KR20130068852A - 둥근마 유래의 뮤신 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 둥근마의 뮤신을 유효성분으로 포함하는 화장용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 연속 공정 제조방법을 통하여 둥근마로부터 당단백체만을 분리한 천연 식물 유래의 뮤신을 제조하는 방법과 상기 방법으로 제조된 둥근마 뮤신을 함유하는 화장용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 화장용 조성물의 수용액 내에서의 둥근마는 불투명한 점액 콜로이드를 형성, 이를 최적의 제조 수율과 제조공정으로 단일분리한 뮤신을 유효성분으로 함유하고 있으며, 둥근마 유래의 뮤신은 항산화효과, 염증 억제 효과, 자극완화 효과, 잔주름 개선 효과, 아토피 개선효과가 우수한 화장용 조성물로서 제조 및 응용될 수 있다.

Description

둥근마 유래의 뮤신 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 {Method for Preparing Mucin from Dioscorea opposita and Cosmetic Composition Containing the Same}

본 발명은 둥근마의 뮤신을 유효성분으로 포함하는 화장용 조성물에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 특정 연속 공정 제조방법을 통하여 둥근마로부터 당단백체만을 분리한 천연 식물 유래의 뮤신을 제조하는 방법과 상기 방법으로 제조된 둥근마 뮤신을 함유하는 화장용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리, 화학적 변화가 일어나며 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo aging)로 구분되며 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리 라디칼이 활성화되어 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화 될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 즉, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부노화 현상이 생겨나는 것이다. 특히 단백질의 산화는 피부의 결합조직인 콜라겐(collagen), 히알루론산(hyaluronic acid), 엘라스틴(elastin), 프로테오글리칸(proteoglycan) 및 피브로넥틴(fibronectin) 등이 절단되어 심한 과다 염증반응과 피부의 탄력에 지장을 주게 되고, 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암의 유발, 면역기능 저하의 사태에 이르게 된다. 그러므로 신체의 대사 과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상된 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생화시켜서 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다.

노화에는 프리라디칼 뿐만 아니라 MMP라는 효소가 관여하는데 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속 단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성되며, 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

또한, 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었기 때문에 세포 내 자연노화와 광 노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현 양 및 활성을 조절하고자 노력하였다.

종래에는 한국등록특허 제10-0684434호의 항산화, 지질과산화 억제에 따른 항노화, 항염증 및 거담 활성을 갖는 단풍마 추출물을 함유하는 조성물, 한국등록특허 제10-0873611호의 둥근마의 주아 비대제 조성물 및 그것을 이용한 둥근마의 주아 비대 재배방법, 한국등록특허 제10-0400837호의 둥근마의 주아형성제 및 그 주아형성제를 이용한 둥근마의 주아형성방법, 한국등록특허 제10-0528663호 디오신을 포함하는 고지혈증 또는 동맥경화증의 치료 또는 예방용 조성물, 한국등록특허 제10-0894636호의 둥근마추출액을 함유한 음료의 제조방법 및 한국등록특허 제10-0776347호에 따른 신경세포 보호 활성이 있는 둥근마 추출물을 포함하는 뇌질환 예방 및 치료용 조성물 등이 있으나, 종래의 선행기술 어디에도 둥근마로부터 분리한 뮤신 및 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물에 대한 개시가 없었다.

이에, 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물에 있어서 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 둥근마로부터 추출물을 연구하고 이들로부터 뮤신을 단일분리하여, 항산화 효과, 콜라겐 합성효과, 피부 잔주름 완화효과, 피부자극완화 효과, 보습효과를 측정하고, 우수한 것을 확인하고 화장용 조성물로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 보습, 항산화, 주름개선, 아토피 개선효과가 뛰어난 둥근마 유래의 뮤신의 제조방법 및 이를 함유하는 화장용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 둥근마를 수용액에서 침지시키는 단계; (b) 침지시킨 둥근마를 교반시킨 다음, 여과하여 불순물을 제거하는 단계; (c) 고속원심분리를 통해 사포닌 및 전분질을 제거하는 단계; (d) 유기용매를 첨가하여 불순물을 제외한 뮤신만을 침전 또는 부유시키는 단계; 및 (e) 상기 침전 또는 부유된 뮤신을 수득하는 단계를 포함하는 둥근마 유래의 뮤신의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기의 제조방법으로 제조되고, 분자량이 100,000~550,000Da인 둥근마 유래의 뮤신을 유효성분으로 함유하는 화장용 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장용 조성물의 수용액 내에서의 둥근마는 불투명한 점액 콜로이드를 형성, 이를 최적의 제조 수율과 제조공정으로 단일분리한 뮤신을 유효성분으로 함유하고 있으며, 둥근마 유래의 뮤신은 항산화효과, 염증 억제 효과, 자극완화 효과, 잔주름 개선 효과, 아토피 개선효과가 우수한 화장용 조성물로서 제조 및 응용될 수 있다.

도 1은 뮤신의 구성 당 분석 크로마토그래피에 관한 것이다.
도 2은 뮤신의 구성 아미노산 분석 크로마토그래피에 관한 것이다.
도 3은 뮤신의 분자량 측정 크로마토그래피에 관한 것이다.
도 4는 뮤신의 FT-IR 스펙트럼에 관한 것이다.

달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 (a) 둥근마를 수용액에서 침지시키는 단계; (b) 침지시킨 둥근마를 교반시킨 다음, 여과하여 불순물을 제거하는 단계; (c) 고속원심분리를 통해 사포닌 및 전분질을 제거하는 단계; (d) 유기용매를 첨가하여 불순물을 제외한 뮤신만을 침전 또는 부유시키는 단계; 및 (e) 상기 침전 또는 부유된 뮤신을 수득하는 단계를 포함하는 둥근마 유래의 뮤신의 제조방법에 관한 것이다.

뮤신(Mucin)은 주로 동물계에 분포하는 점액질로 당단백체의 일종으로 구조는 커다란 코어 단백질(core protein)의 펩티드에 당쇄가 연결되어 있는 형태이며(David J. et al., Biochem. J, 316, 967-975, 1996), 그 pH에 따라 acid mucin, neutral mucin 등으로 분류되고, 인간의 침, 위점막 분비액, 달팽이 점액질 등이 뮤신으로 불리운다.

본 발명에서 뮤신의 원료로 사용된 둥근마(Dioscorea opposita Thunb)는 마과(Dioscoreaceae)에 속하는 여러해살이 덩굴식물로 중국 원산이다. 산과 들에서 자라며, 덩이뿌리는 크고 편평한 공 모양이고 줄기는 긴 덩굴로 가지가 갈라진다. 잎은 어긋나고 잎자루는 길며 삼각형 또는 심장형으로 길이와 나비가 각각 4~13㎝이다. 잎 가장자리가 밋밋하고 갈라지지 않으며 털이 없고 주아(珠芽)가 잎겨드랑이에서 생긴다. 주아는 지름 2㎝ 정도이며 겉은 노란빛을 띤 갈색이다. 꽃은 단성화로 6~7월에 핀다. 수꽃 이삭은 잎겨드랑이에 1~3개씩 달리고 꽃대가 짧으며 작은 꽃대는 없고 꽃이 다소 많이 달린다. 화피갈래조각은 6개로 줄 모양 바소꼴이고 흰색이며 수술은 6개이다. 암꽃 이삭은 밑으로 처지며 작은 꽃대가 없는 꽃이 드문드문 달린다. 덩이뿌리를 식용하거나 강장제 또는 지사제로 사용한다. 한국 각지에서 재배한다.

본 발명의 일 양태에서 침지 공정을 통해 수용액에서 둥근마는 점액성 콜로이드를 구성하게 되는데, 본 발명에 의한 최적의 침지공정은 0.5~30%의 비율로 둥근마의 중량을 물에 가하여 0.5~5시간을 팽윤시켰다. 상기 침지 공정을 통해 형성된 점액 콜로이드는 뮤신의 용출량 증대를 위한 교반 공정을 거치게 되는데, 교반 공정은 교반 막대, 헤이돈 믹서를 이용하여 전 분산하며, glass bead, 해사 등의 조분리물질을 투여하여 입자 충돌을 이용, 용출량 증대를 극대화할 수 있다. 상기 교반 공정을 통해 용출량이 극대화된 점액성 콜로이드는 원물 및 불순물을 제거를 위한 필터공정을 거치게 되는데, 본 발명에 의한 필터공정은 표준체 및 세라믹 필터를 이용하였다. 필터공정을 통해 회수된 점액성 콜로이드 액은 피부 자극성 스테로이드 사포닌(디오신 및 디오스제닌) 및 둥근마에 28% 이상 함유된 전분질을 배제시키는 고속 원심공정을 거치게 되는데 본 발명에 의한 최적의 고속 원심공정은 2,000~9,000rpm, 5~25℃의 조건으로 공정을 진행하였다. 고속 원심공정을 거친 후 상등 점액성 콜로이드 액에 에탄올 등의 유기용매를 이용하여 침전 또는 부유시키는 용해도 전환시켰다. 용해도 전환공정을 거친 뮤신은 진공농축법으로 농축하여 사용할 수 있으며, 스프레이 드라이어, 동결건조, 드라이 오븐 등을 이용하여 분말상의 순수한 뮤신을 수득하였다.

본 발명의 다른 양태에서 수득한 뮤신의 단백질 함량, 당 함량, 구성 당 성분, 구성 아미노산 성분, 분자량 측정, FT-IR을 이용한 뮤신 동정을 위한 분석을 하였다. 분석한 결과, 둥근마로부터 분리한 뮤신의 단백질 함량은 71.03%로 확인되었고, 당 함량은 28.14%로 확인되었다. 또한, 뮤신의 구성성분의 당을 확인한 결과, 주로 만노오스(Mannose), 글루코오스(Glucose)였으며, 갈락토오스(Galactose), 아라비노오스(Arabinose), 푸코오스(Fucose), 람노오스(Rhamnose)도 소량 포함되어있는 것으로 확인되었다. 뮤신의 성분 아미노산을 확인한 결과, 뮤신의 아미노산은 주로 Asp, Glu, Arg로 이루어져 있으며, 총 17종으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었고, 뮤신의 분자량 분포를 확인한 결과, 100,000~550,000Da으로 밝혀졌으며, 분자량 분포에 의한 수평균 분자량은 약 320,000Da인 것을 확인할 수 있었다.

본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 침지는 5~80℃에서 0.5~5시간 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (a)단계의 수용액은 물, 에탄올, 메탄올 및 다가 알코올로 구성된 군에서 선택된 용액인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계에서 교반은 50~7,000rpm, 5~80℃에서 0.5~5시간 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (b)단계의 불순물은 10~300mesh로 이루어진 표준체를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c)단계의 원심분리는 1,000~15,000g에서 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (e)단계의 상기 침전 또는 부유된 뮤신을 수득하기 위하여 분무 또는 동결건조를 -120~-40℃에서 25~70시간 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서 둥근마를 증류수에 가하여 1시간 침지를 시킨 후, 조분리 물질인 글라스 비드를 넣고 프로펠러 믹서를 이용하여 전분산 하였다. 그 후 80 mesh 표준체를 이용하여 찌꺼기 및 불순물을 걸러내고, 남은 점액성 콜로이드 수용액을 원심분리기를 이용하여 고속 원심분리하여 전분질 및 스테로이드 사포닌을 침전제거 하였다. 상기의 방법에 의해 수득한 상등 점액성 콜로이드 수용액에 4배(v/v)의 에탄올을 넣고 0℃ 저온에서 12시간 침적시킨 후 상등 혹은 침전된 뮤신을 회수하고 동결건조를 실시하여, 투입 둥근마 대비 2%중량의 뮤신 파우더를 수득하였다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기의 제조방법으로 제조되고, 분자량이 100,000~550,000Da인 둥근마 유래의 뮤신을 유효성분으로 함유하는 화장용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 둥근마 유래의 뮤신을 구성하는 단백질의 함량은 65~80%인 것을 특징으로 할 수 있으며, 둥근마 유래의 뮤신을 구성하는 당의 함량은 20~35%인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에서 뮤신에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼 소거시험과 활성산소소거시험을 실시하였다. 결과적으로, 뮤신은 강력한 합성 항산화제인 BHT와 거의 유사한 항산화 능력을 나타내었으며, 자유라디칼 소거율 50%의 농도는 132ppm, 활성산소소거율 50% 농도는 143ppm으로 미량의 농도에서 항산화 효능이 매우 우수하였고, 달팽이 유래 동물성 뮤신과 비교한 결과, 둥근마 유래의 뮤신의 항산화 효능이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 뮤신의 보습효과는 수득한 뮤신의 1% 수용액은 현재 보습효과가 뛰어나다고 알려진 히아루론산의 1% 수용액 및 달팽이 유래의 동물성 뮤신과 비교하여 보습효과가 더 우수함을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서 뮤신의 피부주름 억제 및 개선 효과를 검정하기 위하여, 엘라스테이즈 활성저해시험을 실시한 결과, 수득한 뮤신의 엘라스테이즈 활성저해율은 1.50㎎/㎖로 엘라스타아제 특이 저해제인 PMSF 0.07㎎/㎖ 보다는 낮았지만, 현재 주름개선 기능성 원료로 효과가 뛰어난 레티놀(Retinol)과 비슷할 정도로 주름개선효과가 우수하였고, 달팽이 유래의 동물성 뮤신과 비교한 경우, 뛰어난 주름개선 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다. 뮤신의 피부 주름개선 효과를 검정하기 위하여 콜라겐 합성능을 측정한 결과, 수득한 뮤신은 콜라겐 합성효과가 우수한 아스코르빈산(vitamin-C)와 유사한 뛰어난 효과를 나타내고, 달팽이 유래의 동물성 뮤신과 비교한 경우, 뛰어난 주름개선 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서 뮤신의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역분석법(ELISA)를 실시하였다. 자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1은 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 뮤신은 26% 이상의 억제율을 보였으며, 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수하였고, 달팽이 유래 동물성 뮤신보다 높은 콜라겐 합성 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 뮤신의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가한 결과, 뮤신은 자외선에 의한 세포 독성을 0.1% 농도에서 34%의 세포독성을 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다. 뮤신의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여, 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5x104개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 그 결과, 뮤신은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1a의 생성을 0.1% 농도에서 30% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

본 발명의 또 다른 양태에서 둥근마 유래의 뮤신을 포함한 영양크림 및 뮤신을 포함하지 않은 영양크림을 제조하고, 제조된 영양크림의 주름개선효과를 30대 이상 여성 10명을 대상으로 각각 제조한 영양크림을 12주간 양쪽 눈가주름 위에 사용하게 한 후 4주, 8주, 12주 간격으로 눈가 주름 주형을 영상분석법으로 주름의 깊이(um)를 측정하였다. 측정한 결과, 뮤신이 첨가된 영양크림은 뮤신이 첨가되지 않은 영양크림과 비교하였을 때, 주름개선효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

본 발명의 또 다른 양태에서 둥근마 유래의 뮤신을 포함한 영양크림 및 뮤신을 포함하지 않은 영양크림을 이용하여 아토피 개선효과를 측정하기 위하여 피부장벽 손상방법으로 아세톤을 도포하고, 도포 6시간 경과 후에 TEWL을 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 평가함으로써 피부장벽기능이 회복되는 정도를 측정하였다. 그 결과, 뮤신이 첨가된 영양크림은 뮤신이 첨가되지 않은 영양크림과 비교하였을 때, 피부장벽 손상 후 회복 효과가 상승하는 것으로 나타났다.

본 발명에 있어서, 둥근마 유래의 뮤신을 구성하는 당은 만노오스, 글루코오스, 갈락토오스, 아라비노오스, 람노오스 및 푸코오스로 구성된 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 둥근마 유래의 뮤신에 포함된 아스파르트산, 글루탐산 및 아르기닌의 함량은 10mole% 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 뮤신의 함량은 화장용 조성물 100 중량부에 대하여, 0.001 내지 10 중량부인 것을 특징으로 할 수 있으며, 뮤신의 함량이 0.001 중량부 미만일 경우에는 농도가 낮아 항산화, 주름개선 및 콜라겐 합성 등의 효과 발현이 뚜렷하게 나타나지 않는 특징이 있고, 10 중량부를 초과할 경우에는 효과 발현 과포화 농도로 투입 대비 효율이 낮은 특징이 있다.

본 발명에 있어서, 상기 화장용 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 제형 및 연고 중에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 상기 특정 연속 공정으로 얻어진 둥근마 유래의 뮤신 및 이를 함유하는 화장용 조성물은 뛰어난 보습효과와 항산화 효과, 주름개선효과 그리고 아토피 개선효과를 나타낸다. 또한, 둥근마 유래의 뮤신을 함유하는 화장용 조성물은 화장수류, 에센스류, 크림류, 팩류, 패치류, 피부접착용 겔류, 파운데이션류, 메이크업 베이스류 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용시킬 수 있다. 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 둥근마로부터 뮤신의 수득

둥근마 100g을 3차 증류수 900ℓ에 가하여 25℃에서 1시간 침지를 시킨 후, 조분리 물질인 글라스 비드(GHM-30, B&K Media, 한국)를 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, 일본)을 이용하여 800rpm, 20℃에서 2시간 동안 전 분산 하였다. 그 후 80 mesh 표준체를 이용하여 찌꺼기 및 불순물을 걸러내고, 남은 점액성 콜로이드 수용액을 원심분리기(Supra 22K, 한일, 한국)를 이용하여 12,000g, 15℃에서 20분간 고속 원심분리하여 전분질 및 스테로이드 사포닌을 침전제거 하였다. 상기의 방법에 의해 수득한 상등 점액성 콜로이드 수용액에 4배(v/v)의 에탄올을 넣고 0℃ 저온에서 12시간 침적시킨 후 상등 혹은 침전된 뮤신을 회수하여 -80℃ 조건에서 48시간 동결건조를 실시하고 폴리머, 뮤신 2.1g을 수득하였다.

시험예 1: 뮤신의 성분분석

1-1: 뮤신의 단백질 함량 분석

실시예 1에서 수득한 뮤신의 단백질 함량, 당 함량, 구성 당 성분, 구성 아미노산 성분, 분자량 측정, FT-IR을 이용한 뮤신 동정을 위한 분석을 하였다.

단백질 함량 측정은 뮤신의 총 단백질 함량을 측정하기 위하여, BCA 어세이법을 수행하였다. BCA 어세이는 단백질이 구리 이온(Cu^{2 +}, Cu^{1 +})을 환원시킬 수 있는 성질을 이용한 것으로, 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA 용액과 반응을 해서 보라빛의 화합물(Cu⁺/BCA chromophore)을 생성하게 되는데, 이 보랏빛 화합물은 특정 파장 562㎚에서 최대 흡광도를 보인다. 따라서 단백질의 양이 많을수록 보랏빛 화합물(Cu⁺/BCA chromophore)이 더 많이 생기며 562㎚에서의 흡광도가 증가함을 이용하여 단백질의 양을 측정하였다. 먼저 지시약 micro BCA protein assay reagent kit(Pierce, cat. no. 23227)를 이용하여 각 96-웰 마이크로플레이트에 각각 150㎕ 씩 표준액, 희석된 시료를 넣은 후 bicinchoninic acid(BCA) kit WR(Working Reagent)시약을 첨가하여 30초간 voltexing하였다. 그 후 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 후, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, 미국)를 이용, 540㎚에서 흡광도를 측정하여 검량선을 작성하고 단백질 정량을 측정한 결과, 단백질 함량은 71.03%로 확인되었다 (표 1).

뮤신의 구성성분의 함량

단백질 함량(%)	71.03
당 함량(%)	28.14

1-2: 뮤신의 당 함량 분석

뮤신의 총당 함량을 측정하기 위하여, 환원당을 진한 황산으로 처리하면 탈수되어 furfural 또는 그 유도체가 형성되는데 이 유도체의 흡광도를 490㎚에서 측정하여 정량하는 방법인 페놀-황산염(Phenol-sulfate)법을 이용하였다.

샘플 0.5㎖에 5%의 페놀을 0.5㎖ 가한 후, 황산 2.5㎖를 넣었다. 그 후 vortex mixer를 사용하여 30초간 vortexing한 후, 25℃에서 20분간에 방치하고 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, 미국)를 이용하여 540㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 검량 표준선은 Glucose standard(Sigma, USA)를 사용하였고, 당 함량은 28.14 %로 확인되었다 (표 1).

1-3: 뮤신의 구성 당 분석

실시예 1에서 수득한 뮤신 2.5㎎을 1㎖의 3차 증류수에 용해한 후, trifluoroacetic acid(TFA)를 이용하여 가수분해시켰으며, CarboPac^TM PA1 컬럼과 Bio LC(HPAEC-PAD system, Dionex, 미국)를 이용하여 18mM NaOH 단일용매 기울기로 분석하였으며, 유속은 1㎖/min로 표준물질 1mM mixture(푸코오스, 람노오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 글루코오스, 만노오스, 자일로스 및 프룩토오스)를 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명의 뮤신의 구성성분의 당을 확인하였다. 그 결과, 상기 결과와 같이 뮤신의 당은 주로 만노오스(Mannose), 글루코오스(Glucose)였으며, 갈락토오스(Galactose), 아라비노오스(Arabinose), 푸코오스(Fucose), 람노오스(Rhamnose)도 소량 포함되어있는 것으로 확인되었다 (표 2).

뮤신의 구성 당 성분

뮤신 당 성분	푸코오스	람노오스	아라비노오스	갈락토오스	글루코오스	만노오스
Mole%	1.27	0.34	3.26	4.97	19.55	70.60

1-4: 뮤신의 구성 아미노산 분석

구성 아미노산분석은 실시예 1에서 수득한 뮤신 0.2g을 20㎖의 6N HCl에 130℃에서 24시간 동안 가수분해시켜 단백질의 펩타이드 결합을 끊어 개개의 유리아미노산으로 만들었다. 그 후 유리 아미노산을 OPA(o-phthalaldehyde, Agilent) 및 9-fluorenylmethylchloroformate(FMOC) 유도체를 사용하여 형광을 띄는 isoindole을 형성시킨 후, 고속액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, 미국)를 이용한 형광검출기(FLD, Agilent Technologies, 미국)에서 아미노산을 검출하였다. 표준물질로 250pM Amino acid Analysis Standard(AAS, Agilent, 미국)를 사용하여 검량선을 작성하고, 뮤신의 성분 아미노산을 확인한 결과, 뮤신의 아미노산은 주로 아스파르트산(Asp), 글루탐산(Glu) 및 아르기닌(Arg)으로 이루어져 있으며, 총 17종으로 구성되어 있음을 확인할 수 있었다.

뮤신의 구성 아미노산

뮤신 아미노산	Asp	Glu	Ser	His	Gly	Thr	Arg	Ala
Mole%	13.04	14.94	3.51	2.96	4.04	2.92	10.39	4.32
Tyr	Cys	Val	Met	Phe	Ile	Leu	Lys	Pro
2.69	4.84	5.87	1.82	6.14	4.87	7.44	6.11	4.10

1-5: 뮤신의 분자량 분석

뮤신의 분자량을 확인하기 위하여, pL aquagel OH-30, 40, 50 (7.5 X 300 mm, VARIAN, USA)컬럼과 고압액체크로마토그래피(Agilent Technologies 1200 Series HPLC/GPC, Agilent, USA), ELSD 검출기(ELSD 3300, Alltech, USA)를 이용하여, 이동상 DeIonized Water, 컬럼온도 25℃, 분당 0.7㎖ 유속, 검출기 온도 50℃, 질소가스 유속 1.4L/min의 조건으로 검출하였으며, 표준물질로 각 분자량별 PEG(PolyEthyleneGlycol)를 사용하여 시료의 컬럼 내 지연시간에 따른 분자량의 검량선을 작성, 본 발명의 뮤신의 분자량 분포를 확인하였다. 그 결과, 뮤신의 분자량 범위는 100,000~550,000Da으로 밝혀졌으며, 분자량 분포에 의한 수평균 분자량은 약 320,000Da으로 나타났다.

뮤신의 분자량

	검량곡선식	R2 value	Mn(Da)
뮤신	y=-0.289x+9.068	0.992	320,000

1-5: 뮤신의 동정

뮤신의 동정하기 위하여, 분광학적 분석법인 FT-IR분석을 실시하였다. 단백질의 기본구조인 펩타이드의 아미노카보닐(C=O)기와 당에 존재하는 하이드록시(-OH)기의 확인을 각각 3450㎝^{- 1}와 1650㎝^-1에서 확인함으로 단백 다당체를 검정하였다. 실시예 1에서 수득한 뮤신 0.001g과 0.5g의 KBr(Potassium bromide, FT-IR grade, Sigma)과 함께 막자사발로 고르게 분쇄한 후, 소량을 Pellet 주형에 넣고 유압기를 사용하여 Pellet을 만들고, FT-IR(Varian 640-IR, Varian, 미국)을 이용하여 적외선 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과, 3300~3400㎝^-1에서 당고리의 전형적인 O-H의 stretching 흡수 피크가 수소결합에 의해 이동되어 나타났고, 2900㎝^{- 1}부근에서 C-H streching 진동이 일어나고, 1600㎝^-1 부근에서 단백질의 기본구조인 펩타이드의 아미노카보닐(C=O)기가 확인되었으며, 1000~1100㎝^-1에서는 C-H와 C=O bending 진동이 일어나는 것을 확인함으로써 당단백체 구조인 뮤신임을 검정하였다.

시험예 2: 뮤신의 항산화 효과 측정

뮤신에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여, 자유라디칼 소거시험과 활성산소 소거시험을 실시하였다. 자유라디칼 소거시험은 안정한 DPPH의 흡광도가 540㎚에서 최대 흡광도를 나타는 것을 이용하고, 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록, 자유라디칼 소거율이 증가될수록 상기 540㎚파장에서 흡광도가 줄어들게 됨을 응용하여 검정시험방법에 의해 진행하였다.

0.1mM 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical(DPPH, Sigma)용액 1㎖에 상기의 실시예 1에서 수득한 뮤신을 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 1㎖를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치한 후, microplate reader(Thermo max, 미국)를 이용하여 540㎚파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 자유라디칼 소거시험에서 대조군은 DPPH 1㎖과 메탄올 1㎖를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며 (표 5), 메탄올 1㎖과 시료 1㎖를 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻었다. SC₅₀은 자유라디칼을 50% 소거하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 항산화활성이 높음을 나타낸다.

활성산소 소거시험은 잔틴/잔틴옥시데이즈(xanthine/xanthine oxidase, Sigma)의 효소반응에 의한 활성산소 발생을 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸리움(nitroblue tetrazolium, NBT)의 산화를 이용한 흡광도 변화를 측정함으로써 활성 산소의 소거능을 알 수 있다.

탄산나트륨(Na₂CO_{3 )} 2.4㎖, 잔틴(xanthine, Sigma) 0.1㎖, 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA) 0.1㎖, 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA, Sigma) 0.1㎖, NBT 0.1㎖ 및 뮤신 0.1㎖을 넣고 vortex mixer(Type 37600 Mixer, Mini mix, 미국)를 이용하여 voltexing 후 25℃에서 10분간 방치한 후, 잔틴산화효소(xanthine oxidase) 0.1㎖을 넣고 25℃에서 20분간 반응시킨 후, 6mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지, microplate reader(UVT-06685, Thermo max, 미국)를 이용하여 540㎚파장에서 흡광도를 측정하였다 (표 5).

상기 활성산소소거활성시험에서의 대조군은 시료용액 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, xanthine oxidase 용액 대신 3차 증류수를 넣어 추출 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

결과적으로, 뮤신은 강력한 합성 항산화제인 BHT와 거의 유사한 항산화 능력을 나타내었으며, 자유라디칼 소거율 50%의 농도는 132ppm, 활성산소소거율 50% 농도는 143ppm으로 미량의 농도에서 항산화 효능이 매우 우수하였다. 또한, 달팽이 유래 동물성 뮤신과 비교한 결과, 둥근마 유래의 뮤신의 항산화 효능이 우수함을 확인할 수 있었다.

[수학식 1]

자유라디칼 소거율(%)= 100-((시료의 흡광도/대조군의 흡광도)x100)

[수학식 2]

활성산소 소거율(%)= 100-((시료의 흡광도/대조군의 흡광도)x100)

뮤신의 항산화 효과

	자유라디칼소거율 SC50(ppm, ㎍/㎖)	활성산소소거율 IC50(ppm, ㎍/㎖)
뮤신	132	143
BHT	125	154
달팽이 유래 동물성 뮤신	〉5,000	〉5,000

시험예 3: 뮤신의 보습효과 측정

뮤신의 보습효과의 측정은 유수분측정기(WSK-P500U, Inforward. Inc, 일본)를 이용한 커패시턴스 측정법을 사용하고, 실시예 1에서 수득한 뮤신 1% 수용액과 여러 연구결과에서 피부 보습 효과가 뛰어나다고 알려진 히아루론산(Hyaluronic acid sodium salt, Sigma) 1% 수용액 및 1% 달팽이 유래의 동물성 뮤신과 비교하였다. 20~30대 여성 30명을 대상으로 하여, 시험 시작 직전에 전박 굴측면을 항온항습실(22℃, 상대습도 40-60%)에서 20분 동안 적응하게 하여 피부의 수분 자체를 일정하게 유지시켰다. 이후, 유수분측정기(WSK-P500U, Inforward. Inc, 일본)를 사용하여 각 시료 도포부위의 초기 수분 보유량을 측정한 후, 시료를 2.0㎎/㎝²를 전박 굴측면에 따른 오차를 최소화하기 위하여 피검자마다 도포하는 시료의 위치를 달리하면서 도포하였다. 도포 10분, 30분, 50분, 90분, 120분에서 시간별로 피부 수분량을 1차 측정하고, 2시간 후에 다시 피부 수분량을 측정하였다. 각 측정부위를 3번 반복 측정하고 그 평균값으로 피부 수분량을 계산하였다. 그 결과, 실시예 1에서 수득한 뮤신의 1% 수용액은 현재 보습효과가 뛰어나다고 알려진 히아루론산의 1% 수용액과 비교하여 보습효과가 더 우수함을 확인할 수 있었고, 1% 달팽이 유래의 동물성 뮤신과 비교해서도 높은 보습효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

뮤신의 보습효과

	도포 후 시간 경과에 따른 수분량 (A.U)
	10분	30분	50분	90분	120분
1% 뮤신	60.07	57.33	57.12	56.58	56.25
1% 히아루론산	61.31	58.24	57.21	55.87	52.11
1% 달팽이 유래 동물성 뮤신	62.48	50.33	43.88	41.24	40.09

시험예 4: 엘라스테이즈 활성저해시험

뮤신의 피부주름 억제 및 개선 효과를 검정하기 위하여, 엘라스테이즈 활성저해시험(elastase inhibition activity test)을 실시하였다. 엘라스틴은 피부 진피 내 매트릭스 층을 구성하는 성분으로 피부가 노화됨에 따라 엘라스틴이 분해되고 진피 내 매트릭스 층이 무너지며 주름이 생기게 된다. 이러한 원리를 이용하여 엘라스틴(elastin)을 분해하는 효소인 엘라스테이즈의 활성을 측정하는 방법으로 엘라스테이즈 기질인 N-석시닐-(Ala)3 p-니트로아닐린(N-succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline, Sigma)을 이용하여 p-니트로아닐린이 분해되면서 생기는 색의 변화를 405㎚의 파장에서 흡광도를 측정함으로써 엘라스테이즈 활성을 측정하는 방법을 이용하였다.

엘라스테이즈 활성도를 측정하기 위한 대조군은 시료 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 효소액 대신 3차 증류수를 넣어 각각에 대한 색 보정값을 얻은 경우를 설정하였으며, 시료는 실시예 1에서 수득한 뮤신과 엘라스테이즈 활성저해효과를 판단하기 위해 엘라스테이즈의 특이 저해제인 phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, Sigma)를 비교군으로 설정하였고, 하기 [수학식 3]을 이용하여 엘라스테이즈 저해율을 수치로 계산하였다. IC₅₀은 엘라스테이즈 활성을 50% 저해하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다. 또한, 달팽이 유래의 동물성 뮤신과 비교하여 둥근마 유래의 뮤신의 엘라스테이즈 활성을 측정하였다.

완충액은 pH 8.0, 0.267M Trizma-HCl(Sigma), 기질액은 8.8mM N-Succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline, 효소액은 돼지췌장 엘라스테이즈를 10㎍/㎖(Sigma)의 농도로 사용하였다. 완충액 60㎕, 기질액 20㎕와 상기 뮤신 시료 각각을 농도별로 3차 증류수에 희석한 시료액 100㎕를 섞은 후, 효소액 20㎕를 넣어 25℃ 항온수조에서 15분간 반응시켜 p-니트로아닐린의 생성량을 microplate reader(UVT-06685, Thermo max, 미국)를 사용하여 파장 405㎚에서 측정하였다.

그 결과, 실시예 1에서 수득한 뮤신의 엘라스테이즈 활성저해율은 1.50㎎/㎖로 엘라스타아제 특이 저해제인 PMSF 0.07㎎/㎖ 보다는 낮았지만 현재 주름개선 기능성 원료로 효과가 뛰어난 레티놀(Retinol)과 비슷할 정도로 주름개선효과가 우수하였다. 또한, 달팽이 유래의 동물성 뮤신과 비교한 경우, 뛰어난 주름개선 효과를 나타낸 것을 확인할 수 있었다.

[수학식 3]

엘라스테이즈 활성저해율(%)= 100-((시료의흡광도)/대조군의 흡광도)x100)

뮤신의 엘라스테이즈 활성 저해

	엘라스테이즈 활성저해율 IC50(ppm, ㎎/㎖)
뮤신	1.50
레티놀(Retinol)	1.20
PMSF	0.07
달팽이 유래 동물성 뮤신	〉5.00

시험예 5: 콜라겐 합성 효과 시험

뮤신의 피부 주름개선 효과를 검정하기 위하여 콜라겐 합성능을 측정하였다. 콜라겐은 상기 엘라스틴과 함께 피부 내 진피 매트릭스 층을 이루는 구성성분으로서 피부가 서서히 노화 되어가며 진피 내 매트릭스 층을 이루고 있는 구성성분들이 분해되어 감으로 주름이 생성되는데, 진피 매트릭스 층의 구성성분인 콜라겐의 합성효과를 확인함으로써 피부 주름을 개선하는 효과를 확인할 수 있다.

사람의 정상 섬유아세포(human dermal fibroblast)를 24-웰 마이크로플레이트에 접종시키고(1x10⁵ 세포/웰) 37℃, 5% 농도의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 시료들을 농도별로 첨가한 혈청이 함유되지 않은 DMEM배지에서 24시간 동안 배양하였고, 콜라겐 합성량은 효소면역측정법을 이용하여 수행하였다.

24시간 배양한 배지를 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 세척 버퍼(PBS-T; 0.05% Tween 20 in phosphate buffered saline)로 3회 세척하고 블로킹 용액(5% skin milk, Fluka)을 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 버리고 세척 버퍼로 3회 세척하고, 일차항체(rabbit anti-collagen type I, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100㎕씩 가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척한 다음, 이차 항체(anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100㎕씩 첨가하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 버퍼로 3회 세척 후, 기질용액(alkaline phosphatase substrate solution, Sigma)을 100㎕씩 넣고 항온 25℃ 에서 발색시킨 후, microplate reader(UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다.

상기 콜라겐 합성효과를 측정하기 위한 대조군은 시료를 처리하지 않은 세포 배양액의 반응 흡광도이며, 콜라겐 합성효과를 판단하기 위해 아스코르빈산과 달팽이 유래 동물성 뮤신을 비교군으로 설정하여 각각 3회씩 실시, 평균값을 구하였다. 하기 수학식 4를 이용하여 콜라겐 합성효과를 수치로 분석하였다. 그 결과, 실시예 1에서 수득한 뮤신은 콜라겐 합성효과가 우수한 아스코르빈산(vitamin-C)와 유사한 뛰어난 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었으며, 달팽이 유래 동물성 뮤신보다 높은 콜라겐 합성 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

[수학식 4]

콜라겐 합성효과(%) = 100+((대조군의 흡광도-시료의 세포배양액 흡광도)/대조군의 흡광도)x100

뮤신의 콜라겐 합성 효과 (단위: %)

시료의 농도(㎍/㎖)	0	1	10	100
뮤신	100.00	108.59	124.89	130.41
아스코르빈산	100.00	108.45	123.57	131.58
달팽이 유래 동물성 뮤신	100.00	102.13	103.12	102.80

시험예 6: 자외선 조사 후 뮤신에 의한 MMP -1 발현억제 평가

뮤신의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역분석법(ELISA)를 실시하였다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5J/㎝²의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였으며, 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오 미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 샘플이 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰 마이크로플레이트에 코팅하였다. 일차항체(MMP-1(Ab-5) 단일클론항체, MMP-2(Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37℃에서 60분 동안 반응시켰고, 이차항체인 안티마우스 IgG(whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알카린 포스파타제 기질 용액(1 mg/ml-nitrophenyl phosphate in diethanolamine 완충용액)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더로 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용하였다.

자외선 조사시에 발현이 유도되는 MMP-1은 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 뮤신은 26% 이상의 억제율을 보였으며, 이는 대조군으로 사용한 레티놀 및 달팽이 유래 동물성 뮤신의 억제율보다 우수하였다.

뮤신의 자외선에 의한 MMP-1 발현억제

	처리농도(%)	MMP-1 발현억제율(%)
뮤신	0.1	26
레티놀	0.1	18
달팽이 유래 동물성 뮤신	0.1	2

시험예 7: 자외선조사에 의한 뮤신의 세포독성 완화 효과

본 발명의 뮤신의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 하기과 같이 실험을 실시하였다.

섬유아세포(fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고, 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B(UVB) 램프(Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, 일본)를 이용하여 자외선 10mJ/㎝²를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1㎖를 첨가하고, 여기에 뮤신을 처리한 후, 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500㎕ 배지와 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 60㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃에서 CO₂배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl(0.04 N)을 500㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100㎕을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기로 565㎚에서 흡광도를 측정하였고, 세포생존율(%) 및 자외선에 의한 세포독성 완화율을 측정하였다. 그 결과, 뮤신은 자외선에 의한 세포 독성을 0.1% 농도에서 34%의 세포독성을 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

[수학식 5]

세포생존율(%) =(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

[수학식 6]

자외선에 의한 세포독성 완화율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

시험예 8: 자외선 조사에 의한 뮤신의 염증성 사이토카인 발현 억제효과

뮤신의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여, 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포(Fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, 일본)를 이용하여 자외선 10mJ//㎝²를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지(DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 뮤신을 처리한 후 5시간 동안 배양하였다. 배양 상층액을 150㎕를 취하여 IL-1a를 정량함으로써, 뮤신의 염증성 사이토카인 발현억제 효과를 판단하였다. IL-1a의 양은 효소면역분석법(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)을 이용하여 정량화하였으며, IL-1a의 생성율은 수학식 7에 의해 계산하였다. 실험결과, 실시예 1의 뮤신은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1a의 생성을 0.1% 농도에서 30% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있었다.

[수학식 7]

염증성 사이토카인 발현 억제율(%) =1-(St-Bo)/(Bt-Bo)X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1a생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1a생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1a생성량

제형예 1: 뮤신을 포함한 영양크림의 성분구성

상기 실시예 1에 따른 뮤신을 포함한 영양크림의 성분구성을 하기 표 10과 같이 구성하여 제조하였다.

뮤신을 포함한 영양크림의 성분 (단위: %)

	성분	제형 실시예1	제형 비교예1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	뮤신	2.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 10의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 베타인(원료 12) 내지 증류수(원료 17)의 수성성분을 80℃로 가온하여 완전 용해시킨 다음, 친유형 모노스테아린산글리세린(원료 1) 내지 트리옥타노인(원료 11)을 80℃로 가온하여 상기 베타인(원료 12) 내지 증류수(원료 17)의 용액에 투입하고 호모믹서(Homo Mixer Mark , Primix, 일본)를 이용하여 3000rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 방부제, 향 및 색소(원료 18)를 투입하여 5분간 교반시킨 후 실온으로 냉각하였다.

시험예 9: 제형 내 주름개선효과 측정

상기 제형예 1의 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 주름개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부노화가 진행중인 30대 이상 여성 10명을 대상으로 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 12주간 양쪽 눈가주름(crow feets)부위에 사용하게 한 후 4주, 8주, 12주 간격으로 눈가 주름 주형(replica)을 영상분석법으로 Skin visiometer(SV-600, C+K, 독일)를 이용하여 주름의 깊이(um)를 측정하였다. 그 결과, 뮤신이 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 실시예 1의 뮤신이 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 주름개선효과가 월등히 우수함을 확인하였다.

제형의 주름개선효과 측정

	평균값
	제형 실시예1	제형 비교예1
도포 전	328±13	314±21
도포 12주 후	243±31	310±58
주름깊이 감소율(%)	25.9%	1.3%

시험예 10: 제형 내 아토피 개선효과 측정

제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 아토피 개선효과를 측정하기 위하여, 피부장벽 손상방법으로 아세톤을 도포하였다. 8~12주령의 무모 생쥐의 배부에 아세톤을 점적하여 경피수분손실량(TEWL; transepidermal water loss)이 4.0g/m²/h에 도달하면 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 도포하였다. TEWL은 C+K사(Cologne, 독일)의 증발계인 Tewameter 210으로 측정하였다. 도포 6시간 경과후에 TEWL을 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 측정하여 TEWL이 감소되는 정도를 평가함으로써 피부장벽기능이 회복되는 정도를 측정하였다. 그 결과, 실시예 1의 뮤신이 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 뮤신이 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 피부장벽 손상 후 회복 효과가 상승하는 것으로 나타났다.

[수학식 8]

Br(Barrier Recovery)= (1-(B_{t =6}- B_{t =0})/(B_{t =d} - B_{t =0}))*100

B_{t =6} : 피부장벽 손상후 6시간 경과후의 TEWL 측정값

B_{t =0} : 피부장벽 손상이전의 TEWL 측정값

B_{t =d} : 피부장벽손상직후의 TEWL 측정값

아토피 개선효과 분석

아토피 개선효과 분석

회복율(%)	평균값
	제형 실시예1	제형 비교예1
6시간 경과 회복율 (초기 TEWL 기준)	54	13

제형예 2: 뮤신을 포함한 화장용 조성물의 구성성분

2-1: 유연화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	뮤신 (시료 1)	5.00
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

2-2: 수렴화장수

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	뮤신 (시료 1)	3.00
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

2-3: 영양화장수

번호	성 분	함량(%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	뮤신 (시료 1)	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

2-4: 에센스

번호	성 분	함량(%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	뮤신 (시료 1)	5.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

2-5: 팩

번호		함량(%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	뮤신 (시료 1)	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (14)

1. 다음의 단계를 포함하는 둥근마 유래의 뮤신의 제조방법:
   (a) 둥근마를 수용액에서 침지시키는 단계;
   (b) 침지시킨 둥근마를 교반시킨 다음, 여과하여 불순물을 제거하는 단계;
   (c) 고속원심분리를 통해 사포닌 및 전분질을 제거하는 단계;
   (d) 유기용매를 첨가하여 불순물을 제외한 뮤신만을 침전 또는 부유시키는 단계; 및
   (e) 상기 침전 또는 부유된 뮤신을 수득하는 단계.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 침지는 5~80℃에서 0.5~5시간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
3. 제1항에 있어서, 상기 (a)단계의 수용액은 물, 에탄올, 메탄올 및 다가 알코올로 구성된 군에서 선택된 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계에서 교반은 50~7,000rpm, 5~80℃에서 0.5~5시간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
5. 제1항에 있어서, 상기 (b)단계의 불순물은 10~300 mesh로 이루어진 표준체를 이용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
6. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 원심분리는 1,000~15,000g에서 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
7. 제1항에 있어서, 상기 (e)단계의 상기 침전 또는 부유된 뮤신을 수득하기 위하여 분무 또는 동결건조를 -120~-40℃에서 25~70시간 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
   
8. 제1항 내지 제7항의 방법으로 제조되고, 분자량이 100,000~550,000Da인 둥근마 유래의 뮤신을 유효성분으로 함유하는 화장용 조성물.
   
9. 제8항에 있어서, 둥근마 유래의 뮤신을 구성하는 단백질의 함량은 65~80%인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
10. 제8항에 있어서, 둥근마 유래의 뮤신을 구성하는 당의 함량은 20~35%인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
11. 제8항에 있어서, 둥근마 유래의 뮤신을 구성하는 당은 만노오스, 글루코오스, 갈락토오스, 아라비노오스, 람노오스 및 푸코오스로 구성된 것을 특징으로 하는 조성물.
    
12. 제8항에 있어서, 둥근마 유래의 뮤신에 포함된 아스파르트산, 글루탐산 및 아르기닌의 함량은 10 mole% 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
    
13. 제8항에 있어서, 뮤신의 함량은 화장용 조성물 100 중량부에 대하여, 0.001 내지 10 중량부인 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.
    
14. 제8항에 있어서, 상기 화장용 조성물은 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유(O/W)형 또는 유중수(W/O)형의 제형 및 연고 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 화장용 조성물.

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