质感等外观整体状况的改变。
随着年龄的增长，人体的皮肤逐渐进入衰老状态，主要和以下因素有关：①角质层的通透性增加，皮肤的屏障功能降低，导致角质层内水分含量减少，皮肤处于缺水状态；②皮肤附属器官的功能减退，如汗腺和皮脂腺的分泌功能随着年龄的增加而逐渐减弱，导致分泌的汗液和皮脂量减少，皮肤长期得不到润养而干燥；③皮肤的新陈代谢速度减慢，使得真皮内的弹力纤维和胶原纤维功能降低，使得皮肤张力和弹力的调节作用减弱，皮肤易出皱纹；④皮肤吸收不到充分的营养，使皮下脂肪储存不断减少，导致真皮网状层下部失去支撑，造成皮肤松弛。
皮肤抗衰一直都是消费者关注的重点，随着消费者科学护肤认知提升，对皮肤抗衰需求不断提高，对抗衰产品的要求也随之提升。
发明内容
本发明的旨在提供一种micro RNA在制备皮肤抗衰产品中的应用，为抗衰产品功效的提升提供了新的选择。
本发明为实现上述目的采用的技术方案为：
一种micro RNA在制备皮肤抗衰产品中的应用，所述micro RNA为MIR146A。
优选地，所述皮肤抗衰产品中的MIR146A通过上调细胞Col1a1、Col3a1、Col4a1、Col7a1、Eln和Lmna基因表达，从而提高胶原蛋白分泌。
优选地，所述皮肤抗衰产品包括皮肤抗皱产品。
优选地，所述产品包括药物、医疗器械、护肤品或者化妆品。
本发明的有益效果在于：
本发明创新性地发现了MIR146A在制备皮肤抗衰产品中的应用，并通过皮肤成纤维细胞ECM蛋白检测实验验证了MIR146A能通过上调细胞Col1a1、Col3a1、Col4a1、Col7a1、Eln和Lmna基因表达，从而提高胶原蛋白分泌起抗衰、抗皱功效，经检测，MIR146A对HaCaT细胞无细胞毒性，进而为抗衰产品功效的提升提供了新的选择。
附图说明
图1为本发明试验例1中阳性组抗皱功效相关基因检测结果。
图2为本发明试验例1中样品组抗皱功效相关基因检测结果。
图3为本发明试验例2中不同组别的细胞存活率。
图4为本发明试验例2中阴性对照组，阳性对照组和样品组细胞状态图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合试验例并对照附图对本发明作进一步详细说明。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
本发明提供的是一种micro RNA在制备皮肤抗衰产品中的应用，所述micro RNA为MIR146A(Gene ID：406938)。
此micro RNA为葡萄籽中提取，制备过程：
1)匀浆处理
取50～100mg葡萄籽于液氮中研磨，保持研钵中有液氮(如果没有液氮也可以直接加1mL的裂解液PL后匀浆。组织样品容积不能超过PL容积的10％)。
2)转移样品至1.5mLRNase free离心管中，加入1mL的Trizol颠倒混匀，在65℃条件下孵育10分钟(期间颠倒混匀几次)以使核蛋白体完全分解。
3)室温条件下12,000rpm离心5分钟，取上清转入一个新的2mL RNase free离心管中。
4)加入等体积事先预冷的异丙醇，颠倒混匀，4℃12,000rpm离心5分钟。
5)去除上清，加入100μL RNase-free H2O重新溶解沉淀。
6)加入200μL氯仿，涡旋混匀，放置2-3分钟。
7)于4℃12,000rpm离心10分钟，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于水相中。把水相(约700μL)转移到新的1.5mL RNase free离心管中，进行下一步操作。
8)加入0.6倍体积70％wt乙醇，颠倒混匀。
9)于4℃13,000rpm离心5分钟。
10)弃上清将沉淀晾干直至变透明。
11)用50μL DEPC H2O溶解沉淀。
12)测定OD值确定总RNA浓度。
13)用过滤杂交方法亲和纯化总RNA中的micro RNA-146a(MIR146A)。
该制备过程中所用试剂均为市售试剂，具体操作为常规操作，也可根据实际情况进行调整，或采用其他公知方法来制备。
试验例1皮肤成纤维细胞ECM蛋白代谢检测
皮肤结构中，I型胶原是维持真皮细胞外基质(ECM)的主要因素，其合成减少是皮肤老化、真皮变薄萎缩、皱纹较深的特征；III型胶原蛋白(type III collagen，COL3A1基因)与I型胶原蛋白一起主要存在于皮肤真皮层之间，维持人体皮肤正常组织结构；IV型胶原蛋白(type IV collagen，COL4A1基因)在表皮与真皮的连接层，形成一张致密的网，收集锚定的多肽，保证了皮肤基底功能；VII型胶原蛋白(type VII collagen，COL7A1基因)形成表皮真皮连接层的锚定纤维，连接真皮和表皮真皮连接层(DEJ)；层粘连蛋白(laminin，Lmna基因)是一类具有多种生物功能的非胶原糖白，在基底膜的构建及表皮基底层细胞的黏附、生长、迁移、分化中扮演着至关重要的角色；弹性蛋白(elastin，Eln基因)占真皮中总蛋白质的2％，有助于减缓和减少皮肤下垂，弹性蛋白的损失或缺乏会影响皮肤外观；而胶原的分解通常由基质金属蛋白酶(MMPs)控制，其中基质金属蛋白酶-1(MMP-1)被认为是ECM恶化的重要启动因子。
本发明将不同受试物添加至人胚皮肤成纤维细胞培养基中与细胞共培养24小时，通过实时荧光PCR技术来检测受试物对人胚皮肤成纤维细胞I型胶原基因(Col1α1)、III型胶原基因(Col3α1)、IV型胶原基因(Col4α1)、VII型胶原基因(Col7α1)、层黏连蛋白(Lmna)、弹性蛋白(Eln)和基质金属蛋白酶-1基因(Mmp-1)表达的影响，分析受试物能否通过参与调控上述基因的表达达到抗皱功效作用。检测由广东赤萌医疗科技有限公司进行并出具检测报告，检测依据《CM-SOP_JS-098-C0皮肤成纤维细胞胶原代谢检测标准操作规程》。
一、实验试剂和器材
1.1实验细胞
人胚皮肤成纤维(ESF)细胞：购自中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。
1.2实验试剂
胎牛血清(EXCELL)；1×DMEM培养基(GIBCO)；DMSO(天津大茂)；总RNA提取试剂盒(TIANGEN)；II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(Vazyme)；ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)；Lipofectamine 3000Transfection Kit(Invitrogen)；Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Gibco)。
1.3实验器材
仪器名称 型号 制造商
超净工作台 SW-CJ-2FD 苏州安泰空气技术有限公司
二氧化碳培养箱 MCO-18AIC 松下健康医疗器械
冰箱 BCD-201E/A 容声
倒置荧光显微镜 TI-S 尼康
离心机 L600 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司
Bio-Rad荧光定量PCR CFX Connect TM Bio-Rad
Bio-Rad梯度PCR仪 T100 Bio-Rad
细胞计数仪 / 尼康
超微量分光光度计 K5500 凯奥
台式高速离心机 5424R Eppendorf
便携式小离心机 Mini-4k/6k 珠海黑马医学仪器
二、实验分组和样品制备
2.1实验分组
2.2样品制备
2.2.1micro RNA储存液(3μM)：micro RNA-146a(5nmol)加入适量RNase-freeddH2O混合均匀制备成micro RNA-146a(3μM)。
2.2.2功效实验转染混合物制备：将制备的A液、B液混合。
三、实验步骤
3.1T75瓶中收集汇合度达80％～90％的ESF细胞悬液，计数，调整细胞密度接种于6孔板，培养24h。
3.2弃去孔中培养液，按照实验分组列表分别加入不同浓度的工作液，继续培养24h。
3.3弃去孔中培养液，使用胰酶消化处理，将细胞收集置于-80℃暂存。
3.4参考培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒说明书提取RNA，RNA浓度检测结果见下表：
分组 A260/A230比值 A260/A280比值 浓度(ng/μL)
空白 0.18 2.17 182.56
PC3 0.47 2.15 196.08
PC5 0.89 2.13 205.04
PC6 0.28 2.15 184
NC 0.69 2.12 61.12
S 0.15 2.19 42.88
3.5参考II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA。
3.6利用荧光定量PCR法对细胞内GAPDH、COL1a1、Lmna、Eln和Mmp-1基因表达进行检测。以GAPDH表达量作为内参用于消除不同实验组之间取样的差异。之后以各基因的阴性对照组为基准进行归一化处理。最终结果大于1，则相应基因的表达水平增加；最终结果小于1，则相应基因的表达水平减少。实验数据用IBM SPSS Statistics23软件进行处理，使用GraphPad Prism 7.00软件进行作图，对于数值变量，采用t检验进行组间比较，P<0.05认为差异性显著。
下机结果及相对表达量计算见下表：
注：“*”、“**”分别表示相对表达量与空白组、NC组有显著性差异，且具有统计学意义(P<0.05)。
结合图1，PC组胶原相关编码基因均上调，Mmp-1基因下调，说明PC组正常工作，实验系统无异常。
PC3组除Lmna、Eln基因与空白组对比无显著上调，其余Col1α1、Col3α1、Col4α1、Col7α1基因表达与空白组对比均显著上调，分别为空白组的138.8％、120.8％、186.4％、262.6％。Mmp-1基因表达与空白组对比有显著下调，为空白组的58.8％，说明PC3组能通过上调细胞Col1α1、Col3α1、Col4α1、Col7α1、和下调Mmp-1基因表达，从而提高胶原蛋白分泌和抑制ECM中胶原的分解起抗皱功效作用。
PC5组细胞Col3α1、Col7α1、Lmna、Eln基因与空白组对比均无显著上调，Col1α1、Col4α1基因表达与空白组对比均显著上调，分别约为空白组的146.2％、215％。Mmp-1基因表达与空白组对比有显著下调，约为空白组的64.7％。说明PC5组样品能通过上调细胞Col1α1、Col4α1和下调Mmp-1基因表达，从而提高胶原蛋白分泌和抑制ECM中胶原的分解起抗皱功效作用。
PC6组细胞Col1α1、Col3α1、Col4α1、Col7α1、Lmna、Eln基因表达与空白组对比无明显上调，Mmp-1基因与空白组对比无明显下调，说明PC6组样品不能通过上调细胞Col1α1、Col3α1、Col4α1、Col7α1、Eln和Lmna基因表达和下调Mmp-1基因表达起抗皱功效作用。
结合图2，NC(空转染)组Col1α1、Col3α1、Col4α1、Col7α1、Eln和Lmna基因表达与空白组对比无显著上调，Mmp-1基因与空白组对比无显著下调；对于37.5nM micro RNA样品Col1α1、Col3α1、Col4α1、Col7α1、Eln和Lmna基因表达与NC组对比均显著上调，分别为NC组的155％、190％、158％、166％、385％和142％；Mmp-1基因与NC组对比无显著下调，说明micro RNA在转染浓度为37.5nM条件下能通过上调细胞Col1α1、Col3α1、Col4α1、Col7α1、Eln和Lmna基因表达，从而提高胶原蛋白分泌起抗皱功效作用。
试验例2细胞毒性检测
检测由广东赤萌医疗科技有限公司进行并出具检测报告，检测依据《GBT16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性》。
一、试验原理
MTT法是一种显色细胞毒性测试方法，它定量了细胞接触浸提液或溶液后的细胞活力和细胞增殖情况。代谢活跃的细胞通过活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶的作用，将黄色四唑盐MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中。黄色到紫色的变化可以通过光谱光度测量进行定量分析。样品中活细胞数量的变化和细胞活性的变化都会影响甲瓒的形成。活细胞数量的减少以及细胞代谢活动的降低或抑制，会减少蓝紫色甲瓒的形成。
二、试验目的
通过MTT检测样品接触细胞后细胞活性，测试对细胞增长抑制的影响，评价受试物对细胞的体外毒性作用，从而考察其作为人体接触材料的安全性。
三、试验试剂和设备
3.1试验细胞
人永生化角质形成细胞(HaCaT)：购自中国科学院昆明细胞库。
3.2试验试剂
3.3试验设备
序号 仪器名称 型号 制造商
1 超净工作台 SW-CJ-2FD 苏州安泰空气技术有限公司
2 二氧化碳培养箱 MCO-18AIC 松下健康医疗器械
3 冰箱 BCD-201E/A 容声
4 倒置荧光显微镜 TI-S 尼康
5 离心机 L600 湖南湘仪试验室仪器开发有限公司
6 细胞计数仪 / 尼康
7 酶标仪 Multiskan FC Thermo
8 细胞计数仪 S2 Countstar
四、样品制备
4.1试验分组
4.2样品液制备
将样品使用DMEM稀释至所需检测浓度，共制备0.5mL的样品工作液。
五、试验步骤
(1)以1E4/孔种板，96孔板加入HaCaT细胞培养；
(2)按试验分组加入样品继续培养；
(3)取出96孔板拍照记录后，加MTT，避光培养；
(4)吸弃上清，加DMSO溶解结晶，摇床震荡；
(5)酶标仪上以490nm测定吸光度。
六、结果判定方法
6.1细胞存活率计算
存活率(％)＝OD490e/OD490b×100％
式中：OD490e—试验样品组、阳性组吸光度；OD490 b—空白对照组吸光度。
6.2细胞毒性判断
样品组细胞存活率下降到＜空白的70％，则具有细胞毒性。
6.3细胞毒性形态学定性分级
细胞毒性细胞形态学定性分析，参照下表，对空白对照组、阳性对照组及样品液组细胞状态进行定性分级分析，细胞状态宜与存活率保持一致，否则宜重复试验。
6.4试验接受标准
空白对照组OD490平均值≥0.2，且左右两侧空白对照组CV值整体小于15％，则实验符合接受标准。
七、统计分析
实验结果用平均值和CV值表示，以2列空白对照组吸光度平均值为对照，计算每个样品细胞存活率，数据用IBM SPSS Statistics 23软件进行处理，对空白对照组和样品组间细胞存活率进行独立样本T检验，P<0.05认为差异性显著。
八、试验结果
8.1样品细胞存活率
(1)样品细胞存活率统计结果
九、试验讨论和结论
本次实验中所有空白对照组OD490平均值均≥0.2，且左右两列空白对照组CV值整体小于15％，实验符合接受标准。
结合图3，对于MIR146A样品，其300、78.125、15.625、3.125、0.625、0.125、0.025、0.005、0.001nM浓度条件下的细胞存活率分别为108.95％、103.96％、110.98％、107.31％、110.61％、106.97％、111.33％、106.25％、108.59％，其细胞存活率均≥70％，表明MIR146A样品无细胞毒性。
结合图4，观察细胞状态，与空白对照组细胞状态对比，阳性对照组细胞层完全破坏，细胞毒性形态学定级为4级；MIR146A样品组的细胞形态与空白对照组相比，均无细胞溶解，无细胞增殖下降情况，细胞形态学定级为0级。以上各组细胞状态与相应的细胞存活率保持一致。
因此，本发明的MIR146A对HaCaT细胞无细胞毒性。
显然，本发明的上述试验例仅仅是为更清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方法予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (4)

1.一种micro RNA在制备皮肤抗衰产品中的应用，所述micro RNA为MIR146A。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述皮肤抗衰产品中的MIR146A通过上调细胞Col1a1、Col3a1、Col4a1、Col7a1、Eln和Lmna基因表达，从而提高胶原蛋白分泌。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述皮肤抗衰产品包括皮肤抗皱产品。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括药物、医疗器械、护肤品或者化妆品。
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