CN111039861A - 一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括制备发酵培养基、在培养基中测定3‑氰基吡啶水合酶活力、测定培养基中的生物量、烟酰胺的生物催化反应，以及催化反应后的菌种的保存，通过对固定化细胞生物转化生产烟酰胺的研究，固定化细胞重复利用次数从3次提高到6‑7次，转化率达99.6％，而且，通过对烟酰胺的提取工艺的改进，使其结晶收率达88.6％，总提取收率88.5％，本发明以3‑氰基吡啶为底物，马红球菌为催化菌种，得到具有生产工艺简单，催化过程稳定易控制的微生物法合成烟酰胺方法，解决了传统生物法间歇生产工艺，操作条件复杂不易控制的问题。
Description
技术领域
本发明涉及生物化工技术领域，具体为一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺。
背景技术
烟酰胺是一种水溶性的维生素B3的衍生物，在生物氧化呼吸链中起着传递氢原子的作用，可以促进生物氧化和组织的新陈代谢，对维持皮肤、消化道和神经系统的完整性具有重要作用。此外，烟酰胺可作为饲料中的添加剂、医药中间体和在食品中作为营养强化剂来预防糙皮病和心血管疾病，当今社会十分重要的一种食品添加剂。
目前，烟酰胺合成工艺主要分为三步：1)环化将链式有机物分子环化成一个含有甲基的吡啶环；2)甲基氧化将含有甲基的吡啶环上的甲基氧化为氰基，得氰基吡啶；3)将3-氰基吡啶上的氰基水解为酰胺基，其中第三步3-氰基吡啶水解主要有化学法和微生化法，此外3-氰基吡啶也有用氨水在加压的条件下进行水解也能得到烟酰胺。但传统的化学法高温高压，能耗较大，且在分离提取的时候需要溶剂类的萃取剂介入，在后续的分离过程有溶剂残留的影响。
生物法是用氰基吡啶在菌种的存在下，进行反应得到烟酰胺，微生物法虽然产品纯度高，但为间歇生产工艺且操作条件复杂不易控制，从而影响反应和产品质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，以3-氰基吡啶为底物，马红球菌为催化菌种，得到具有生产工艺简单，催化过程稳定易控制的微生物法合成烟酰胺方法，以解决上述背景技术中提出的传统生物法间歇生产工艺，操作条件复杂不易控制的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括以下步骤：
S1：制备发酵培养基：包括以下含量的原料配比：葡萄糖3g/l，酵母膏1g/l，MgSO40.05g/l，尿素0.1g/l，KH2PO40.05g/l，K2HPO40.05g/l，添加物L-半胱氨酸4g/L，L-谷氨酸3g/L，苯丙氨酸3g/L，VBr-HC10.5g/L，烟酸0.5g/L，肌醇1g/L；
S2：在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力:定量吸取培养液离心，取细胞并悬浮于2.5mol/L的磷酸缓冲液中，加入2.5ml、0.4mol/L的3-氰基吡啶，混匀，于25℃振荡反应20分钟，以0.1ml、3mo1/LHCl终止反应，离心后用HPLC法测定反应清液中烟酰胺的生成量；
S3：测定培养基中的生物量：在721分光光度计460nm处、1.0cm光径测定稀释20倍的细胞培养液的生物量，再以同样稀释度的培养基为对照，并校正为干细胞重；
S4：烟酰胺的生物催化：将筛选、优化后的马红球菌接入发酵罐进行发酵培养，得到含3-氰基吡啶水合酶的发酵液，并将发酵液在一定的低温下离心得细胞体，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的悬浮液，在一定的温度下，分批加入底物烟腈，分批催化转化，并用HPLC测烟腈、烟酰胺的含量，当底物烟腈浓度低于0.1％时终止酶催化转化，转化液经高速离心去掉细胞体，得含烟酰胺溶液，再在一定温度下加入一定量的活性碳脱色，过滤，再浓缩后得含烟酰胺的浓缩液，再在一定的低温下冷却结晶得湿烟酰胺。
更进一步地，S2中磷酸缓冲液的pH＝7.5。
更进一步地，在S2的反应条件下，1分钟内催化水合3-氰基吡啶生成1.0μmol烟酰胺所需的酶量定义为3-氰基吡啶水合酶的一个活力单位U。
更进一步地，S2中烟酰胺水解酶活力:除以0.4mol/L烟酰胺溶液作底物及测定烟酸生成量外，其他测定条件同3-氰基吡啶水合酶活力的测定，在1分钟内催化水解烟酰胺生成1.0μmol烟酸所需的酶量定义为烟酰胺水解酶的一个活力单位。
更进一步地，S4中为了能够更好的使含烟腈水合酶转化烟腈生产烟酰胺，还提供如下步骤：
S401：先离心得固定化细胞，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的细胞悬浮液，按比例加入一定量的海藻酸钠，经搅拌混匀后得粘稠状液体；
S402：用注射器将粘稠状液体注入含一定量的CaCl2水溶液中得小球状的固定化细胞颗粒，将细胞颗粒在一定的低温下硬化10多小时，过滤后得生产用的能转化底物烟腈的固定化细胞；
S403：在10℃温度下，往含固定化细胞的液体中分批加入底物烟腈，固定化细胞将烟腈生物催化成烟酰胺；
S404：用HPLC法测烟腈、烟酰胺的含量，当烟腈含量低于0.1％时终止生物催化，将转化液过滤后得含烟酰胺溶液，再经冷却结晶得成品。
更进一步地，S4中湿烟酰胺具体提取方法为：将转化液放入烧杯中，外加冰浴锅冷却，开启搅拌并缓慢冷却，当温度降到12-13℃时加入适量晶种并继续缓慢冷却，温度逐渐降到-3℃时，溶液慢慢变混浊直至析出大量晶体使溶液变得粘稠，中途析出大量烟酰胺可先过滤得湿烟酰胺，母液进一步冷却结晶，随后停止搅拌，过滤得滤饼，将滤饼放烘箱于85℃烘干即可得成品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明提供的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括制备发酵培养基、在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力、测定培养基中的生物量、烟酰胺的生物催化反应，以及催化反应后的菌种的保存，通过对固定化细胞生物转化生产烟酰胺的研究，固定化细胞重复利用次数从3次提高到6-7次，转化率达99.6％，而且，通过对烟酰胺的提取工艺的改进，使其结晶收率达88.6％，总提取收率88.5％，本发明以3-氰基吡啶为底物，马红球菌为催化菌种，得到具有生产工艺简单，催化过程稳定易控制的微生物法合成烟酰胺方法，解决了传统生物法间歇生产工艺，操作条件复杂不易控制的问题。
附图说明
图1为本发明的工艺流程图；
图2为本发明的烟酰胺提取方法流程图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1，本发明实施例中：一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括以下步骤：
第一步：制备发酵培养基：包括以下含量的原料配比：葡萄糖3g/l，酵母膏1g/l，MgSO40.05g/l，尿素0.1g/l，KH2PO40.05g/l，K2HPO40.05g/l，添加物L-半胱氨酸4g/L，L-谷氨酸3g/L，苯丙氨酸3g/L，VBr-HC10.5g/L，烟酸0.5g/L，肌醇1g/L；。
第二步：在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力:定量吸取培养液离心，取细胞并悬浮于2.5mol/L的磷酸缓冲液中，加入2.5ml、0.4mol/L的3-氰基吡啶，混匀，于25℃振荡反应20分钟，以0.1ml、3mo1/LHCl终止反应，离心后用HPLC法测定反应清液中烟酰胺的生成量。
其中，磷酸缓冲液的pH＝7.5，在反应条件下，1分钟内催化水合3-氰基吡啶生成1.0μmol烟酰胺所需的酶量定义为3-氰基吡啶水合酶的一个活力单位(U)；烟酰胺水解酶活力:除以0.4mol/L烟酰胺溶液作底物及测定烟酸生成量外，其他测定条件同3-氰基吡啶水合酶活力的测定，在1分钟内催化水解烟酰胺生成1.0μmol烟酸所需的酶量定义为烟酰胺水解酶的一个活力单位。
第三步：测定培养基中的生物量：在721分光光度计460nm处、1.0cm光径测定稀释20倍的细胞培养液的生物量，再以同样稀释度的培养基为对照，并校正为干细胞重。
第四步：烟酰胺的生物催化：将筛选、优化后的马红球菌接入发酵罐进行发酵培养，得到含3-氰基吡啶水合酶的发酵液，并将发酵液在一定的低温下离心得细胞体，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的悬浮液，在一定的温度下，分批加入底物烟腈，分批催化转化，并用HPLC测烟腈、烟酰胺的含量，当底物烟腈浓度低于0.1％时终止酶催化转化，转化液经高速离心去掉细胞体，得含烟酰胺溶液，再在一定温度下加入一定量的活性碳脱色，过滤，再浓缩后得含烟酰胺的浓缩液，再在一定的低温下冷却结晶得湿烟酰胺。
其中，为了能够更好的使含烟腈水合酶转化烟腈生产烟酰胺，还提供如下步骤：
S401：先离心得固定化细胞，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的细胞悬浮液，按比例加入一定量的海藻酸钠，经搅拌混匀后得粘稠状液体；
S402：用注射器将粘稠状液体注入含一定量的CaCl2水溶液中得小球状的固定化细胞颗粒，将细胞颗粒在一定的低温下硬化10多小时，过滤后得生产用的能转化底物烟腈的固定化细胞；
S403：在10℃温度下，往含固定化细胞的液体中分批加入底物烟腈，固定化细胞将烟腈生物催化成烟酰胺；
S404：用HPLC法测烟腈、烟酰胺的含量，当烟腈含量低于0.1％时终止生物催化，将转化液过滤后得含烟酰胺溶液，再经冷却结晶得成品。
上述固定化细胞转化后，所得的转化液后处理简单，无需高速离心机，也无需脱色，无需先浓缩，可直接冷却结晶得成品湿烟酰胺。
其中，湿烟酰胺具体提取方法为：将转化液放入烧杯中，外加冰浴锅冷却，开启搅拌并缓慢冷却，当温度降到12-13℃时加入适量晶种并继续缓慢冷却，温度逐渐降到-3℃时，溶液慢慢变混浊直至析出大量晶体使溶液变得粘稠，中途析出大量烟酰胺可先过滤得湿烟酰胺，母液进一步冷却结晶，随后停止搅拌，过滤得滤饼，将滤饼放烘箱于85℃烘干即可得成品。
为了进一步更好的解释说明上述发明中关于烟酰胺合成中的催化提取，还提供如下实验方法进行说明：
步骤一：对烟酰胺溶解度的测定：取两份蒸馏水，各100ml，控制不同的水温:20℃与-3℃，加入过量的烟酰胺标准品并充分搅拌30min，取该两份溶液经离心后得上清液，用HPLC法测定两份溶液中烟酰胺浓度，所得数据见下表1:
表1烟酰胺溶解度表
| 温度 | 溶解度g/ml |
| 20℃ | 80 |
| -3℃ | 26 |
步骤二：对成品烟酰胺的测定：滤饼经烘干后所得成品按GB7301-87进行全分析，再进行收率计算：
提取总收率＝所得成品质量(g)/转化液含烟酰胺质量(g)X100％
步骤三：提取方法：将一定量的转化液放入2000ml烧杯中，外加冰浴锅冷却，开启搅拌并缓慢冷却，当温度降到12-13℃时加入适量晶种并继续缓慢冷却，温度逐渐降到-3℃时溶液慢慢变混浊直至析出大量晶体使溶液变得粘稠(中途析出大量烟酰胺可先过滤得湿烟酰胺，母液进一步冷却结晶)，此时停止搅拌，过滤得滤饼，将滤饼放烘箱(85℃)烘干即可得成品烟酰胺；请参阅图2；
步骤四：结果分析：由于生物催化转化工艺控制得较好，转化液烟酰胺浓度在室温下达44.8％，已基本上处于饱和状态，不需经真空蒸发冷却法即可进行直接冷却析晶，为了提高晶体纯度并避免出现“晶簇”现象，结晶过程中开启搅拌，且当温度降到12-13℃时加入适量晶种，促使晶核形成并缓慢生长；所得烟酰胺晶体大，色泽好，转化液第-次冷却析晶过滤后，此时母液中仍含有较高的烟酰胺，母液可直接继续冷却(此时无需加晶种)得成品；二次母液中烟酰胺浓度为24.6％，需按溶解度特点先真空蒸发点一部分水分，使得溶液达到饱和状态再进行下一步的冷却析晶，第四次母液在大生产时可套用至下一批转化液中。
综上所述：本发明提供的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，包括制备发酵培养基、在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力、测定培养基中的生物量、烟酰胺的生物催化反应，以及催化反应后的菌种的保存，通过对固定化细胞生物转化生产烟酰胺的研究，固定化细胞重复利用次数从3次提高到6-7次，转化率达99.6％，而且，通过对烟酰胺的提取工艺的改进，使其结晶收率达88.6％，总提取收率88.5％，本发明以3-氰基吡啶为底物，马红球菌为催化菌种，得到具有生产工艺简单，催化过程稳定易控制的微生物法合成烟酰胺方法，解决了传统生物法间歇生产工艺，操作条件复杂不易控制的问题。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1：制备发酵培养基：包括以下含量的原料配比：葡萄糖3g/l，酵母膏1g/l，MgSO40.05g/l，尿素0.1g/l，KH2PO4 0.05g/l，K2HPO4 0.05g/l，添加物L-半胱氨酸4g/L，L-谷氨酸3g/L，苯丙氨酸3g/L，VBr-HC1 0.5g/L，烟酸0.5g/L，肌醇1g/L；
S2：在培养基中测定3-氰基吡啶水合酶活力:定量吸取培养液离心，取细胞并悬浮于2.5mol/L的磷酸缓冲液中，加入2.5ml、0.4mol/L的3-氰基吡啶，混匀，于25℃振荡反应20分钟，以0.1ml、3mo1/L HCl终止反应，离心后用HPLC法测定反应清液中烟酰胺的生成量；
S3：测定培养基中的生物量：在721分光光度计460nm处、1.0cm光径测定稀释20倍的细胞培养液的生物量，再以同样稀释度的培养基为对照，并校正为干细胞重；
S4：烟酰胺的生物催化：将筛选、优化后的马红球菌接入发酵罐进行发酵培养，得到含3-氰基吡啶水合酶的发酵液，并将发酵液在一定的低温下离心得细胞体，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的悬浮液，在一定的温度下，分批加入底物烟腈，分批催化转化，并用HPLC测烟腈、烟酰胺的含量，当底物烟腈浓度低于0.1％时终止酶催化转化，转化液经高速离心去掉细胞体，得含烟酰胺溶液，再在一定温度下加入一定量的活性碳脱色，过滤，再浓缩后得含烟酰胺的浓缩液，再在一定的低温下冷却结晶得湿烟酰胺。
2.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，S2中磷酸缓冲液的pH＝7.5。
3.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，在S2的反应条件下，1分钟内催化水合3-氰基吡啶生成1.0μmol烟酰胺所需的酶量定义为3-氰基吡啶水合酶的一个活力单位U。
4.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，S2中烟酰胺水解酶活力:除以0.4mol/L烟酰胺溶液作底物及测定烟酸生成量外，其他测定条件同3-氰基吡啶水合酶活力的测定，在1分钟内催化水解烟酰胺生成1.0μmol烟酸所需的酶量定义为烟酰胺水解酶的一个活力单位。
5.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，S4中为了能够更好的使含烟腈水合酶转化烟腈生产烟酰胺，还提供如下步骤：
S401：先离心得固定化细胞，再将细胞体用蒸馏水配成一定浓度的细胞悬浮液，按比例加入一定量的海藻酸钠，经搅拌混匀后得粘稠状液体；
S402：用注射器将粘稠状液体注入含一定量的CaCl2水溶液中得小球状的固定化细胞颗粒，将细胞颗粒在一定的低温下硬化10多小时，过滤后得生产用的能转化底物烟腈的固定化细胞；
S403：在10℃温度下，往含固定化细胞的液体中分批加入底物烟腈，固定化细胞将烟腈生物催化成烟酰胺；
S404：用HPLC法测烟腈、烟酰胺的含量，当烟腈含量低于0.1％时终止生物催化，将转化液过滤后得含烟酰胺溶液，再经冷却结晶得湿烟酰胺。
6.如权利要求1所述的一种含低烟酸副产物的烟酰胺合成催化工艺，其特征在于，S4中湿烟酰胺具体提取方法为：将转化液放入烧杯中，外加冰浴锅冷却，开启搅拌并缓慢冷却，当温度降到12-13℃时加入适量晶种并继续缓慢冷却，温度逐渐降到-3℃时，溶液慢慢变混浊直至析出大量晶体使溶液变得粘稠，中途析出大量烟酰胺可先过滤得湿烟酰胺，母液进一步冷却结晶，随后停止搅拌，过滤得滤饼，将滤饼放烘箱于85℃烘干即可得成品。
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