KR101864203B1 - 해양식물 유래 뮤신, 그 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다시마, 참미역, 톳, 모자반, 납작파래와 같은 해양식물에 존재하는 당단백체인 뮤신을 특정 연속 공정 제조방법을 통하여 분리하는 방법과 이와 같이 분리된 해양식물 유래 복합뮤신 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 자세하게는 수용액 내에서의 해양식물 추출물은 불투명한 점액 콜로이드를 형성하지만 본 발명자들은 최적의 제조수율과 제조공정으로 뮤신을 단일분리하고 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제조하였다. 본 발명의 해양식물 유래 뮤신은 항산화효과, 염증 억제 효과, 자극완화효과, 잔주름개선 효과, 아토피 개선효과가 우수한 화장료 및 피부외용제로서 이용할 수 있다.

Description

해양식물 유래 뮤신, 그 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물 {Marin mucin ocean plants and cosmetic composition containing the same}

본 발명은 다시마, 참미역, 톳, 모자반, 납작파래와 같은 해양식물에 존재하는 당단백체인 뮤신을 특정 연속 공정 제조방법을 통하여 분리하는 방법과 이와 같이 분리된 해양식물 유래 복합뮤신 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 좀 더 자세하게는 수용액 내에서의 해양식물 추출물은 불투명한 점액 콜로이드를 형성하지만 본 발명자들은 최적의 제조수율과 제조공정으로 뮤신을 단일분리하고 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제조하였다. 본 발명의 해양식물 유래 뮤신은 항산화효과, 염증 억제 효과, 자극완화효과, 잔주름개선 효과, 아토피 개선효과가 우수한 화장료 및 피부외용제로서 이용할 수 있다.

사람의 피부는 노화 과정에서 다양한 물리화학적인 변화가 일어나며 그 원인으로는 크게 내적인 노화(intrinsic aging)와 광노화(photo-aging)로 구분할 수 있고, 이에 관한 연구가 활발히 이루어져 왔다. 즉, 자외선, 스트레스, 질병상태, 환경인자, 상처, 나이가 들어감에 따라 프리라디칼이 활성화되어 노화가 야기될 수 있으며, 이런 상태가 심화될 경우 생체 내에 존재하는 항산화 방어망을 파괴하고, 세포 및 조직을 손상시켜 성인병 및 노화를 촉진하게 된다. 좀 더 구체적으로 말하자면, 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴되고, 결국 피부 노화현상이 발생하는 것이다. 특히 단백질의 산화로 인하여 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되어 심한 과다 염증반응이 일어나고 피부의 탄력에 지장을 주게 되고 이것이 더 심해질 경우 DNA의 변이에 의해 돌연변이, 암 유발, 면역기능 저하의 상태에 이르게 된다.

그러므로 신체의 대사과정 중 발생하는 프리라디칼이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개되는 프리라디칼을 소거하여 세포막을 보호하고, 또 이미 손상된 세포는 활발한 신진대사에 의해 재생하여 세포를 증식시켜야 피부는 빠르게 회복되고 건강한 피부를 유지할 수 있다. 노화에는 프리라디칼뿐만 아니라 MMP(Matrix Metalloprotease)라는 효소가 관여하는데, 생체 내에서 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성과 분해는 적절하게 조절되나 노화가 진행되면서 그 합성이 감소하며 콜라겐을 분해하는 효소인 기질 금속단백질 분해효소(MMP)의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 형성된다. 또한, 자외선 조사에 의해 이러한 분해효소가 활성화되기도 한다. 그러므로 세포 내에서 활성화가 유도되는 MMP 발현을 조절하거나 그 활성을 억제할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다. 이제까지 화장품의 소재로서 사용된 원료들은 단순히 효소 활성만을 억제하는 것이 대부분이었다. 이에 세포 내 자연노화와 광노화에 의해 그 발현이 유도되는 MMP 발현 양 및 활성을 조절하고자 하였다.

아토피성 피부염(atopic dermatitis)의 원인은 아직 확실하게 규명되지 못하고 있으며, 피부건조, 습진 등으로 표현되는데, 아토피성 피부염은 다수의 요인에 기인한다. 아토피 피부염 악화에 관련하는 여러 외적 환경요인들은 잘 알려져 있고, 그 증거로 혈중 IgE의 증가, IL-4와 IL-5의 증가, INF-r 증가 등이 있으며, 피부의 이상은 표피 내 수분함량이 저하되고 자연보습인자 성분이 감소하고 경피수분 손실량이 증가한다.

뮤신(Mucin)이란 주로 동물계에 분포하는 점액질로 당단백체의 일종이며, 구조는 커다란 코어 단백질의 펩타이드에 당쇄가 연결되어 있는 형태이며(David J. et al., Biochem . J (1996) 316, 967-975), 그 pH에 따라 산성 뮤신(acid mucin), 중성 뮤신(neutral mucin) 등으로 분류된다. 인간의 침, 위점막 분비액, 달팽이 점액질 등이 뮤신으로 불린다.

다시마란 갈조식물 다시마목 다시마과의 한 속으로 길이 1.5~3.5m, 너비 25~40cm이다. 큰 바닷말이며 2~4년생인 엽체(葉體)는 포자세대(胞子世代)로서 겉보기에는 줄기·잎·뿌리의 구분이 뚜렷하다. 잎은 띠 모양으로 길고 가운데 부분보다 약간 아래쪽이 가장 넓다. 잎의 가운데 부분은 두께 1.8~3.5mm로서 약간 두껍다. 어릴 때에는 세로로 용무늬가 생기지만 개다시마속(Kjellmaniella)과 달리 자라면서 없어진다. 줄기는 짧은 원기둥 모양이고 곧게 서며, 여러 갈래로 가지를 낸다. 얽힌 뿌리는 잘 발달해 있어 바위에 붙는다. 한대·아한대의 연안에 분포하는 한해성(寒海性) 식물로서 한국에는 동해안 북부, 원산 이북의 함경남도·함경북도 일대에서 자라는 것으로 알려져 있다. 이밖에 일본 홋카이도와 도호쿠 지방 이북 연안, 캄차카반도, 사할린섬 등의 태평양 연안에도 분포한다. 다시마속 식물은 태평양 연안에 20여 종이 자라고 있으며 10m 이상의 큰 종류도 있는데, 주요 종으로는 참다시마(L.japonica), 오호츠크다시마(L.ochotensis), 애기다시마(L.religiosa) 등이 있다. 옛날부터 한국을 비롯하여 일본·중국에서 식용해왔다. 중국에서는 높은 수온에서도 잘 자라는 품종을 개발하여 양식하고 있다. 한국에서는 양식이 동해안부터 제주도를 제외한 전 연안에서 이루어진다. 주로 양식하는 종류는 일본 홋카이도 원산의 참다시마인데, 원산지에서는 12∼3월에 어린잎[幼葉]이 나와서 7월까지 성장한다. 이 종은 아직 엽체가 얇고 가벼워서 상품가치가 없으며 초가을에서 겨울까지 자란 다음, 포자를 내보내고 나면 엽체 끝부분이 점점 녹아버려 심하면 밑동만 남는다. 늦가을부터 초겨울의 재생기에는 잎의 밑동에 있는 생장대가 다시 활동하여 2년째 잎을 만들어 여름까지는 매우 두꺼운 엽체가 만들어진다. 2년째의 엽체는 6월부터 다음해 3월까지 포자를 내보내는데, 11월 무렵이 최성기가 된다. 다시마는 2년생 엽체부터 채취할 수 있다. 방출된 포자는 한동안 물속을 헤엄쳐 다니다가 바닥에 착생하며 불과 수십 개의 세포로 된 실 모양 배우체(配偶體)를 형성하고, 수온 10℃ 이하의 조건이 되면 알과 정자를 만들며 수정한다. 수정란은 현미경적인 크기의 아포체(芽胞體)를 이루었다가 새로운 포자체의 어린잎을 만들게 된다. 이들은 포자체가 크고 배수의 염색체를 지닌 복상세대(複相世代)와 반수인 염색체를 가지는 단상세대(單相世代: 현미경으로만 볼 수 있는 크기를 가진 배우체의 세대)가 되풀이되는 이형세대교번(異型世代交番)을 한다. 양식할 때는 덜 자란 배우체를 채묘(採苗)하여 수정한 뒤, 아포체와 어린잎이 나타나는 시기에 바다로 내보낸다. 다시마에는 카로틴류·크산토필류·엽록소 등의 여러 가지 색소 외에 탄소 동화작용으로 만들어지는 마니트·라미나린 등의 탄수화물과 세포벽의 성분인 알긴산이 많이 들어 있고, 요오드·비타민 B2·글루탐산 등의 아미노산이 들어 있다. 성분은 종류에 따라서 다르지만, 대체로 수분 16%, 단백질 7%, 지방 1.5%, 탄수화물 49%, 무기염류 26.5% 정도이며, 탄수화물의 20%는 섬유소이고 나머지는 알긴산과 라미나린 등 다당류이다. 특히 요오드·칼륨·칼슘 등 무기염류가 많이 들어 있다.

참미역은 갈조식물 다시마목 미역과의 바닷말로 줄기의 밑 부분은 원기둥 모양이고 윗부분은 넓적하게 퍼진다. 잎의 가장자리는 쭈글쭈글하게 말려들어 있다. 홀씨주머니는 잎의 양면에 생긴다. 물속 7~9m 깊이의 바위에 붙어산다. 한국, 일본 등지에 분포한다.

톳은 모자반과에 속하는 해조로, 학명은 Hizikia fusiforme (HARVEY) OKAMURA이다. 어린 것은 다육질의 주걱 모양이고 가장자리에 톱니가 있는 잎을 가지나 조락성(凋落性)이며, 성체는 원주상의 가지를 많이 가진다. 가지는 양끝이 뾰족하게 되거나 또는 곤봉상이며, 어떤 것은 끝이 팽대하여 기포로 된다. 생육지대는 바깥 바다에 면한 평탄하거나 완만하게 경사진 암반에, 평균 수면을 상한으로 하여 아래쪽 약 60㎝까지의 범위이다. 톳이 잘 번식하는 곳은 파도가 조용히 상하로 움직이는 오목한 곳이며, 착생 밀도가 높고 잘 발육하는 곳은 암초 둘레의 상층부이다. 생육시기는 늦여름∼초가을에 발아한 유체가 가을 중순에는 눈에 보일 정도이고, 3∼4월에 급히 자라 체장이 60㎝ 내외 또는 1m 이상으로 자란다. 4∼5월 이후에 생식을 하고, 그 뒤 조락기(凋落期)에 들어간다. 또한, 뿌리에서 가을에 새싹이 돋아나서 그것으로도 번식을 매년 거듭하는 다년생 해조이다. 톳은 남한의 연안에 분포하고 있으나 생산지의 중심은 제주도와 남해안이다.

모자반은 모자반과에 속하는 해조로서, 학명은 Sargassum fulvellum AGARDH.이다. 뿌리는 가반상(假盤狀)이고 줄기는 외줄이며 여기에서 긴 가지를 많이 낸다. 가지는 삼릉주(三稜柱)이며 다소 비틀어졌다. 잎의 기부쪽 것은 두꺼운 장피침상 또는 주걱모양이며 상부의 것은 막질피침상(膜質披針狀)이다. 중륵(中肋)은 선명하지 않거나 전혀 없고, 잎가장자리는 톱니꼴이다. 엽면(葉面)에는 모총(毛叢)이 산재하여 육안으로는 작은 점상으로 보인다. 잎이 변태해서 생긴 기포가 있어서 수중에서 몸이 자연스럽게 펼쳐져 있다. 길이는 1, 2m 가량이며 저조선(低潮線: 가장 낮은 썰물 때의 수위의 선) 부근의 바위에 붙어산다. 생식기는 겨울이고 우리나라 전 연안에 분포한다. 더운물에 데쳐서 갖은 양념을 하여 먹거나 분말로 하여 가축사료로 쓰기도 한다.

납작파래는 녹조식물 울로드릭스목 갈파래과의 해조류로서 한국을 비롯한 전세계에 널리 분포하며 독특한 향기와 맛을 가지고 있어 우리나라와 일본에서 많이 먹는다, 길이 약 40cm, 지름 1∼5cm이다. 몸은 원통형으로 약간 납작하고 때로는 잘록하다. 가지는 보통 하나로 하부에서 갈라지고 상부는 갈라지지 않고 넓게 부푼다. 세포는 지름이 10~15㎛이며, 일정한 순서 없이 배열되어 있고 두껍지 않은 막을 가지고 있다. 크기는 개체에 따라 차이가 크다. 클로로필, 카로틴, 젠토필 등의 녹색소와 피로신 등의 색소 단백질이 있어 녹색을 띤다. 조간대 상부의 민물이 흘러들어오는 곳에서 바위나 돌, 말뚝 등에 붙어 서식하며, 김발에도 잘 붙는다. 한국을 비롯한 전세계에 널리 분포한다. 비타민 A와 메틸메티오닌이 많이 함유되어 있어 니코틴의 해독에 좋으며 비타민 U의 함량은 양배추의 70배 이상이다.

현재까지 관련된 특허문헌은 등록특허 10-1676318호 "장어 피부로부터 대량의 분비물을 생성시켜 채취하고 채취된 장어 피부 분비물로부터 뮤신을 추출하는 장치", 등록특허 10-1487431호 "식물성 뮤신 및 수용성 식이 섬유소를 이용한 마이크로 코팅 생균제의 제조 방법", 등록특허 10-1361848호 "식물성 뮤신 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물" 등이 있다.

그러나 상기 문헌 어디에도 해양식물 유래의 천연복합물로부터 분리한 뮤신 및 이를 함유하는 기능성 화장료 조성물에 대한 개시는 없었다.

따라서 본 발명에서 이루고자 하는 기술적 과제는 종래에 연구나 시도가 없었던 해양식물인 다시마, 참미역, 톳, 모자반, 납작파래 등으로부터 뮤신을 분리하는 방법과 이를 통해 제조된 뮤신 및 이를 함유하는 화장료 조성물의 화장료 용도를 제공하려는 것이며, 좀 더 바람직하게는 보습, 항산화, 주름개선, 아토피 개선 효과가 뛰어난 해양식물 유래 뮤신 및 이를 함유하는 화장료 조성물을 제공하려는 것이다.

이에 본 발명자들은 이제까지 알려지지 않은 여러 천연물의 화장품으로의 응용 가능성을 연구한 결과, 다시마, 참미역, 톳, 모자반, 납작파래와 같은 해양식물 추출물로부터 뮤신을 분리하여, 항산화 효과, 콜라겐 합성효과, 피부 잔주름 완화효과, 피부자극완화 효과, 보습효과를 측정한 결과 매우 우수한 효과를 나타내어 화장품과 피부외용제로서의 효능을 기대할 수 있다는 것을 알아내었다.

본 발명은 다시마, 참미역, 톳, 모자반, 납작파래와 같은 해양식물로부터 뮤신을 단일 분리하는 방법과 이와 같이 분리된 뮤신 및 이를 함유하는 것을 특징으로 하는 보습, 항산화, 피부 주름개선, 아토피 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

좀 더 바람직하게는 본 발명은 해양식물 복합 추출물에서 피부자극성 페놀성 물질을 제거하는 전처리 공정; 해양식물 복합 추출물의 점액 콜로이드 구성을 위한 수용액에서의 웨팅 공정; 뮤신의 용출량 증대를 위한 스웰링 공정; 불순물을 거르는 여과 공정; 에탄올 등의 유기용매를 첨가하여 불순물을 제외한 뮤신만을 침전 또는 부유시키는 용해도 전환 공정; 그리고, 상기 침전 또는 부유 상태의 뮤신을 분무건조 또는 동결건조하여 파우더 형태의 뮤신을 얻는 단계를 포함하는 회수 공정;을 거쳐 제조되는 것을 특징으로 하는 보습, 항산화, 주름개선, 아토피 개선효과가 뛰어난 해양식물 복합 추출물 유래 뮤신 및 이를 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은

a) 1종 이상의 해양식물에서 피부자극성 페놀성 물질을 제거하는 전처리 공정;

b) 상기 전처리 공정을 거친 시료를 웨팅하는 공정;

c) 상기 웨팅 공정을 거친 시료에서 뮤신의 용출량 증대를 위해 스웰링하여 점액성 콜로이드를 얻는 공정;

d) 상기 스웰링 공정으로 얻은 점액성 콜로이드에서 불순물을 거르는 여과 공정;

e) 상기 여과한 시료에 유기용매를 첨가하여 불순물을 제외한 뮤신을 침전 또는 부유시키는 용해도 전환 공정; 및

f) 상기 침전 또는 부유된 뮤신을 분리하는 공정;을 포함하는 해양식물 유래 뮤신 제조방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 해양식물이 다시마, 참미역, 톳, 모자반 및 납작파래임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 전처리 공정이 친수성 유기용매 수용액에 1종 이상의 해양식물을 가하고 30분 이상, 바람직하게는 한 시간 이상 열 시간 이하 침지 또는 교반하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 친수성 유기용매가 C₁ ~ C₆ 알칸올, 케톤 및 극성 비양자성 유기용매로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 친수성 유기용매가 메탄올, 에탄올, 이소프로필 알콜, 아세톤 및 아세토니트릴로 이루어진 군으로부터 선택된 것임을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 전처리 공정이 친수성 유기용매 수용액에 1종 이상의 해양식물을 1~50중량% 가하여 수행함을 특징으로 한다. 1중량% 미만이면 뮤신 수득량이 너무 적고, 50중량%를 초과하면 충분한 페놀성 물질 제거가 이루어지지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 전처리 공정을 50℃ 이상, 바람직하게는 70 ~ 100℃의 온도에서 수행함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 전처리 공정을 거친 시료를 0.5~30중량%로 물에 가하여 20분 내지 10시간 동안 팽윤시켜 웨팅 공정을 수행함을 특징으로 한다. 시료가 너무 적으면 뮤신 수득량이 너무 적고, 30중량%를 초과하면 웨팅이 충분히 이루어지지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 스웰링 공정이 상기 웨팅 공정에서 얻은 점액성 콜로이드에 글라스 비드 또는 모래와 같은 조분리 물질을 투여하여 교반함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 뮤신 분리 공정 이후 분리된 뮤신을 건조하여 분말상 뮤신을 얻는 단계;를 더 포함하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 기재된 방법으로 제조되며, 구성 아미노산 조성이 아르기닌, 아스파틱산 및 글루타치온을 주성분으로 하며, 구성 당 조성이 퓨코스, 글루코스 및 만노스를 주성분으로 하며, 분자량 범위가 100,000 ~ 1,000,000 Da인 해양식물 유래 뮤신에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 해양식물 유래 뮤신을 활성성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 항산화, 노화방지, 주름완화, 자외선에 의한 피부손상 억제 또는 자극완화 기능을 지니는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 수중유 (O/W) 또는 유중수 (W/O) 제형임을 특징으로 한다.

아래에서는 본 발명의 해양식물 복합 추출물 유래 뮤신 및 그 제조방법과 이를 함유하는 화장료 조성물에 대하여 좀 더 자세히 설명한다.

전처리 공정을 통해 해양식물 추출물에서 피부자극성 페놀성 물질이 제거되게 되는데 본 발명에 의한 최적의 전처리 공정은 70% 에탄올 수용액에 1~30% (w/w) 비율로 해양식물을 가하여 한 시간 가량 80℃에서 전처리하여 페놀성 물질을 제거하며 동시에 감작성 효소들을 불활성화하여 제거한다.

웨팅 공정을 통해 수용액에서 해양식물은 점액성 콜로이드가 되는데, 본 발명에 의한 최적의 웨팅 공정은 전처리 공정을 거친 해양식물을 0.5~30%(w/w)의 비율로 물에 가하여 30분~5시간을 팽윤시킨다.

상기 웨팅 공정을 통해 형성된 점액성 콜로이드는 뮤신의 용출량 증대를 위해 스웰링 공정을 거치게 되는데, 본 발명의 스웰링 공정은 교반막대 또는 헤이돈 믹서를 이용하여 전 분산하며, 글라스 비드, 해사(바다모래) 등의 조분리물질을 투여하여 입자 충돌을 이용하여 뮤신의 용출량 증대를 극대화할 수 있다.

상기 스웰링 공정을 통해 추출물 용출이 극대화된 점액성 콜로이드는 원물 및 불순물 제거를 위한 여과 공정을 거치게 되는데, 본 발명의 여과 공정에서 필터는 특별한 한정은 없으나, 바람직하게는 표준체 또는 세라믹 필터 등을 이용해 수행한다.

상기 여과 공정을 통해 회수된 점액성 콜로이드는 에탄올 등의 유기용매를 이용하여 침전 또는 부유시키는 용해도 전환 공정을 거친다.

상기 용해도 전환 공정을 거친 점액성 콜로이드 내의 뮤신은 진공농축법으로 농축하여 사용할 수 있으며, 스프레이 드라이어, 동결건조, 건조 오븐 등을 이용하여 건조하여 분말상의 순수한 뮤신을 얻을 수 있다.

상기와 같은 공정으로 얻어진 해양식물 복합 추출물 유래의 뮤신 및 이를 함유하는 화장료 조성물은 뛰어난 보습 효과와 항산화 효과, 주름개선 효과 그리고 아토피 개선 효과를 나타낸다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어 상기 뮤신의 함량은 화장료 조성물 전체 중량 대비 0.001 내지 10중량%인 것이 바람직하며, 다시마, 참미역, 톳, 모자반, 납작파래 등 해양식물 복합 추출물 유래 뮤신을 함유하는 화장료 조성물은 화장수, 에센스, 크림, 팩, 패치, 피부접착용 겔, 파운데이션, 메이크업베이스, 바디워시, 비누 등의 목욕용 제품, 샴푸 등 헤어제품 등 다양한 제형으로 제조할 수 있고, 통상적인 화장료 제조법에 적용할 수 있고, 구체적으로 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등 다양한 성상으로 적용이 가능하며, 이들 각 제형에 적합하고 당업계에 주지된 각종의 통상적인 보조제와 담체를 포함할 수 있다.

본 발명자들은 해양식물 복합 추출물로부터 뮤신을 단일 분리하는 방법을 발명하였고, 이 방법으로 얻은 뮤신은 뛰어난 보습효과, 항산화 효과, 주름개선효과, 아토피 개선효과를 나타내어 화장료 및 피부외용제로서 매우 유용하다.

도 1a와 1b는 본 발명의 방법으로 분리한 해양식물 유래 뮤신의 분자량 측정 크로마토그램으로서, 1a는 표준물질, 1b는 본 발명의 시료에 관한 것이다.
도 2는 본 발명의 방법으로 분리한 해양식물 유래 뮤신의 FT-IR 스펙트럼이다.

아래에서는 실시예, 비교예, 시험예 등의 구체적인 예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 아래 실시예의 기재범위 내로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 범위 내에서 당업자의 통상적인 변화가 가능함은 자명하다.

<실시예 1>

70% 에탄올 수용액에 해양식물인 다시마, 참미역, 톳, 모자반, 납작파래를 중량비 1:2:2:3:2로 10중량% 가하고 80℃에서 세 시간 동안 침지 또는 교반 전처리하여 피부자극성 페놀성 물질 및 감작성 효소를 불활성화한다. 전처리 공정을 거친 혼합물을 이후 3차 증류수에 10중량% 가하여 한 시간 침지한 다음 조분리 물질인 글라스 비드 (GHM-30, B&K Media, KOR)를 넣고 프로펠러 믹서(BL3000, Heidon, JPN)를 이용하여 800 rpm, 20 ℃, 조건으로 두 시간 동안 전분산한다. 그 후 80 메쉬 표준체를 이용하여 찌꺼기 및 불순물을 거르고 남은 점액성 콜로이드 수용액에 4배(v/v)의 에탄올을 넣고 0℃ 저온에서 12시간 침적시킨 후 상등액에 있는 뮤신 또는 침전된 뮤신을 회수하여 -80℃ 조건에서 48시간 동결건조를 실시하여 분말상 뮤신을 얻었다. 이와 같이 수득된 것을 "시료 1"이라 하고, 아래 시험예에서 사용하였다.

<시험예 1: 뮤신의 성분분석>

본 발명 뮤신의 단백질 함량, 당 함량, 구성 당 성분, 구성 아미노산 성분, 분자량 측정, FT-IR을 이용한 뮤신 동정을 위하여 아래와 같이 실시하였다.

단백질 함량 측정은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

뮤신의 총 단백질 함량을 측정하기 위해 BCA (bicinchoninic acid) 분석법을 수행하였다. BCA 분석방법은 단백질이 구리 이온 (Cu^{2 +}, Cu^{1 +})을 환원시킬 수 있는 성질을 이용한 것으로, 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA 용액과 반응하여 보라빛 화합물 (Cu⁺/BCA 발색단)을 생성하게 되는데, 이 보랏빛 화합물은 특정 파장 562 nm에서 최대 흡광도를 보인다. 따라서, 단백질의 양이 많을수록 보랏빛 화합물 (Cu⁺/BCA chromophore)이 더 많이 생기며 562 nm에서의 흡광도가 증가함을 이용하여 단백질의 양을 측정한다. 실험방법은 아래와 같다.

우선 micro BCA protein assay reagent kit (Pierce, cat. no. 23227)를 이용하여 각 96 마이크로플레이트 웰에 각각 150 ul 씩 표준액과 희석된 시료를 넣은 후 BCA 분석킷트 작동시약을 첨가하여 30초간 격렬하게 교반하였다. 그 후 37 ℃로 두 시간 동안 반응시킨 후 마이크로플레이트 판독기 (UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선을 작성하고 단백질을 정량하였다. 결과는 아래 표 1과 같다.

시료	단백질 함량(%)	비고
시료 1	60.38

상기 결과와 같이 실시예 1 (뮤신, 시료 1)의 단백질 함량은 60.38%로 확인되었다.

당 함량 측정은 하기와 같이 수행하였다.

시료 1의 총 당 함량을 측정하기 위해 페놀-황산 (Phenol-sulfate) 분석법을 수행하였다. 페놀-황산 분석법은 환원당을 진한 황산으로 처리하면 탈수되어 푸르프랄 (furfural) 또는 그 유도체가 형성되는데 이 유도체의 흡광도를 490 nm에서 측정하여 정량하는 방법이다.

우선 시료 0.5 ml에 5% 페놀을 0.5 ml 가한 후 황산 2.5 ml를 넣는다. 그 후 볼텍스 혼합기를 사용하여 30초간 격렬하게 교반한 다음 25℃로 20분간 방치하고 마이크로플레이트 판독기 (UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 검량선을 작성하고 단백질을 정량하였다. 검량 표준선은 글루코스 표준물질 (Sigma, USA)을 사용하였고, 결과는 아래 표 2와 같다.

시료	당 함량(%)	비고
시료 1	39.44

위 표와 같이 실시예 1 (뮤신, 시료1)의 당 함량은 39.44%로 확인되었다.

구성당 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

2.5 mg의 실시예 1에서 얻은 시료 1을 1 ml의 3차 증류수에 용해한 다음 TFA (trifluoroacetic acid)를 이용하여 가수분해시킨다. 그 후 CarboPac^TM PA1 컬럼과 Bio LC (HPAEC-PAD system, Dionex, USA)를 이용하여 18 mM NaOH 단일용매 기울기로 분석하였으며, 유속은 1 ml/min으로 표준물질 1 mM 혼합물 (퓨코스, 람노스, 아라비노스, 갈락토스, 글루코스, 만노스, 자일로스, 프럭토스)을 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명의 뮤신의 성분 당을 확인 후 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다.

시료	Mole%
	Fuc	Rha	Ara	Gal	Glc	Man
시료 1	30.22	4.24	2.40	6.71	35.35	21.10

상기 결과와 같이 시료 1의 당은 주로 퓨코스, 글루코스, 만노스이며, 갈락토스, 아라비노스, 람노스도 소량 포함되어있는 것으로 확인되었다.

구성 아미노산 분석은 다음과 같은 방법으로 수행하였다.

0.2 g의 실시예 1에서 얻은 시료 1을 20 ml의 6 N HCl에 130 ℃로 24시간 동안 가수분해하여 단백질의 펩타이드 결합을 끊어 개개의 유리 아미노산으로 만든다. 그 후 유리 아미노산을 OPA (o-phthalaldehyde, Agilent), 9-FMOC (fluorenylmethylchloroformate) 유도체를 사용하여 형광을 띠는 아이소인돌을 형성시킨 후 고속 액체크로마토그래피 (Agilent Technologies 1200 Series HPLC, Agilent, USA)를 이용한 형광검출기 (FLD, Agilent Technologies, USA)로 아미노산을 검출하였으며 표준물질로 250 pM 아미노산 분석 표준물질 (AAS, Agilent, USA)을 사용하여 검량선을 작성하고, 본 발명 시료 1의 성분 아미노산을 확인한 후 그 결과를 아래 표 4에 나타내었다.

시료	Mole%
	Asp	Glu	Ser	His	Gly	Thr	Arg	Ala	Tyr	Cys	Val	Met	Phe	Ile	Leu	Lys	Pro
시료 1	14.01	16.21	6.40	3.24	2.49	1.90	21.19	3.33	1.17	5.32	3.97	0.94	0.27	8.88	8.44	7.74	6.97

상기 결과와 같이 시료 1의 아미노산은 주로 아르기닌, 아스파틱산, 글루타민산으로 이루어져 있으며, 총 17종으로 확인되었다.

분자량 측정은 아래와 같이 수행하였다.

본 발명의 방법으로 제조한 뮤신의 분자량을 확인하기 위하여 겔 투과 크로마토그래피를 수행하였다.

pL 아쿠아젤 OH-30, 40, 50 (7.5 X 300 mm, VARIAN, USA) 컬럼과 고압액체크로마토그래피 (Agilent Technologies 1200 Series HPLC/GPC, Agilent, USA), ELSD 검출기 (ELSD 3300, Alltech, USA)를 이용하여, 이동상 이온제거수, 컬럼 온도 25 ℃, 분당 0.7 ㎖ 유속, 검출기 온도 50℃, 질소가스 유속 1.4 L/min의 조건으로 검출하였으며, 표준물질로 각 분자량별 폴리에틸렌글라이콜 (PolyEthyleneGlycol)을 사용하여 시료의 컬럼 내 지연시간에 따른 분자량의 검량선을 작성하여 본 발명의 뮤신의 분자량 분포를 확인하고, 그 결과를 아래 도 1과 표 5에 나타내었다.

	검량곡선식	R2 value	Mn(Da)
시료 1	y=-0.289x + 9.068	0.992	560,000

상기 결과와 같이 시료 1 뮤신의 분자량 범위는 100,000에서 800,000 Da로 밝혀졌으며, 분자량 분포에 의한 수평균 분자량은 약 560,000 Da로 밝혀졌다.

FT-IR을 이용한 뮤신의 동정은 아래와 같이 수행하였다.

본 발명의 실시예에 의하여 얻은 시료가 뮤신임을 검증하기 위해 분광학적 분석법인 FT-IR 분석을 실시하였다. 단백질의 기본구조인 펩타이드의 아미노카보닐 (C=O)기와 당에 존재하는 하이드록시 (-OH)기를 각각 3450 cm^{- 1}와 1650 cm^-1에서 확인하여 시료가 단백다당체임을 검증하였다. 실험방법은 아래와 같다.

실시예 1에서 얻은 시료 1 0.001 g을 KBr(Potassium bromide, FT-IR grade, Sigma) 0.5 g과 함께 막자사발로 고르게 분쇄한다. 그 후 소량을 펠렛 주형에 넣고 유압기를 사용하여 펠렛을 만든다. FT-IR (Varian 640-IR, Varian, USA)을 이용하여 적외선 스펙트럼을 측정한다 (도 2).

실험 결과, 3300 ∼ 3400 cm^-1에서 당 고리에서 전형적인 O-H 스트레칭 흡수피크가 수소결합에 의해 이동되어 나타났고, 2900 cm^-1 부근에서 C-H 스트레칭 진동이 일어나고, 1600 cm^-1 부근에서 단백질의 기본구조인 펩타이드의 아미노카보닐기 (C=O)가 확인되었으며, 1000 ~ 1100 cm^-1에서는 C-H와 C=O 벤딩 진동이 일어나는 것을 확인함으로써 실시예 1에서 얻은 시료 1이 당단백체 구조인 뮤신임을 검정하였다.

<시험예 2: 뮤신의 항산화 효과 측정>

본 발명의 상기 뮤신 (시료 1)에 대한 피부 노화개선 효과 검정시험으로 항산화 효과를 확인하기 위하여 자유라디칼 소거시험과 활성산소 소거시험을 실시하였다.

자유라디칼 소거시험은 안정한 DPPH의 흡광도가 540nm에서 최대 흡광도를 나타내는 것을 이용하여 자유라디칼인 DPPH가 시료에 의해 소거되어 보라색에서 투명한 색이 될수록 즉, 자유라디칼 소거율이 증가할수록 상기 540nm 파장에서 흡광도가 줄어들게 됨을 응용하여 아래와 같은 검정시험방법에 의해 진행하였다.

먼저 0.1 mM DPPH (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical, Sigma) 용액 1 mL에 상기 실시예 1에서 얻은 시료 1을 메탄올에 적당한 농도로 희석하여 1 mL를 혼합하고, 37℃에서 15분간 방치한 후 마이크로플레이트 판독기 (Thermo max, USA)를 이용하여 540nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 자유라디칼 소거시험에서 대조군은 DPPH 1 ml과 메탄올 1 ml를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 메탄올 1 ml와 시료 1 ml을 넣어 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

아래 수학식 1을 이용하여 자유라디칼 소거율을 계산하여 아래 표 6에 나타내었다. 표 6에서 SC₅₀은 자유라디칼을 50% 소거하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 항산화 활성이 높음을 나타낸다.

[수학식 1]

자유라디칼 소거율 (%) = 100 - {(시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100}

활성산소 소거시험은 잔틴/잔틴옥시데이즈 (xanthine/xanthine oxidase, Sigma)의 효소반응에 의한 활성산소 발생을 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루 테트라졸리움 (nitroblue tetrazolium, NBT)의 산화를 이용한 흡광도 변화를 측정함으로써 활성 산소의 소거능을 알 수 있다.

Na₂CO₃ 2.4 ml, 잔틴 (xanthine, Sigma) 0.1 ml, EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) 0.1 ml, BSA (bovine serum albumin, Sigma) 0.1 ml, NBT 0.1 ml 및 시료 0.1 ml을 넣고 볼텍스 교반기 (Type 37600 Mixer, Mini mix, USA)를 이용하여 격렬히 교반한 후 25 ℃에서 10분간 방치한 다음 잔틴 옥시데이즈 0.1 mL을 넣고 25 ℃로 20분간 반응시켰다. 여기에 6 mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지하고, 마이크로플레이트 판독기 (UVT-06685, Thermo max, USA)를 이용하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.

상기 활성산소 소거활성시험의 대조군은 시료용액 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 잔틴 옥시데이즈 용액 대신 3차 증류수를 넣어 추출 시료와 대조군에 대한 각각의 색 보정값을 얻는 것으로 설정하였다.

수학식 2를 이용하여 활성산소 소거율을 수치로 계산하여 아래 표 6에 나타내었다. 표 2에서, IC₅₀은 활성산소를 50% 소거하기 위해 소요되는 시료 농도이며, 값이 작을수록 항산화 활성이 강함을 의미한다.

[수학식 2]

활성산소소거율(%) = 100 - {(시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100}

시험에 사용한 시료는 뮤신 (시료 1)이며, 항산화 효과를 비교하기 위해 상기와 같이 시험을 하였고 그 결과를 표 6에 나타내었다.

시료	자유라디칼 소거율 SC50 (ppm, ug/ml)	활성산소 소거율 IC50 (ppm, ug/ml)	비고
뮤신 (시료 1)	111	163
BHT	126	182

상기 표 6을 보면, 뮤신 (시료 1)은 강력한 합성 항산화제인 BHT와 거의 유사한 항산화 능력을 나타내었으며, 자유라디칼 소거율 50% 농도는 111 ppm, 활성산소 소거율 50% 농도는 163 ppm으로 미량의 농도에서 항산화 효능이 매우 우수하였다.

<시험예 3: 뮤신의 보습효과 측정>

본 발명의 뮤신 (시료 1)의 보습효과를 검정하기 위해 하기와 같이 보습효과를 측정하였다. 실험 방법과 결과는 하기와 같다.

보습효과의 측정은 유수분 측정기 (WSK-P500U, Inforward. Inc, Japan)를 이용한 커패시턴스 측정법을 사용하고, 20~30대 여성 30명을 대상으로 하여, 시험 시작 직전에 전박 굴측면을 항온항습실 (22℃, 상대습도 40-60%)에서 20분 동안 적응하게 하여 피부의 수분 자체를 일정하게 유지시켰다. 그 다음, 유수분 측정기 (WSK-P500U, Inforward. Inc, Japan)를 사용하여 각 시료 도포부위의 초기 수분 보유량을 측정한 후, 시료를 도포하였다. 시료 2.0 mg/cm²를 전박 굴측면에 따른 오차를 최소화하기 위하여 피검자마다 도포하는 시료의 위치를 달리하면서 도포하였다. 도포 10분, 30분, 50분, 90분, 120분에서 시간별로 피부 수분량을 1차 측정하고, 두 시간 후에 다시 피부 수분량을 측정하였다. 각 측정부위를 세 번 반복 측정하고 그 평균값으로 피부 수분량을 계산하였다.

실시예 1에서 수득한 뮤신 (시료 1) 1% 수용액과 여러 연구결과에서 피부보습 효과가 뛰어나다고 알려진 히알루론산 (Hyaluronic acid sodium salt, Sigma) 1% 수용액을 비교하여 다음 표 7에 나타내었다.

수용액	도포후 시간 경과에 따른 수분량 (A.U)
	10분경과	30분경과	50분경과	90분경과	120분경과
1% 뮤신 (시료 1)	62.00	61.30	59.74	58.58	58.25
1% 히알루론산	61.31	58.24	57.21	55.87	52.11

표 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 수득한 뮤신 (시료 1)의 1% 수용액은 현재 보습효과가 뛰어나다고 알려진 히아루론산의 1% 수용액과 비교하여 보습효과가 더 우수하였다.

<시험예 4: 엘라스테이즈 활성저해시험>

본 발명의 뮤신 (시료 1)의 피부주름 억제 및 개선 효과를 검정하기 위하여 엘라스테이즈 활성저해시험을 실시하였다. 엘라스틴은 피부 진피 내 매트릭스 층을 구성하는 성분으로, 피부가 노화됨에 따라 엘라스틴이 분해되고 진피 내 매트릭스 층이 무너지며 주름이 생기게 된다. 이러한 원리를 이용하여 엘라스틴을 분해하는 효소인 엘라스테이즈의 활성을 측정하는 방법으로 엘라스테이즈 기질인 N-석시닐-(Ala)3 p-나이트로아닐린 (N-succinyl-(Ala)3 p-nitroaniline, Sigma)을 이용하여 p-나이트로아닐린이 분해되면서 생기는 색의 변화를 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 완충액은 pH 8.0, 0.267 M Trizma-HCl (Sigma), 기질액은 8.8 mM N-석시닐-(Ala)3 p-나이트로아닐린, 효소액은 돼지췌장 엘라스테이즈를 10 ug/ml (Sigma)의 농도로 사용하였다. 완충액 60 ul, 기질액 20 uL와 상기 뮤신 시료 각각을 농도별로 3차 증류수에 희석한 시료액 100 ul를 섞은 후, 효소액 20 ul를 넣어 25℃ 항온수조에서 15분간 반응시켜 p-나이트로아닐린의 생성량을 마이크로플레이트 판독기 (UVT-06685, Thermo max, USA)를 사용하여 파장 405nm에서 측정하였다.

상기 엘라스테이즈 활성도를 측정하기 위한 대조군은 시료 대신 3차 증류수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 효소액 대신 3차 증류수를 넣어 각각에 대한 색 보정값을 얻은 경우를 설정하였다.

시험에 사용한 시료는 실시예 1에서 수득한 뮤신 (시료 1)과 엘라스테이즈 활성저해효과를 판단하기 위해 엘라스테이즈의 특이 저해제인 PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride, Sigma)를 가한 것을 비교군으로 설정하였고, 아래 수학식 3을 이용하여 엘라스테이즈 저해율을 수치로 계산하여 표 8에 나타내었다. 표 8에서 IC₅₀은 엘라스테이즈 활성을 50% 저해하기 위해 소요되는 시료의 농도이며, 값이 작을수록 저해율이 높음을 나타낸다.

[수학식 3]

엘라스테이즈 활성저해율 (%) = 100 - {(시료의흡광도)/대조군의 흡광도 x 100}

시료	엘라스테이즈 활성저해율 IC50 (mg/ml)
뮤신 (시료 1)	1.31
레티놀	1.18
PMSF	0.07

표 8에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 수득한 뮤신(시료 1)의 엘라스테이즈 활성저해율은 1.50 mg/ml로 엘라스타아제 특이 저해제인 PMSF (phenylmethanesulphonylfluoride 또는 phenylmethylsulphonyl fluoride) 0.07 mg/ml보다는 낮았지만 현재 주름개선 기능성 원료로 효과가 뛰어난 레티놀과 비슷할 정도로 주름개선효과가 우수하였다.

<시험예 5: 콜라겐 합성효과>

본 발명의 뮤신 (시료 1)의 피부 주름개선 효과를 검정하기 위하여 콜라겐 합성능을 측정하였다. 콜라겐은 상기 엘라스틴과 함께 피부 내 진피 매트릭스층을 이루는 구성성분으로서 피부가 서서히 노화되어가며 진피 내 매트릭스층을 이루고 있는 구성성분들이 분해되어가며 주름이 생성되는데, 진피 매트릭스층의 구성성분인 콜라겐의 합성효과를 확인함으로써 피부 주름을 개선하는 효과를 확인할 수 있다. 시험은 아래와 같이 진행한다.

사람의 정상 섬유아세포 (human dermal fibroblast)를 24-웰 마이크로플레이트에 접종시키고 (1x10⁵ 세포/웰) 37 ℃, 5% 농도의 CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 각 시료들을 농도별로 첨가한, 혈청이 함유되지 않은 DMEM 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 콜라겐 합성량은 효소면역측정법을 이용하여 다음과 같이 측정하였다.

24시간 배양한 배지를 96-웰 마이크로플레이트에 분주하여 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 세척 완충액 (PBS-T; 0.05% Tween 20 in phosphate buffered saline)으로 3회 세척하고 블로킹 용액 (5% skin milk, Fluka)을 첨가하여 37℃에서 한 시간 동안 블로킹하였다. 블로킹 용액을 버리고 세척 버퍼로 3회 세척하고, 일차 항체 (rabbit anti-collagen type I, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 ul씩 가하여 37℃에서 두 시간 동안 반응시켰다. 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, 이차 항체 (anti-rabbit IgG alkaline phosphatase conjugate, Sigma)를 PBS-T에 희석하여 100 ul씩 첨가하여 37 ℃에서 두 시간 동안 반응시켰다. 세척 완충액으로 3회 세척한 다음, 기질용액 (alkaline phosphatase substrate solution, Sigma)을 100 ul씩 넣고 항온 25 ℃에서 발색시킨 후, 마이크로플레이트 판독기 (UVT-06685, Termo max, USA)를 사용하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기 콜라겐 합성효과를 측정하기 위한 대조군은 시료를 처리하지 않은 세포 배양액이며, 콜라겐 합성효과를 판단하기 위해 아스코르빈산을 비교군으로 설정하여 각각 3회씩 실시하고 평균값을 구하였다.

아래 수학식 4를 이용하여 콜라겐 합성효과를 수치로 계산하여 표 9에 나타내었다.

[수학식 4]

콜라겐 합성효과(%) = 100 + (대조군의 흡광도-시료의 세포배양액 흡광도)/대조군의 흡광도 × 100

콜라겐 합성효과 (%)	시료	농도(ug/ml)
		0	1	10	100
	뮤신 (시료 1)	100.00	105.49	110.89	123.89
	아스코르빈산 (vitamin-C)	100.00	103.45	112.02	124.58

표 9에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 수득한 뮤신 (시료 1)은 콜라겐 합성효과가 우수한 아스코르빈산 (vitamin-C)과 유사한 뛰어난 효과를 나타냈다.

<시험예 6: 자외선 조사 후 뮤신에 의한 MMP-1 발현억제 평가>

본 발명의 뮤신 (시료 1)의 UV 조사 및 시료 첨가 후 MMP-1 농도를 측정하기 위해서 효소면역분석법 (ELISA)을 실시하였다. 실험 방법은 아래와 같다.

UV 챔버를 이용하여 인간 진피 섬유아세포에 UVA를 5 J/㎠의 에너지로 조사한다. 자외선 조사량과 배양시간은 예비 실험을 통하여 섬유아세포에서 MMP 발현량이 최대가 되는 조건을 확립하였다. 음성 대조군은 은박지로 싸서 UVA의 환경에 같은 시간 유지하였다. UVA 방출량은 UV 라디오미터를 이용하여 측정하였다. UVA가 조사되는 동안의 세포는 이전에 분주된 배지 그대로이고 UVA를 조사한 후 시료가 들어간 배지로 교환하여 24시간 배양 후 배지를 회수하여 96-웰에 코팅한다. 일차항체 (MMP-1 (Ab-5) 단일클론항체와 MMP-2 (Ab-3) 단일클론항체)를 처리하고 37 ℃에서 60분 반응시킨다. 이차항체인 안티마우스 IgG (whole mouse, alkaline phosphatase conjugated)를 다시 60분 정도 반응시킨 후, 알칼라인 포스파타제 기질 용액 (1 mg/ml 다이에탄올아민 완충용액 내의 ρ-나이트로페닐인산)을 상온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 판독기로 405 nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 것을 사용한다.

자외선 조사시 발현이 유도되는 MMP-1에 대하여 시료를 처리하지 않은 대조군에 비하여 뮤신 (시료 1)은 29% 이상의 억제율을 보였으며 이는 대조군으로 사용한 레티놀의 억제율보다 우수한 결과이다 (표 10).

시험군	처리농도 (%)	MMP-1 발현억제율 (%)
뮤신 (시료 1)	0.1	29
레티놀	0.1	18

<시험예 7: 자외선 조사에 의한 뮤신의 세포독성 완화 효과>

본 발명의 뮤신 (시료 1)의 자외선 조사에 의한 세포독성의 완화 효과를 평가하기 위하여 아래와 같이 시험하였다.

섬유아세포 (fibroblast)를 24-웰 시험 플레이트에 1x10⁵개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ul의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선 B (UVB) 램프 (Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지 (DMEM에 10% FBS가 첨가된 것) 1 ㎖을 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 뮤신 (시료 1)을 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지 500 ㎕ 배지와 MTT 용액 (2.5 ㎎/㎖) 60 ㎕를 넣은 후 두 시간 동안 37 ℃ CO₂ 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 이소프로판올-HCl (0.04 N)을 500 ㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시키고 상등액 100 ㎕씩을 96-웰 시험 플레이트에 옮긴 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565 nm 흡광도를 측정하였다. 수학식 5에 의해 세포생존율 (%)을 측정하고 자외선에 의한 세포독성 완화율은 수학식 6에 의하여 계산하였다.

[수학식 5]

세포생존율 (%) =〔(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 세포배양배지 만을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

Bt : 시료를 처리하지 않은 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

St : 시료를 처리한 웰을 발색 반응한 웰의 565 nm 흡광도

[수학식 6]

자외선에 의한 세포독성 완화율 (%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 세포생존율

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 세포생존율

실험 결과 뮤신 (시료 1)은 0.1% 농도에서 자외선에 의한 세포 독성을 54% 완화하여 자외선에 의한 세포독성을 효과적으로 방어함을 알 수 있었다 (표 11).

시료명	처리농도 (%)	세포독성 완화율 (%)
뮤신 (시료 1)	0.1	54

<시험예 8: 자외선 조사에 의한 뮤신의 염증성 사이토카인 발현 억제효과>

본 발명의 뮤신 (시료 1)의 자외선 조사에 의해 발현되는 염증성 사이토카인 발현 억제효과를 평가하기 위하여 사람의 표피조직에서 분리한 섬유아세포를 24-웰 시험 플레이트에 5x10⁴개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 각 웰을 PBS로 1회 세척하고 각 웰에 500 ㎕의 PBS를 넣었다. 이 섬유아세포에 자외선B (UVB) 램프 (Model : F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 세포배양 배지 (DMEM에 FBS가 첨가되지 않은 배지) 350 ㎕를 첨가하였다. 여기에 평가하고자 하는 뮤신(시료 1)을 처리한 후 5시간동안 배양하였다. 배양 상층액을 150 ㎕ 취하여 IL-1α를 정량함으로서 뮤신 (시료 1)의 염증성 사이토카인 발현억제효과를 판단하였다. IL-1α의 양은 효소면역분석법 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 이용하여 정량화하였으며, IL-1α의 생성율은 수학식 7에 의해 계산하였다.

[수학식 7]

염증성 사이토카인 발현 억제율 (%) =〔1-(St-Bo)/(Bt-Bo)〕X 100

Bo : 자외선 조사하지 않고 시료 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

Bt : 자외선 조사하고 시료를 처리하지 않은 웰의 IL-1α생성량

St : 자외선 조사하고 시료를 처리한 웰의 IL-1α생성량

실험 결과, 실시예 1의 뮤신 (시료 1)은 자외선에 의한 염증성 사이토카인인 IL-1α의 생성을 0.1% 농도에서 60% 억제하여, 자외선에 의한 염증 발생을 낮은 농도에서 효과적으로 방어함을 알 수 있다 (표 12).

시료명	처리농도 (%)	염증성 사이토카인 발현 억제율 (%)
뮤신 (시료 1)	0.1	60.0

[제형 실시예 1 및 제형 비교예 1]

상기 실시예 1에 따른 뮤신 (시료 1)을 포함한 영양크림의 성분구성을 아래 표 13과 같이 구성하여 제조하였다.

번호	성 분	제형 실시예 1	제형 비교예 1
1	친유형 모노스테아린산글리세린	2.0	2.0
2	스테아린산	1.5	1.5
3	세테아릴 알콜	2.2	2.2
4	밀납	1.0	1.0
5	스쿠알란	3.0	3.0
6	경화식물유	1.0	1.0
7	소르비탄 스테아레이트	0.6	0.6
8	광물유	5.0	5.0
9	폴리솔베이트 60	1.5	1.5
10	디메치콘	1.0	1.0
11	트리옥타노인	5.0	5.0
12	베타인	3.0	3.0
13	트리에탄올아민	1.0	1.0
14	글리세린	5.0	5.0
15	소듐히아루로네이트	3.0	3.0
16	뮤신 (시료 1)	2.0	-
17	증류수	잔량	잔량
18	방부제, 향, 색소	미량	미량

상기 표 13의 조성으로 구성된 성분 중에서 먼저 원료 12 내지 17의 수성성분을 80 ℃로 가온하여 완전 용해한 다음, 원료 1 내지 11을 80 ℃로 가온하여 상기 원료 12 내지 17의 용액에 투입하고 호모믹서 (Homo Mixer Mark Ⅱ, Primix, JPN)를 이용하여 3000 rpm에서 15분간 유화시켰다. 그 후, 원료 18을 투입하여 5분간 교반한 후 실온으로 냉각하였다.

<시험예 9: 제형 내 주름개선효과 측정>

상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 주름개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부노화가 진행중인 30대 이상 여성 10명을 대상으로 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 12주간 양쪽 눈가주름 (crow feets) 부위에 사용하게 한 후 4주, 8주, 12주 간격으로 눈가 주름 주형 (replica)을 영상분석법으로 Skin visiometer (SV-600, C+K, Germany)를 이용하여 주름의 깊이 (um)를 측정하고, 그 결과를 아래 표 14에 나타내었다.

	평균값
	제형 실시예 1	제형 비교예 1
도포 전	331 ± 11	328 ± 12
도포 12주후	231 ± 33	320 ± 20
주름깊이 감소율(%)	30.2 %	2.4 %

상기 결과와 같이 실시예 1의 뮤신 (시료 1)이 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 실시예 1의 뮤신 (시료 1)이 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때, 주름개선 효과가 월등히 우수했다.

<시험예 10: 제형 내 아토피 개선효과 측정>

상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1에서 제조된 영양크림의 아토피 개선효과를 측정하기 위하여 다음과 같은 방법을 통하여 측정하였다. 피부장벽 손상방법으로 아세톤을 도포하였다. 8-12주령의 무모 생쥐의 배부에 아세톤을 점적하여 경피수분 손실량 (TEWL; transepidermal water loss)이 4.0 g/㎡/h에 도달하면 상기 제형 실시예 1 및 제형 비교예 1의 영양크림을 도포하였다. 경피수분 손실량은 C+K사 (Cologne, Germany)의 증발계인 Tewameter 210으로 측정하였다. 도포 6시간 경과 후 경피수분 손실량을 측정하여 감소하는 정도를 평가함으로써 피부장벽 기능이 회복되는 정도를 알아보았다. 효능평가에 사용된 회복율 계산은 수학식 8과 같이 하였고, 그 결과를 아래 표 15에 나타내었다.

[수학식 8]

Br (Barrier Recovery)= (1-(B_{t =6}- B_{t =0})/(B_{t =d} - B_{t =0}))*100

B_{t =6} : 피부장벽 손상 6시간 경과 후의 TEWL 측정값

B_{t =0} : 피부장벽 손상 이전의 TEWL 측정값

B_{t =d} : 피부장벽 손상 직후의 TEWL 측정값

회복율 (%)	평균값
	제형 실시예 1	제형 비교예 1
6시간 경과 회복율 (초기 TEWL기준)	66	11

상기 결과와 같이 실시예 1의 뮤신 (시료 1)이 첨가된 제형 실시예 1의 영양크림은 실시예 1의 뮤신 (시료 1)이 첨가되지 않은 제형 비교예 1의 영양크림과 비교하였을 때 피부장벽 손상 후 회복 효과를 현저히 상승시키는 것으로 나타났다.

이하, 본 발명의 제형예로서 유연 화장수 (표 16), 수렴 화장수 (표 17), 영양 화장수 (표 18), 마사지 크림 (표 19), 에센스 (표 20) 및 팩 (표 21)을 예시하나 본 발명의 화장료 조성물의 제형은 이에 제한되는 것으로 해석해서는 안 되며, 본 발명의 범위 내에서 당업자가 통상적으로 변화시킬 수 있다.

번호	성 분	함량 (%)
1	글리세린	5.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	3.00
3	PEG 1500	1.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	에탄올	10.00
9	옥틱도데세스-16	0.20
10	폴리솔베이트 20	0.20
11	뮤신 (시료 1)	5.0
12	방부제, 향, 색소	미량
13	증류수	잔량

번호	성 분	함량 (%)
1	글리세린	2.00
2	1,3-부틸렌 글라이콜	2.00
3	알란토인	0.10
4	DL-판테놀	0.30
5	EDTA-2Na	0.02
6	벤조페논-9	0.04
7	에탄올	15.00
8	폴리솔베이트 20	0.20
9	뮤신 (시료 1)	3.0
10	구연산	미량
11	방부제, 향, 색소	미량
12	증류수	잔량

번호	성 분	함량 (%)
1	세테아릴 알콜	1.00
2	글리세릴스테아레이트	0.50
3	폴리소르베이트 60	1.00
4	소르비탄세스퀴올리에이트	0.30
5	세틸옥타노에이트	6.00
6	스쿠알란	4.00
7	샤플라워오일	4.00
8	부틸렌글라이콜	4.00
9	글리세린	4.00
10	카보머	0.10
11	트리에탄올아민	0.10
12	뮤신 (시료 1)	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

번호	성 분	함량 (%)
1	글리세린	10.00
2	베타인	5.00
3	PEG 1500	2.00
4	알란토인	0.10
5	DL-판테놀	0.30
6	EDTA-2Na	0.02
7	벤조페논-9	0.04
8	히드록시에틸 셀룰로오스	0.10
9	카르복시비닐 폴리머	0.20
10	트리에탄올아민	0.18
11	옥틸도데칸올	0.30
12	옥틸도데세스-16	0.40
13	에탄올	6.00
14	뮤신 (시료 1)	5.00
15	방부제, 향, 색소	미량
16	증류수	잔량

번호	성 분	함량 (%)
1	폴리비닐 알콜	15.00
2	셀룰로오스 검	0.15
3	글리세린	3.00
4	PEG 1500	2.00
5	시이크데스트린	0.15
6	DL-판테놀	0.30
7	알란토인	0.10
8	글리시리진산 모노암모늄	0.20
9	니코틴 아미드	0.40
10	에탄올	5.00
11	PEG 40 경화피마자유	0.30
12	뮤신 (시료 1)	1.00
13	방부제, 향, 색소	미량
14	증류수	잔량

Claims (15)

1. a) 에탄올 수용액에 수용액 기준 1~30중량%로 1종 이상의 해양식물을 가하여 1시간 동안 80℃에서 침지 또는 교반하여 피부자극성 페놀성 물질을 제거하는 전처리 공정;
   b) 상기 전처리 공정을 거친 시료를 물 기준 0.5~30중량%로 물에 가하여 20분 내지 10시간 동안 팽윤하는 웨팅 공정;
   c) 상기 웨팅 공정에서 얻은 점액성 콜로이드에 조분리물질을 투여하고 교반하여 점액성 콜로이드를 얻는 스웰링 공정;
   d) 상기 스웰링 공정으로 얻은 점액성 콜로이드에서 불순물을 거르는 여과 공정;
   e) 상기 여과한 시료에 유기용매를 첨가하여 불순물을 제외한 뮤신을 침전 또는 부유시키는 용해도 전환 공정; 및
   f) 상기 침전 또는 부유된 뮤신을 분리하는 공정;을 포함하며,
   수평균 분자량 560,000 Da인 해양식물 유래 뮤신 제조방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 해양식물은 다시마, 참미역, 톳, 모자반 및 납작파래임을 특징으로 하는 방법.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   상기 조분리 물질은 글라스 비드 또는 모래 중 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
   
4. 청구항 1에 있어서,
   상기 뮤신 분리 공정 이후 분리된 뮤신을 건조하여 분말상 뮤신을 얻는 단계;를 더 포함하는 방법.
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6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
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15. 삭제

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