CN103387502A - 从l-丙氨酸发酵液中提取l-丙氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从L-丙氨酸发酵液中提取L-丙氨酸的方法,包括如下步骤:a)发酵结束后,发酵液经固液分离,得到含有L-丙氨酸的清液;b)用酸将清液pH调节至4.5-6.0,加入可溶的Fe2+盐使Fe2+离子的终浓度为7mmol/L-18mmol/L,加入清液体积0.15%-0.90%的H2O2,在此过程中缓慢升温至40℃-80℃,在该温度下进行搅拌;c)用碱调节pH至7.0-8.0,然后任选地进行固液分离得到清液;d)于50℃-80℃下加入0.1-0.3%的活性炭,在该温度下进行搅拌,经固液分离去除活性炭后得到脱色液,经减压蒸发浓缩后养晶、过滤、洗涤、干燥后,即得L-丙氨酸晶体。所得L-丙氨酸晶体的透光率大于90%。
Description
技术领域
本发明涉及一种从L-丙氨酸发酵液中提取L-丙氨酸的方法。
背景技术
L-丙氨酸是人体内的一种非必需氨基酸,目前其在医药、食品等行业有很多应用。在医药行业,L-丙氨酸是很多复合氨基酸注射液的主要成分之一,L-丙氨酸在治疗如肝病引起的蛋白质合成紊乱、糖尿病、急慢性肾功能衰竭以及对维持危急病人的营养、抢救患者的生命方面有积极的治疗作用,此外,L-丙氨酸还是合成维生素B6的重要原料;在食品行业中,L-丙氨酸作为一种营养附剂以及一种人工甜味剂,不仅可以提高食品及饮料中的蛋白质利用率,还可以改善很多人工甜味剂的味感,使甜度增效。目前L-丙氨酸生产的主要方法包括以L-天冬氨酸为底物的酶转化法以及以葡萄糖为原料的厌氧微生物发酵法等。厌氧微生物发酵法由于其原料廉价、培养基成分简单、能耗低等优点,较酶法成本更加低廉,但由于微生物发酵过程中会产生其他的代谢产物如色素、有机酸,大分子多糖与蛋白等,因此其提取过程较酶法更加复杂。目前已有报道的微生物法发酵生产L-丙氨酸的提取方法采用膜法去除菌体和一些大分子物质,再经离子交换树脂以及活性炭脱色后,减压浓缩结晶生产L-丙氨酸。采用此方法提取L-丙氨酸,步骤较为繁琐,离子交换树脂在使用后需要用酸、碱以及盐进行再生处理,不仅成本较高,而且有一定的环境污染。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明采用一种化学方法对发酵液清液进行脱色处理,处理后的溶液再经活性炭脱色,减压浓缩后结晶,可以生产L-丙氨酸,透光率在90%以上,结晶母液多次回收套用后收率可达94%以上,较原有方法操作步骤更加简便、成本更低。此外,该方法还可以处理代谢异常的发酵料液以及多次浓缩结晶后的母液,从中回收提取残余的L-丙氨酸,不仅提高了收率而且减少了污水排放,更加环保。
因此本发明的目的在于提供一种从L-丙氨酸发酵液中提取L-丙氨酸的方法,包括如下步骤:
a)发酵结束后,发酵液经固液分离,得到含有L-丙氨酸的清液;
b)用酸将清液pH调节至4.5-6.0,加入可溶的Fe2+盐使Fe2+离子的终浓度为7mmol/L-18mmol/L,加入清液体积0.15%-0.90%的H2O2,在此过程中缓慢升温至40℃-80℃,在该温度下进行搅拌;
c)用碱调节pH至7.0-8.0,然后任选地进行固液分离得到清液;
d)于50℃-80℃下加入0.1-0.3%的活性炭,在该温度下进行搅拌,经固液分离去除活性炭后得到脱色液,经减压蒸发浓缩后养晶、过滤、洗涤、干燥后,即得L-丙氨酸晶体。
丙氨酸的发酵方法如文献报道(Xueli Zhang Kaemwich Jantama,Moore J C,et.al Production of L-alanine by metabolically engineeredEscherichia coli[J].Appl Microbiol Biotehnol,2007,77:355-366.中国专利201110235159.8,一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株及构建方法与应用),对重组大肠杆菌escherichia coli XZ-A26进行厌氧发酵培养。
根据本发明一个优选的实施方式,步骤b)中所述酸选自硫酸。
根据本发明一个优选的实施方式,步骤a)中所述固液分离过程采用超滤膜过滤发酵液来进行。所述超滤膜的截留分子量为50000道尔顿至400000道尔顿。
根据本发明一个优选的实施方式,步骤b)中加入可溶的Fe2+盐使Fe2+离子的浓度为10.8mmol/L。
根据本发明一个优选的实施方式,步骤b)中所述清液的pH调节至5.0。
根据本发明一个优选的实施方式,步骤b)中所述搅拌持续至少2小时,优选至少3小时。
根据本发明一个优选的实施方式,步骤b)中所述碱选自NaOH。
根据本发明一个优选的实施方式,步骤d)中所述搅拌持续至少1小时。
根据本发明一个优选的实施方式,步骤a)中所述固液分离过程通过抽滤进行。
为了减少提取过程中的损失,还可以把单批结晶母液以及洗涤晶体的洗液加入至下一批次的发酵液中回收套用,经多次套用后(总浓缩倍数可达60倍以上),L-丙氨酸的平均收率可达94%。
为了使提取过程更加的简便,可以将化学处理过程与活性炭脱色过程联用,例如在H2O2处理发酵滤液3小时后,用碱液调节pH至7.0-8.0,直接加入活性炭,并且缓慢升温至80℃,维持温度与搅拌1小时后,再经固液分离后得到脱色清液。清液经减压蒸发浓缩后搅拌养晶,过滤、洗涤、干燥后,即可得到白色L-丙氨酸晶体,透光率大于90%。
在L-丙氨酸发酵过程中,有可能会因为染入其它杂菌以及发酵过程控制不当等原因而导致发酵代谢异常,表现为发酵液中L-丙氨酸产量降低,并且伴随着发酵液性质的改变,如颜色加深、粘度变大、离子增加、产其他小分子有机酸等现象,最终导致提取出的L-丙氨酸晶体颜色过深,透光率较低。此外,代谢正常的发酵液经反复浓缩后的母液,由于杂质的富集,以及加热浓缩过程中大分子物质发生复杂的化学反应而导致颜色变深、粘度提高、澄清度变低,很难继续重复利用,目前只能排放掉。本发明方法对上述代谢异常的发酵料液以及多次浓缩结晶的母液也具有较好的处理效果,通过本方法处理后的料液仍可以通过减压浓缩结晶得到透光率大于90%的L-丙氨酸产品。
多次浓缩结晶后的母液,用水稀释1~3倍后,可通过本发明方法进行操作,即可得到白色L-丙氨酸晶体,透光率大于90%。收率可达50%以上。
通过本发明方法得到的L-丙氨酸透光率检测方法:取产品1.0g,加水20ml溶解后,用紫外-可见分光光度计于430nm波长处测定透光率。
附图说明
图1为本发明方法的流程图。
具体实施方式
发酵液的制备:发酵液的制备方法如文献报道的方法Xueli ZhangKaemwich Jantama,Moore J C,et.al Production of L-alanine bymetabolically engineered Eschierichia coli[J].Appl Microbiol Biotehnol,2007,77:355-366;
以及中国专利201110235159.8,一种高产L-丙氨酸的XZ-A26菌株及构建方法与应用。具体方法如下:
菌种:XZ-A26菌种保藏号(CGMCC No.4036)
种子培养基与发酵培养基组成:葡萄糖120g/L,氯化铵5g/L,NaH2PO45g/L,Na2HPO45g/L,MgSO4·7H2O 1g/L,CaCl222H2O 0.1g/L,微量无机盐5ml/L,培养基pH 6.5。
微量无机盐组成:FeCl3·6H2O 1.5mg,CoCl2·6H2O 0.1mg,CuCl2·2H2O0.1mg,ZnCl20.1mg,Na2MoO4·2H2O 0.1mg,MnCl2·4H2O 20.2mg,蒸馏水定容至1L,过滤除菌。
用三角瓶配置种子培养基,121℃灭菌15min后,接入XZ-A26,30℃下培养18小时。
15L发酵罐培养基体积12L,121℃灭菌15min后,接种量0.1%(V∶V),发酵温度30℃,搅拌转速100rpm。用氨水控制pH 6.5,发酵时间48小时。
实施例1
发酵液1.5L,L-丙氨酸浓度78.7mg/ml,过400000分子量超滤膜后得到发酵液清液,用H2SO4调节清液pH至5.0,加入FeSO4·7H2O 4.5g,搅拌溶解后,维持搅拌,滴加30%的H2O210ml,并缓慢升温至50℃,维持温度与搅拌3h,用NaOH溶液调节pH至7.0,用硅藻土助滤,抽滤反应液并用水顶洗,得到清液;清液加入活性炭5g,搅拌并升温至80℃,维持1h,抽滤去除活性炭得到脱色清液,清液于70℃下,减压浓缩至70ml,浓缩液搅拌结晶8h后,抽滤得晶体,用去离子水洗涤2次,80℃下干燥1h,得到100.3g L-丙氨酸晶体,纯度99.3%,结晶母液与晶体洗液合并共135ml,L-丙氨酸浓度为133mg/ml。收率84.4%。透光率95.9%。
实施例2
发酵液1.5L,L-丙氨酸浓度78.7mg/ml,加入实施例1的结晶母液与晶体洗液合并液,过100000分子量超滤膜后得到发酵液清液,用H2SO4调节清液pH至5.0,加入FeSO4·7H2O 4.5g,搅拌溶解后,维持搅拌,滴加30%的H2O215ml,并缓慢升温至50℃,维持温度与搅拌3h,用NaOH溶液调节pH至7.0,用硅藻土助滤,抽滤反应液并用水顶洗,得到清液;清液加入活性炭5.3g,搅拌并升温至80℃,维持1h,抽滤去除活性炭得到脱色清液,清液于70℃下,减压浓缩至63ml,浓缩液搅拌结晶8h后,抽滤得晶体,用去离子水洗涤2次,80℃下干燥1h,得到125.0g L-丙氨酸晶体,纯度99.1%。结晶母液与晶体洗液合并共102ml,L-丙氨酸浓度为114mg/ml。收率91.1%。透光率94.7%
实施例3
发酵液1.5L,L-丙氨酸浓度78.7mg/ml,加入实施例2的结晶母液与晶体洗液合并液,过100000分子量超滤膜后得到发酵液清液,用H2SO4调节清液pH至5.0,加入FeSO4·7H2O 4.5g,搅拌溶解后,维持搅拌,滴加30%的H2O215ml,并缓慢升温至50℃,维持温度与搅拌3h,用NaOH溶液调节pH至7.0,用硅藻土助滤,抽滤反应液并用水顶洗,得到清液;清液加入活性炭4.5g,搅拌并升温至80℃,维持1h,抽滤去除活性炭得到脱色清液,清液于70℃下,减压浓缩至71ml,浓缩液搅拌结晶8h后,抽滤得晶体,用去离子水洗涤2次,80℃下干燥1h,得到111.4g L-丙氨酸晶体,纯度99.0%。结晶母液与晶体洗液合并共150ml,L-丙氨酸浓度为116mg/ml。收率85.0%。透光率96.0%。
实施例1~实施例3共计4.5L发酵液,L-丙氨酸共354.0g,经处理纯化后得到L-丙氨酸产品共336.7g,平均收率为94.3%,三次结晶后母液71ml,总浓缩倍数为63.4倍。
实施例4(一锅法)
发酵液1.0L,L-丙氨酸浓度79.0mg/ml,过50000分子量超滤膜后得到发酵液清液,用H2SO4调节清液pH至5.0,加入FeSO4·7H2O 3.0g,搅拌溶解后,维持搅拌,滴加30%的H2O210ml,并缓慢升温至50℃,维持温度与搅拌3h,用NaOH溶液调节pH至7.0,然后加入活性炭3.0g,搅拌并升温至80℃,维持1h,抽滤去除活性炭并用水顶洗得到脱色清液,清液于70℃下,减压浓缩至48ml,浓缩液搅拌结晶8h后,抽滤得晶体,用去离子水洗涤2次,80℃下干燥1h,得到68.7g L-丙氨酸晶体,纯度99.0%。结晶母液与晶体洗液合并共75ml,L-丙氨酸浓度为133mg/ml。收率为86.1%。透光率98.2%。
实施例5:多次浓缩结晶后的母液的处理
多次浓缩结晶后的母液(L-丙氨酸浓度约为97mg/ml,棕黑色,粘稠),1.0L,用去离子水稀释1倍后,用H2SO4溶液调节pH至5.0,加入40gFeSO4.7H2O,待其溶解后,滴加30%的H2O2120ml,在此过程中缓慢升温至60℃,维持温度与搅拌3小时,用NaOH溶液调节pH至7.0,离心得到清液,清液加入10g活性炭,升温至80℃,维持温度与搅拌1小时,抽滤去除活性炭后得到脱色液,脱色液于70℃下减压浓缩至300ml,浓缩液搅拌结晶8h后,离心得到晶体,用L-丙氨酸饱和溶液洗涤2次,于80℃下干燥1小时,得到50.4g L-丙氨酸晶体,纯度98.5%。收率51.2%。透光率90.1%。
实施例6:发酵异常的发酵液的处理
发酵异常的发酵液3.0L(在发酵过程中染球菌),L-丙氨酸浓度34.0mg/ml,抽滤去除菌体后得到发酵液清液,用H2SO4调节清液pH至5.0,加入FeSO4·7H2O 9.0g,搅拌溶解后,维持搅拌,滴加30%的H2O230ml,并缓慢升温至50℃,维持温度与搅拌3h,用NaOH溶液调节pH至7.0,用硅藻土助滤,抽滤反应液并用水顶洗,得到清液;清液加入活性炭9.0g,搅拌并升温至80℃,维持1h,抽滤去除活性炭得到脱色清液,清液于70℃下,减压浓缩至450ml,浓缩液搅拌结晶8h后,抽滤得晶体,用L-丙氨酸饱和溶液洗涤2次,80℃下干燥1h,得到54.9g L-丙氨酸晶体,纯度98.6%。收率53.1%。透光率90.2%
实施例7
其它如实施例1,仅将发酵清液的pH用HCl溶液调节至4.5,得到80.8g L-丙氨酸晶体,纯度99.3%。结晶母液与晶体洗液合并共98ml,L-丙氨酸浓度为115mg/ml。收率68.0%。透光率96.2%。
实施例8
其它如实施例1,不同之处在于将发酵清液的pH用HCl溶液调节至6.0,得到95.7g L-丙氨酸晶体,纯度98.6%。结晶母液与晶体洗液合并共180ml,L-丙氨酸浓度为129mg/ml。收率80.0%。透光率93.4%。
实施例9
其他如实施例1,不同之处在于加入FeSO4·7H2O 3.0g,得到95.4g L-丙氨酸晶体,纯度98.6%。结晶母液与晶体洗液合并共170ml,L-丙氨酸浓度为119mg/ml。收率为79.7%。透光率92.7%。
实施例10
其他如实施例1,不同之处在于加入FeSO4·7H2O 7.5g,得到87.8g L-丙氨酸晶体,纯度98.9%。结晶母液与晶体洗液合并共112ml,L-丙氨酸浓度为119mg/ml。收率为73.6%。透光率97.7%
实施例11
其他如实施例1,不同之处在于加入30%H2O27.5ml,得到94.4g L-丙氨酸晶体,纯度98.5%。结晶母液与晶体洗液合并共205ml,L-丙氨酸浓度为121mg/ml。收率为78.8%。透光率92.9%。
实施例12
其他如实施例1,不同之处在于加入30%H2O245ml,得到80.3g L-丙氨酸晶体,纯度99.0%。结晶母液与晶体洗液合并共105ml,L-丙氨酸浓度为114mg/ml。收率为67.4%。透光率97.8%。
实施例13
其他如实施例1,不同之处在于加入H2O2后,缓慢升温至30℃,得到96.4g L-丙氨酸晶体,纯度98.5%。结晶母液与晶体洗液合并共185ml,L-丙氨酸浓度为121mg/ml。收率为80.5%。透光率91.5%。
实施例14
其他如实施例1,不同之处在于加入H2O2后,缓慢升温至80℃,得到91.2g L-丙氨酸晶体,纯度98.8%。结晶母液与晶体洗液合并共99ml,L-丙氨酸浓度为121mg/ml。收率为76.4%。透光率92.7%。
实施例15
其他如实施例1,不同之处在于,加入H2O2并升温后,维持温度与搅拌2h,得到97.9g L-丙氨酸晶体,纯度98.8%。结晶母液与晶体洗液合并共196ml,L-丙氨酸浓度为103mg/ml。收率为82.0%。透光率94.3%。
实施例16
其他如实施例1,不同之处在于加入FeCl2·4H2O 3.2g,得到99.8g L-丙氨酸晶体,纯度99.3%。结晶母液与晶体洗液合并共145ml,L-丙氨酸浓度为124mg/ml。收率为84.0%。透光率96.0%。
实施例17
其他如实施例1,不同之处在于加入FeNO31.9g,得到99.8g L-丙氨酸晶体,纯度99.4%。结晶母液与晶体洗液合并共152ml,L-丙氨酸浓度为118mg/ml。收率为84.1%。透光率95.8%。
Claims (11)
1.从L-丙氨酸发酵液中提取L-丙氨酸的方法,包括如下步骤:
a)发酵结束后,发酵液经固液分离,得到含有L-丙氨酸的清液;
b)用酸将清液pH调节至4.5-6.0,加入可溶的Fe2+盐使Fe2+离子的终浓度为7mmol/L-18mmol/L,加入清液体积0.15%-0.90%的H2O2,在此过程中缓慢升温至40℃-80℃,在该温度下进行搅拌;
c)用碱调节pH至7.0-8.0,然后任选地进行固液分离得到清液;
d)于50℃-80℃下加入0.1-0.3%的活性炭,在该温度下进行搅拌,经固液分离去除活性炭后得到脱色液,经减压蒸发浓缩后养晶、过滤、洗涤、干燥后,即得L-丙氨酸晶体。
2.如权利要求1所述的方法,其中步骤a)中所述固液分离过程采用超滤膜过滤发酵液来进行。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述超滤膜的截留分子量为50000道尔顿至400000道尔顿。
4.如权利要求1所述的方法,其中步骤b)中所述酸为盐酸或硫酸。
5.如权利要求1所述的方法,其中步骤b)中所述Fe2+离子的浓度为10.8mmol/L。
6.如权利要求1所述的方法,其中步骤b)中所述清液的pH调节至5.0。
7.如权利要求1所述的方法,其中步骤b)中所述搅拌持续至少2小时,优选至少3小时。
8.如权利要求1所述的方法,其中步骤c)中所述碱选自氢氧化钠。
9.如权利要求1所述的方法,其中步骤d)中所述搅拌持续至少1小时。
10.如权利要求1所述的方法,其中步骤d)中所述固液分离过程通过抽滤进行。
11.如权利要求1所述的方法,其中将单批结晶母液以及洗涤晶体的洗液加入至下一批的发酵液中回收套用。
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