CN114921505A

CN114921505A - 一种l-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺

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Publication number: CN114921505A
Application number: CN202210738866.7A
Authority: CN
Inventors: 杨奕; 徐慧; 陈玲玲; 刘建军; 田延军; 姜国政; 王珊珊; 黄艳红; 韩延雷; 李瑞国
Original assignee: Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute; YANTAI HENGYUAN BIOENGINEERING CO Ltd
Current assignee: Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute; YANTAI HENGYUAN BIOENGINEERING CO Ltd
Priority date: 2022-06-28
Filing date: 2022-06-28
Publication date: 2022-08-19
Anticipated expiration: 2042-06-28
Also published as: CN114921505B

Abstract

本发明提供一种L‑丙氨酸高效酶转化及提取工艺，包括游离细胞法酶转化反应、脱色、重结晶等步骤，具体操作如下：产L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶的睾丸酮丛毛单胞菌HY‑08D菌株发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L‑天冬氨酸，加入细胞通透剂EDTA和吐温‑80，加入酶稳定剂磷酸吡哆醛，转化培养，L‑天冬氨酸‑β‑脱羧酶酶活达到55000~70000 U，培养液经过脱色、重结晶、干燥得到成品L‑丙氨酸。

Description

一种L-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺

技术领域

本发明属于氨基酸生产技术领域，涉及一种L-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺。

背景技术

L-丙氨酸（L-alanine， L-Ala）又名 L-2-氨基丙酸，是一种具有重要生理功能的非必需氨基酸，在食品、医药等领域具有广泛的应用。食品应用方面，L-丙氨酸具有甜味与鲜味，被用于食品添加剂，改善食品风味并强化营养，此外其还具有较强的防腐保鲜功能，被用作防腐剂。医药应用方面，L-丙氨酸是复合氨基酸注射液的组成成分之一，是合成维生素 B5、维生素 B6、L-氨基丙醇（盐酸左氧氟沙星）和抗癌药 4-羟基水杨醛丙氨酸合锌的前体物质。此外，L-丙氨酸可用于合成具有光学活性的聚合物，在生物医学、液晶、手性催化等领域具有重要的价值。

L-丙氨酸可以通过提取法、化学合成法和生物转化法进行制备。其中，酶法转化是目前工业上的主要生产方法，即利用 L-天冬氨酸-β-脱羧酶（L-aspartate-β-decarboxylase，Asd）以 L-天冬氨酸（L-aspartic acid，L-Asp）为原料经脱羧生成 L-丙氨酸。在该工艺中，提高酶转化效率是L-丙氨酸生产工艺中的关键，直接影响L-丙氨酸的提取及得率。同时，由于培养液中含有许多杂质，L-丙氨酸在培养液中结晶，所得L-丙氨酸晶体不仅包含培养基杂质，还会包埋未转化的L-天冬氨酸，使产品质量大打折扣，不能满足高端客户对医药级产品的需求。因此，通过对所得L-丙氨酸酶转化过程及重结晶工艺进行研究，得到了一种L-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺。

发明内容

本发明提供了一种L-丙氨酸高效酶转化及其提取工艺，提高了酶转化效率和产品的品质，满足了高端客户对医药级产品的需求，值得推广应用。

本发明采用的技术方案是：

一种L-丙氨酸高效酶转化及提取工艺，产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L-天冬氨酸，加入细胞通透剂EDTA和吐温-80，加入酶稳定剂磷酸吡哆醛，转化培养，L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活达到55000~70000 U。培养液经过脱色、重结晶、干燥得到成品L-丙氨酸，得到的L-丙氨酸纯度达99%以上，透光率达98%以上，比旋光度[

]_D ²⁰为+14.5º~ +15.0º。

其具体操作步骤为：

（1）游离细胞培养液制备

取本单位一株睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株活化并进行高密度发酵培养，获得游离细胞培养液，测定酶活力为45000~58000 U。取1 L游离细胞培养液进行后续酶转化反应。睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D的保藏编号为:CGMCC No.6083。

（2）游离细胞培养液活化

向上述游离细胞培养液中加入细胞通透剂，细胞通透剂为EDTA和吐温-80。EDTA的加入量为0.5%~1.5%，吐温-80的加入量为0.05%~0.2%，然后加入L--天冬氨酸-β-脱羧酶稳定剂，稳定剂为磷酸吡哆醛，加入量为0.1~1.0 mM。调整pH为6.0，测定酶活力为55000~70000 U。

（3）酶转化反应

直接向步骤（2）游离细胞培养液中添加固体L-天冬氨酸，采用pH自动控制加液系统，在线监控反应pH值，通过PID控制器自动补加L-天冬氨酸，严格控转化液 pH在5.5-6.0之间，进行酶转化反应。L-丙氨酸的等电点pI=6.02，在整个酶转化过程中L-丙氨酸晶体不断析出，本工艺最终L-天冬氨酸转化率可达400~450%。

（4）脱色

将步骤（3）获得的转化液过滤收集粗晶体，用去离子水溶解，调整pH 4.5~5.0、温度50~55 ℃、L-丙氨酸浓度为15%~18%，加入加入量为0.8~1.0% ZX-303活性炭脱色20~25min，脱色率可达82.0%以上。

（5）重结晶

将经净化处理的L-丙氨酸溶液pH调整至6.0，进行真空蒸发结晶，温度50~70 ℃，真空度-0.05~0.08 MPa。将获得的L-丙氨酸晶体，离心，干燥得到成品L-丙氨酸，纯度达99%以上。

L-丙氨酸产品分析：透光率达98%以上（c=5，水），比旋光度[ɑ]_D ²⁰介于+14.5º~ +15.0º之间（c=10，5 N HCl）。

上述酶活测定：Warburg呼吸仪主室：2 mL 10 mmol/L的L-Asp溶液和1mL 1 mol/L的醋酸缓冲溶液（pH 5.5），Warburg呼吸仪侧室：0.5 mL发酵液，50 ℃平衡10 min，倒入发酵液，测定10 min内释放的二氧化碳微升数V。

酶活力计算：

X=V/[0.5×(10/60)]

V为反应10 min内释放的二氧化碳微升数；

0.5为发酵液体积，单位mL

10/60为反应时间10 min换算为h

酶活力定义：50 ℃，pH 5.5时，每毫升发酵液每小时从L-Asp中脱羧释放1μL二氧化碳的酶量定义为一个活力单位，以U表示。

转化液吸光度（OD）测定：分光光度法，纯水作参比，10 mm光程，波长550 nm。

上述脱色率（%）= [脱色前转化液的吸光度-脱色后转化液的吸光度]/ 脱色前转化液的吸光度×100%

上述L-丙氨酸检测：U3000高效液相色谱仪，C18 ODS-BP 5μm分析柱；流动相：0.29g/L KH₂PO₄-H₃PO₄缓冲液（pH 2.9）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；波长：214nm；进样量：20 μL。

本发明的有益效果：本发明通过添加合适的细胞通透剂和酶稳定剂，增加了菌体细胞透性和酶活稳定性，提高转化速率，L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活提高15%~20%，达到55000~70000 U。此外，通过优化重结晶工艺，提高了产品质量，L-丙氨酸纯度达99%以上，透光率达98%以上，比旋光度[

]₂₀ ^D介于+14.5º~ +15.0º之间。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，但不限于此。

实施例1：

（1）游离细胞培养液制备

取本单位一株睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株活化并进行高密度发酵培养，获得游离细胞培养液，测定酶活力为52300 U。取1 L游离细胞培养液进行后续酶转化反应。其中，斜面培养基组分为：谷氨酸钠12 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠7 g/L，硫酸镁1.2 g/L，磷酸二氢钾0.7 g/L，酵母膏7 g/L，牛肉膏3 g/L，琼脂20 g/L，调节pH7.0~7.2；摇瓶种子培养基：谷氨酸钠17 g/L，蛋白胨12 g/L，玉米浆干粉7 g/L，氢氧化钠8 g/L，七水硫酸镁0.35 g/L，磷酸氢二钾0.08 g/L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0；发酵培养基：蛋白胨15 g/L，玉米浆干粉5 g/L，谷氨酸钠15 g/L，氢氧化钠6 g/L，七水硫酸镁0.1 g/L，磷酸氢二钾0.15 g/L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。

（2）游离细胞培养液活化

向上述游离细胞培养液中加入细胞通透剂，细胞通透剂为EDTA和吐温-80。EDTA的加入量为1.0%，吐温-80的加入量为0.1%，然后加入L--天冬氨酸-β-脱羧酶稳定剂，稳定剂为磷酸吡哆醛，加入量为0.6 mM。调整pH为6.0，测定酶活力为62460 U。

（3）酶转化反应

直接向步骤（2）游离细胞培养液中添加固体L-天冬氨酸，采用pH自动控制加液系统，在线监控反应pH值，通过PID控制器自动补加L-天冬氨酸，严格控转化液 pH在5.5-6.0之间，进行酶转化反应。L-丙氨酸的等电点pI=6.02，在整个酶转化过程中L-丙氨酸晶体不断析出，本工艺最终L-天冬氨酸转化率可达410%。

（4）脱色

将步骤（3）获得的转化液过滤收集粗晶体，用去离子水溶解，调整pH 5.0、温度53℃、L-丙氨酸浓度为17%，加入量为0.9% ZX-303活性炭脱色25 min，脱色率可达84.0%。

（5）重结晶

将经净化处理的L-丙氨酸溶液pH调整至6.0，进行真空蒸发结晶，温度60 ℃，真空度-0.07 MPa。将获得的L-丙氨酸晶体，离心，干燥得到成品L-丙氨酸，纯度达99.9%。

本实施方式得到的L-天冬氨酸产品分析：透光率达98.5%，比旋光度[ɑ]₂₀ ^D为+14.7º。

实施例2

实施例2与实施例1相比，EDTA的加入量为0.5%，其他条件不变。

实施例3

实施例3与实施例1相比，EDTA的加入量为1.5%，其他条件不变。

实施例4

实施例4与实施例1相比，EDTA的加入量为0.2%，其他条件不变。

实施例5

实施例5与实施例1相比，EDTA的加入量为1.8%，其他条件不变。

酶转化结果如表1所示。

表1 酶转化结果

分析原因：由表1结果可知，随着EDTA的加入量的增加，转化率呈现先增高后降低的趋势，这是因为EDTA的加入，将脂类从细胞壁中溶解，从而使细胞壁疏松，增加细胞壁的通透性。但是EDTA的加入量的过度增加使得EDTA和酶的活性中心的金属离子形成络合物，导致酶的活性降低。

实施例6：

（1）游离细胞培养液制备

取本单位一株睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株活化并进行高密度发酵培养，获得游离细胞培养液，测定酶活力为54875 U。取1 L游离细胞培养液进行后续酶转化反应。其中，斜面培养基组分为：谷氨酸钠12 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化钠7 g/L，硫酸镁1.2 g/L，磷酸二氢钾0.7 g/L，酵母膏7 g/L，牛肉膏3 g/L，琼脂20 g/L，调节pH7.0~7.2；摇瓶种子培养基：谷氨酸钠17 g/L，蛋白胨12 g/L，玉米浆干粉7 g/L，氢氧化钠8 g/L，七水硫酸镁0.35 g/L，磷酸氢二钾0.08 g/L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0；发酵培养基：蛋白胨15 g/L，玉米浆干粉5 g/L，谷氨酸钠15 g/L，氢氧化钠6 g/L，七水硫酸镁0.1 g/L，磷酸氢二钾0.15 g/L，用氢氧化钠溶液调节pH至7.0。

（2）游离细胞培养液活化

向上述游离细胞培养液中加入细胞通透剂，细胞通透剂为EDTA和吐温-80。然后加入L--天冬氨酸-β-脱羧酶稳定剂，稳定剂为磷酸吡哆醛。调整pH为6.0，测定酶活力为65850U；EDTA的加入量为1.0%，吐温-80的加入量为0.15%，磷酸吡哆醛的加入量为0.6 mM；

（3）酶转化反应

直接向步骤（2）游离细胞培养液中添加固体L-天冬氨酸，采用pH自动控制加液系统，在线监控反应pH值，通过PID控制器自动补加L-天冬氨酸，严格控转化液 pH在5.5-6.0之间，进行酶转化反应。L-丙氨酸的等电点pI=6.02，在整个酶转化过程中L-丙氨酸晶体不断析出，本工艺最终L-天冬氨酸转化率可达420%。

（4）脱色

将步骤（3）获得的转化液过滤收集粗晶体，用去离子水溶解，调整pH 4.8、温度55℃、L-丙氨酸浓度为18%，加入量为0.8% ZX-303活性炭脱色23 min，脱色率可达83.0%。

（5）重结晶

将经净化处理的L-丙氨酸溶液pH调整至6.0，进行真空蒸发结晶，温度65 ℃，真空度-0.08 MPa。将获得的L-丙氨酸晶体，离心，干燥得到成品L-丙氨酸，纯度达99.6%。

本实施方式得到的L-天冬氨酸产品分析：透光率达98.8%，比旋光度[

]₂₀ ^D为+15.0º。

实施例7

实施例7与实施例6相比，吐温-80的加入量为0.05%，其他条件不变。

实施例8

实施例8与实施例6相比，吐温-80的加入量为0.1%，其他条件不变。

实施例9

实施例9与实施例6相比，吐温-80的加入量为0.2%，其他条件不变。

实施例10

实施例10与实施例6相比，吐温-80的加入量为0.02%，其他条件不变。

实施例11

实施例11与实施例6相比，吐温-80的加入量为0.25%，其他条件不变。

酶转化结果如表2所示。

表2 酶转化结果

分析原因：由表2结果可知，实施例6-11因吐温-80加入量的不同，L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活和L-天冬氨酸转化率不同。随着吐温-80的加入量的增加，转化率呈现先增高后降低的趋势，这是因为吐温-80游离态易溶于水，吐温-80的加入会导致形成异常的细胞质膜结构，膜磷脂含量降低，使细胞膜的通透性得以改善，增大了细胞膜的通透力，有利于打破胞内酶合成的动力平衡，从而影响酶的分泌；另一方面，亦可改善通气效果，它们作用于有限的位置，促进酶在此较快释放。但是加入量过多会导致细胞的破坏，进而使得转化率降低。

实施例12

实施例12与实施例6相比，磷酸吡哆醛的浓度为0.1mM，其他条件不变。

实施例13

实施例13与实施例6相比，磷酸吡哆醛的浓度为1.0mM，其他条件不变。

实施例14

实施例14与实施例6相比，磷酸吡哆醛的浓度为1.5mM，其他条件不变。

酶转化结果如表3所示。

表3 酶转化结果

分析原因：由表3结果可知，随着磷酸吡哆醛的加入量增加，得到的转化率也相应增加，但是一般不超过1.0mM。但是磷酸吡哆醛加入量过度增加，成本较高，且酶催化效率不再提高。

对照例1：与实施例1相比，省略EDTA、吐温-80和磷酸吡哆醛，其他条件不变。

对照例2：与实施例1相比，省略EDTA和吐温-80，其他条件不变。

对照例3：与实施例1相比，吐温-60替代EDTA和吐温-80，其他条件不变。

对照例4：与实施例1相比，聚乙二醇替代EDTA和吐温-80，其他条件不变。

对照例5：与实施例1相比，仅省略磷酸吡哆醛，其他条件不变。

酶转化结果如表4所示。

表4酶转化结果

分析原因：由表4可知，对照例缺少EDTA、吐温-80和（或）磷酸吡哆醛均会降低酶活力和转化率，而实施例1中EDTA和吐温-80的加入可以增加菌体细胞透性，加速底物和产物的传质速度，提高转化效率。磷酸吡哆醛作为L-天冬氨酸-β-脱羧酶的辅酶，直接参与催化反应，可以增加菌体细胞的酶活稳定性，延长活性细胞的转化周期，提高单位菌体细胞的转化得率，从而实现L-丙氨酸的高效酶转化。

实施例15

实施例15与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，温度为50，其他条件不变。

实施例16

实施例16与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，温度为70，其他条件不变。

实施例17

实施例17与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，真空度为-0.05，其他条件不变。

实施例18

实施例18与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，真空度为-0.06，其他条件不变。

实施例19

实施例19与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，真空度为-0.08，其他条件不变。

产品纯度结果如表5所示。

表5产品纯度

由表5可知，实施例1和实施例15-19因重结晶温度、真空度不同导致L-丙氨酸纯度不同。

对照例6：与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，pH为9.0，其他条件不变。

对照例7：与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，温度为80，其他条件不变。

对照例8：与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，温度为40，其他条件不变。

对照例9：与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，真空度为-0.04，其他条件不变。

对照例10：与实施例1相比，重结晶的工艺条件和实施例1不同，真空度为-0.09，其他条件不变。

产品纯度结果如表6所示。

表6产品纯度

分析原因：由表6可知，对照例6重结晶pH过高，超出L-天冬氨酸-β-脱羧酶的最适pH范围，L-丙氨酸析出减少，包埋未转化的L-天冬氨酸，产品纯度降低。对照例7-8重结晶温度过高或过低，对照例9-10重结晶真空度过低或过高，均会导致杂质含量增加，L-丙氨酸纯度降低，产品质量不好。

Claims

1.一种L-丙氨酸高效酶转化及提取工艺，包括游离细胞法酶转化反应、脱色、重结晶等步骤，其特征在于：产L-天冬氨酸-β-脱羧酶的睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株发酵培养，以培养液作酶源，直接添加固体L-天冬氨酸，加入细胞通透剂EDTA和吐温-80，加入酶稳定剂磷酸吡哆醛，转化培养，L-天冬氨酸-β-脱羧酶酶活达到55000~70000 U，培养液经过脱色、重结晶、干燥得到成品L-丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的L-丙氨酸高效酶转化及提取工艺，其特征在于：具体操作步骤为：

（1）游离细胞培养液制备

取本单位一株睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株活化并进行高密度发酵培养，获得游离细胞培养液，测定酶活力为45000~58000 U，取1 L游离细胞培养液进行后续酶转化反应，所述睾丸酮丛毛单胞菌HY-08D菌株保藏编号为:CGMCC No.6083；

（2）游离细胞培养液活化

向上述游离细胞培养液中加入细胞通透剂，细胞通透剂为EDTA和吐温-80；

然后加入L--天冬氨酸-β-脱羧酶稳定剂，稳定剂为磷酸吡哆醛，调整pH为6.0，测定酶活力为55000~70000 U；

（3）酶转化反应

直接向步骤（2）游离细胞培养液中添加固体L-天冬氨酸，采用pH自动控制加液系统，在线监控反应pH值，通过PID控制器自动补加L-天冬氨酸，严格控转化液 pH在5.5-6.0之间，进行酶转化反应；L-丙氨酸的等电点pI=6.02，在整个酶转化过程中L-丙氨酸晶体不断析出，本工艺最终L-天冬氨酸转化率可达400~450%；

（4）脱色

将步骤（3）获得的转化液过滤收集粗晶体，用去离子水溶解，调整pH 4.5~5.0、温度50~55 ℃、L-丙氨酸浓度为15%~18%，加入质量分数为0.8~1.0% ZX-303活性炭脱色20~25 min，脱色率可达82.0%以上；

（5）重结晶

调整净化处理的L-丙氨酸溶液的pH，进行真空蒸发结晶，将获得的L-丙氨酸晶体，离心，干燥得到成品L-丙氨酸，纯度达99%以上。

3.根据权利要求1所述的L-丙氨酸高效酶转化及提取工艺，其特征在于：所述EDTA的加入量为0.5%~1.5%，吐温-80的加入量为0.05%~0.2%，所述磷酸吡哆醛的加入量为0.1~1.0mM。

4.根据权利要求1所述的L-丙氨酸高效酶转化及提取工艺，其特征在于：所述步骤5的重结晶的具体的工艺条件为净化处理的L-丙氨酸溶液的pH调整为6.0，温度50~70 ℃，真空度-0.05~0.08 MPa。