CN113636924A - 一种发酵法生产辅酶q10的提取纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种发酵法生产辅酶Q10的提取纯化方法，利用甲醇处理正己烷从类球红细菌发酵菌丝体提取的富含辅酶Q10的浓缩提取物，搅拌下50‑65℃加热0.5‑2h，甲醇提取液再经冷却析晶、过滤得到辅酶Q10；本发明通过加热下卟啉类化合物、类脂化合物与甲醇形成了一个新的溶剂体系并在冷却后析出辅酶Q10，达到初步分离及纯化辅酶Q10的目的，并且获得较高的纯度及提取率，同时大幅降低了环保压力，进一步推动了发酵法提取辅酶Q10的工业化发展。

Description

一种发酵法生产辅酶Q10的提取纯化方法

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及一种发酵法生产辅酶Q10的提取纯化方法。

背景技术

辅酶Q10，又名泛醌10，结构式如下：

传统的利用正己烷从类球红细菌的发酵菌丝体提取的富含辅酶Q10浓缩物富含辅酶Q10，以及脂溶性卟啉化合物、脂类化合物(如硬脂酸及棕榈酸)、各种类胡萝卜素、糖脂类化合物等易溶于正己烷的物质，还混杂有蛋白质等。由于富含卟啉类化合物，所以正己烷从类球红细菌发酵菌丝体提取的富含辅酶Q10浓缩液呈紫黑色的焦油状。进一步将辅酶Q10从紫黑色的焦油状物中提取并纯化是发酵方法制备辅酶Q10的关键工艺。

辅酶Q10是种脂溶性的醌类物质，为黄色或淡黄色结晶，在碱性条件下不稳定易降解，对热、酸较稳定。在油脂中有较大的溶解度，易溶于正己烷、石油醚、丙酮、乙酸乙酯。氯仿等低极性有机溶剂中。一般资料都叙述辅酶Q10在乙醇中微溶，在甲醇与水中不溶。

以正己烷为溶剂从类球红细菌发酵菌丝体提取的浓缩物中富含辅酶Q10。要将辅酶Q10从浓缩物中提取出来，目前生产中常用的方法有皂化法、溶剂萃取法、超声提取法、超临界萃取法等。但目前国内外主要采用的是氢氧化钠-甲醇皂化法。

皂化是强碱与酯类物质反应，酯类发生水解生成羧酸盐和醇，在提取的同时实现提取物的初步纯化。进入提取浓缩物的酯类物质可以通过皂化分解成难溶于提取剂的羧酸盐和醇经水洗而分离除去，同时除去的还有卟啉类物质等各类杂质。为在室温下实现皂化，一定量甲醇的存在是必须的。但在皂化处理的过程中容易出现乳化现象，还需要添加大量的氯化钠抑制乳化。乳化轻则造成辅酶Q10流失，重则使生产难以为继。而且产生的皂化液呈黑色，高碱高盐高甲醇，普通的环保设施及工艺不能处理。

另外，由于辅酶Q10在碱性条件下不稳定易于降解，必须添加抑制剂如焦性没食子酸来抑制降解，但这不仅增加了成本，而且有焦性没食子酸残留的危害性。

发明内容

本发明是提供一种发酵法生产辅酶Q10的提取纯化方法，以至少解决现有技术中出现的诸多问题之一。

鉴于此，本发明的方案如下：

一种发酵法生产辅酶Q10的提取纯化方法，包括如下步骤：类球红细菌发酵菌丝体正己烷提取液经回收溶剂得浓缩液；搅拌下向浓缩液中加入甲醇，加热，甲醇提取液经冷却析晶、过滤干燥得到辅酶Q10。

进一步地，所述甲醇加热条件为50-65℃，搅拌0.5-2h。

进一步地，所述冷却析晶的温度为0-25℃。

进一步地，所述浓缩液经甲醇重复提取2-3次，合并辅酶Q10。优选地，所述甲醇总的用量为浓缩前提取液体积的1.75-2倍。更优选地，所述重复提取过程每次甲醇的用量为浓缩前提取液体积的0.25-1.5倍。

作为本发明的优选，所述重复提取步骤中，产物分离后的甲醇提取液重复套用于首次提取。

进一步地，所述方法得到辅酶Q10经无水乙醇纯化后得到辅酶Q10纯品。

相比现有技术，本发明的有益效果为：

1.本发明所述提取方法经济环保、可行性强。克服了现有的皂化方法生产辅酶Q10的工艺过程中存在的辅酶Q10的降解问题、皂化后高碱高盐黑色废液排放的处理问题、大量甲醇在皂化后高碱高盐黑色废液中残留的问题，以及添加的焦性没食子酸残留在辅酶Q10产品中的残留的问题等。

2.本发明所述提取方法得到的辅酶Q10收率高、纯度高，进一步推动了发酵法提取辅酶Q10的工业化发展。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。

本发明的目的在于提供一种用甲醇来提取纯化以正己烷为溶剂，从类球红细菌发酵菌丝体提取的浓缩物中的辅酶Q10。所述方法用甲醇来提取纯化辅酶Q10要解决现有的发酵方法生产辅酶Q10的工艺过程中皂化方法在实施过程时产生的辅酶Q10的降解问题、皂化后高碱高盐高甲醇黑色废液排放的处理技术问题、添加的焦性没食子酸残留在辅酶Q10产品中的问题等。

本发明提出一种发酵法生产辅酶Q10的提取纯化方法，包括如下步骤：

S1.富含辅酶Q10的提取液回收正己烷后得到浓缩液，加入甲醇搅拌，分2-3次提取，甲醇总的用量为浓缩前提取液体积的1.75-2倍，50-65℃加热搅拌0.5-2h后，滤出甲醇提取液；

S2.提取液分别冷却到0-25℃、静置4-12h，辅酶Q10析出，过滤回收，晶体合并纯化。

优选地，步骤S1每一次提取过程中加入的甲醇量达到浓缩前的体积数的0.25-1.5倍，更优选0.25-1倍，搅拌下加热到60-65℃，保持0.5h，

优选地，步骤S2甲醇提取液冷却到15℃、静置12h，辅酶Q10析出完全，过滤回收。

本发明中，第一第二第三次的甲醇提取液过滤回收辅酶Q10后，甲醇溶液减压回收甲醇。回收甲醇后的残留物(已蒸干)可用于回收卟啉类化合物。

本发明中，第一第二第三次的甲醇提取液冷却过滤回收的辅酶Q10呈黄色，经正己烷-异丙醚溶解上硅胶柱纯化，无水乙醇重结晶，得到的辅酶10含量达到99.5wt％以上。

本发明中，为了提升甲醇利用率和产物收率，第三次的甲醇提取液可套用于甲醇的第一次提取。

本发明实施前，本领域人员知晓或应当知晓，辅酶Q10可微溶于乙醇，但不溶于甲醇，并且在热甲醇的作用下辅酶Q10仍然不溶，在该常识的基础上，甲醇并会单独成为纯化辅酶Q10的理想溶剂。本发明以正己烷作为溶剂的发酵液经浓缩回收正己烷后，辅酶Q10及卟啉类化合物、脂类化合物均析出，此时搅拌下加入甲醇，加热后发现上述析出物均溶解，此时的甲醇和卟啉类化合物、脂类化合物形成新的溶剂体系改变了原溶剂的极性，使辅酶Q10溶解性大大提高；甲醇溶液体系经过滤除掉不溶性杂质后，再经降温，由于辅酶Q10的溶解度迅速降低而以晶体的形式析出，然而卟啉类化合物、脂类化合物均同甲醇形成均一的溶剂体系性质稳定，因此不会析出。根据这一原理，辅酶Q10以晶体的形式析出并经后处理即可得到纯化的产品。

本发明中，所述富含辅酶Q10的提取液为以正己烷为溶剂从类球红细菌发酵菌丝体提取的正己烷提取液1000ml，按《中国药典2020版》辅酶Q10的方法测定，含辅酶Q10量为5.68mg/ml，置园底烧瓶中，在30℃真空浓缩回收正己烷至干(冷凝器无液滴滴出)，得到残留物59.43g，含辅酶Q10为9.56％。

实施例1

以经回收正己烷得到的59.43g残留物进行提取纯化，方法如下：

1)第一次甲醇提取：圆底烧瓶残留物中加甲醇1000ml，升温到64℃，搅拌0.5h，倾出甲醇液趁热布氏漏斗真空抽滤，甲醇滤液15℃放置自然冷却12h。辅酶Q10结晶析出完全，过滤、干燥，得到4.76g辅酶Q10，辅酶Q10含量88.8％。第一次甲醇提取的提取率以1000ml正己烷提取液含辅酶Q10量为100％计为74.42％。

过滤得到的除去辅酶Q10结晶的甲醇液补充甲醇到1000ml，测定辅酶Q10含量为0.15mg/ml，真空浓缩回收甲醇，溶解于甲醇的卟啉类化合物待回收。圆底烧瓶真空拉干后称重，得到残留物33g，加上布氏漏斗的残渣用正己烷溶解定容到200ml，检测含辅酶Q10为6.435mg/ml,即残留量为1.287g(残留率为22.66％)。

2)第二次甲醇提取：圆底烧瓶残留物中加甲醇500ml，升温到60℃，搅拌0.5h，倾出甲醇液趁热布氏漏斗真空抽滤，甲醇滤液15℃放置自然冷却。12h结晶析出完全，过滤干燥，得到0.99g，含量93.3％。以1000ml正己烷提取液含辅酶Q10量为100％计第二次甲醇提取的提取率为16.27％。提取率以第一次提取后的辅酶Q10残留量为1.287g计，为71.79％，过滤得到的除去辅酶Q10结晶的甲醇液补充甲醇到500ml，测定辅酶Q10含量为0.14mg/ml，真空浓缩回收甲醇，溶解于甲醇的的卟啉类化合物待回收。圆底烧瓶拉干后称重，得到残留物8.05g，加上布氏漏斗的残渣，用正己烷溶解定容到100ml，检测含辅酶Q10量为2.88mg/ml。

3)第三次甲醇提取：圆底烧瓶残留物中加甲醇250ml，升温到50℃，搅拌2h，倾出甲醇液20℃过夜，得到辅酶Q10结晶202mg，含量84.1％，以1000ml正己烷提取液含辅酶Q10量为100％计第三次甲醇提取的提取率为2.99％。真空浓缩回收甲醇的得230ml，溶解于甲醇的的卟啉类化合物待回收。圆底烧瓶拉干后称重，得到残留物呈灰白色，约7.5g，弃去。

4)合并三次甲醇提取的辅酶Q10提取物，以1000ml正己烷提取液含辅酶Q10量为100％计，折算提取率为93.7％。

实施例2

以经回收正己烷得到的59.43g残留物进行提取纯化，方法如下：

1)第一次甲醇提取：圆底烧瓶残留物中加甲醇1500ml(含实施例1第三次甲醇提取后析晶滤液230ml)，升温到50℃，搅拌2h，倾出甲醇液趁热布氏漏斗真空抽滤，残液待用；甲醇滤液5℃放置自然冷却4h。辅酶Q10结晶析出完全，过滤、干燥，得到4.89g辅酶Q10，辅酶Q10含量89.2％。第一次甲醇提取的提取率以1000ml正己烷提取液含辅酶Q10量为100％计为76.79％。

过滤得到的除去辅酶Q10结晶的甲醇液补充甲醇到1000ml，测定辅酶Q10含量为0.13mg/ml，真空浓缩回收甲醇，溶解于甲醇的卟啉类化合物待回收。圆底烧瓶真空拉干后称重，得到残留物29g，加上布氏漏斗的残渣用正己烷溶解定容到200ml，检测含辅酶Q10为5.775mg/ml，即残留量为1.155g(残留率为20.33％)。

2)第二次甲醇提取：圆底烧瓶残留物中加甲醇500ml，升温到60℃，搅拌0.5h，倾出甲醇液趁热布氏漏斗真空抽滤，甲醇滤液2℃放置自然冷却，6h结晶析出完全，过滤干燥，得到1.07g，含量93.6％。以1000ml正己烷提取液含辅酶Q10量为100％计第二次甲醇提取的提取率为17.63％。提取率以第一次提取后的辅酶Q10残留量为1.155g计，为86.71％，过滤得到的除去辅酶Q10结晶的甲醇液补充甲醇到300ml，测定辅酶Q10含量为0.11mg/ml，真空浓缩回收甲醇得475ml。圆底烧瓶拉干后称重，得到残留物呈灰白色，约7.68g，弃去。

3)合并两次甲醇提取的辅酶Q10提取物，以1000ml正己烷提取液含辅酶Q10量为100％计，折算提取率为94.4％。

实施例3

以经回收正己烷得到的59.43g残留物进行提取纯化，方法如下：

1)第一次甲醇提取：圆底烧瓶残留物中加甲醇1200ml(含实施例2第二次甲醇提取后析晶滤液475ml)，按照实施例2相同步骤操作的，得到4.83g辅酶Q10，辅酶Q10含量89.0％。

2)第二次甲醇提取：圆底烧瓶残留物中加甲醇600ml，按照实施例2相同的步骤操作，得到固体1.05g，含量93.0％。圆底烧瓶拉干后称重，得到残留物呈灰白色，弃去。

3)合并两次甲醇提取的辅酶Q10提取物，以1000ml正己烷提取液含辅酶Q10量为100％计，折算提取率为92.9％。

对照例1

以经回收正己烷得到的59.43g残留物进行提取纯化，方法如下：

以1000ml的无水乙醇代替无水甲醇提取，78℃下搅拌提取0.5h，倾出乙醇液趁热布氏漏斗真空抽滤，乙醇滤液15℃放置自然冷却12h，无辅酶Q10结晶析出。5℃继续放置24h，也无辅酶Q10结晶析出。无法得到辅酶Q10样品。

对照例2

以经回收正己烷得到的59.43g残留物进行提取纯化，方法如下：

按照实施例1的步骤第一次甲醇提取后在30℃放置12h，辅酶Q10析出，过滤、干燥，但数量只有3.52g，辅酶Q10含量为85.6％，而且辅酶Q10的结晶色泽较暗，对后续纯化不利。

从实施例1-3不难看出，在单个实施例中，如实施例1采用三步提取，前两次提取过程甲醇的用量为1.5倍(相比浓缩前正己烷提取液体积)，导致剩余残渣中仍包含有少量的产物(辅酶Q10含量大于2mg/ml)，从而影响产品收率。实施例2中当甲醇用量为2倍时，其二次提取后的残留物呈灰白色，含量很少，由此说明继续增大甲醇的用量时，对于提高收率空间较小。因此，在甲醇总体积为浓缩前正己烷提取液体积的1.75-2倍的前提下，采用两步或三步提取的方式，并且单个提取步骤的甲醇用量为浓缩前正己烷提取液体积的0.25-1.5倍，可以获得约为93-94％的综合收率；另外验证了第一次提取时套用回收的甲醇作为溶剂的可行性，可实现甲醇的循环使用。

而对照例1中采用无水乙醇加热提取产物，因乙醇冷却辅酶Q10的溶解度影响不大而无法析出；另外，对照例2中采取较高温度30℃析晶放置，辅酶Q10溶解度没有显著下降，并且存在杂质的析出从而影响到析出物的产率及色泽。

本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和改进，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的实验示例和这里示出与描述的示例。

Claims (8)

1.一种发酵法生产辅酶Q10的提取纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：类球红细菌发酵菌丝体正己烷提取液经回收溶剂得浓缩液；搅拌下向浓缩液中加入甲醇，加热，甲醇提取液经冷却析晶、过滤干燥得到辅酶Q10。

2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述甲醇加热条件为50-65℃，搅拌0.5-2h。

3.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述冷却析晶条件为0-25℃，静置4-12h。

4.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述浓缩液经甲醇重复提取2-3次，合并辅酶Q10。

5.根据权利要求4所述的提取纯化方法，其特征在于，所述甲醇总的用量为浓缩前提取液体积的1.75-2倍。

6.根据权利要求4所述的提取纯化方法，其特征在于，所述重复提取过程每次甲醇的用量为浓缩前提取液体积的0.25-1.5倍。

7.根据权利要求5所述的提取纯化方法，其特征在于，所述重复提取步骤中，产物分离后的甲醇提取液重复套用于首次提取。

8.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于，所述方法得到辅酶Q10经无水乙醇纯化后得到辅酶Q10纯品。